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1、动物细胞工程问题探讨问题探讨 “番茄马铃薯”（理想图）通过长期的实验，科学家们通过长期的实验，科学家们采用体细胞杂交技术获得了采用体细胞杂交技术获得了“番番茄茄马铃薯马铃薯”植株。植株。如果将奶牛的细胞与植物细胞杂交，得到绿色的小奶牛，那岂不是只要晒晒太阳就可以挤出牛奶吗？动物细胞也能融合吗？2.2.2 动物细胞融合与单克隆抗体一、动物细胞融合2.2.2 动物细胞融合与单克隆抗体一、动物细胞融合1.概念：概念：动物细胞融合（动物细胞融合（cell fusion）也成细胞杂）也成细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。胞的过程。融合和形成的
2、具有原来两个或多个细胞遗融合和形成的具有原来两个或多个细胞遗传物质的单核细胞，称为传物质的单核细胞，称为杂交细胞杂交细胞。思考题思考题1.植物体细胞杂交时首先应用什么方法去掉细胞壁？酶解法，如纤维素酶或果胶酶2.动物细胞融合时需要进行去壁处理吗？为什么？无需，因为动物细胞无细胞壁3.植物体细胞杂交诱导原生质体融合常用的方法有哪些？离心、电激等物理方法；PEG等化学方法4.动物细胞融合能利用上述两类方法吗？还有其他方法吗？能 还可以利用灭活的病毒进行诱导5.植物体细胞杂交应先进行原生质体的融合再进行组织培养形 成完整的杂种个体，动物细胞融合后能形成杂种动物个体吗？不能植物细胞杂交与动物细胞融合的
3、比较植物细胞杂交与动物细胞融合的比较比较项目比较项目植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物细胞融合动物细胞融合细胞融合原理细胞融合原理细胞融合方法细胞融合方法使用的酶使用的酶诱导方法诱导方法主要用途主要用途细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞的全能性细胞的全能性细胞膜的流动性细胞膜的流动性纤维素酶、果胶酶纤维素酶、果胶酶胰蛋白酶胰蛋白酶物理（离心、振荡、物理（离心、振荡、电刺激）电刺激）化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）物理、化学方物理、化学方法（同左）法（同左）灭活的病毒灭活的病毒获得杂种植株获得杂种植株制备单克隆抗体制备单克隆抗体去除细胞壁后诱去除细胞壁后诱导原生质体融合导原生质体融合使细胞分散后使细
4、胞分散后诱导细胞融合诱导细胞融合2.2.2 动物细胞融合与单克隆抗体一、动物细胞融合4.意义：意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。5.应用：应用：成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段；特别是利用杂交瘤技术制造单克隆抗体2.2.2 动物细胞融合与单克隆抗体二、单克隆抗体思考思考？1.1.抗体由何种细胞产生？抗体由何种细胞产生？2.2.抗体如何产生？抗体如何产生？3.3.用传统的方法如何获得抗体？用传统的方法如何获得抗体？抗原抗原 动物体内动物体内刺激刺激效应效应B细胞细胞 抗体抗体抗体不纯抗体不纯筛选单一的效应筛选单一的效应
5、B细胞细胞不能增殖产生大量抗体不能增殖产生大量抗体2.2.纯度低、产量低、特异性差纯度低、产量低、特异性差 ；注射抗原注射抗原 抗体抗体1.1.抗原抗原 B B淋巴细胞淋巴细胞刺激刺激分化分化效应效应B B细胞细胞分泌分泌1 1、设计方案：、设计方案：一个一个B B淋巴细胞淋巴细胞只分泌一种特异性抗体只分泌一种特异性抗体小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞能无限增殖能无限增殖化学性质单一、特异性强的抗体化学性质单一、特异性强的抗体杂交细胞杂交细胞2 2、制备过程：、制备过程：骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞免疫小鼠免疫小鼠免疫小鼠免疫小鼠单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体筛选筛选筛选筛选
6、克隆、筛选克隆、筛选克隆、筛选克隆、筛选体内培养体内培养体内培养体内培养体外培养体外培养体外培养体外培养B B B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞（选择培养基）（选择培养基）（选择培养基）（选择培养基）（抗体检测）（抗体检测）（抗体检测）（抗体检测）细胞融合细胞融合细胞融合细胞融合杂交细胞杂交细胞杂交细胞杂交细胞1、提取细胞并培养、提取细胞并培养2、细胞细胞融合融合B淋巴细胞的融合细胞淋巴细胞的融合细胞骨髓瘤细胞的融合细胞骨髓瘤细胞的融合细胞B淋巴细胞和瘤细胞融合的细胞淋巴细胞和瘤细胞融合的细胞3、获得的杂交细胞、获得的杂交细胞 （继承双亲的特点）（继承双亲的特点）检验和筛选检验和筛选4、
7、杂交细胞进行细胞培养、杂交细胞进行细胞培养5、得到化学性质单一的，针得到化学性质单一的，针对性强的抗体对性强的抗体培养基筛选培养基筛选与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，灵敏度高，优越性十分明显异性强，灵敏度高，优越性十分明显。应用主要有：应用主要有：1 1、临床诊断、临床诊断2 2、作为载体，运载抗癌药物，形成、作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹生物导弹”治疗肿瘤治疗肿瘤资料资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性
8、疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶病灶”也引起人们的注也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用知识结构两个过程动物细胞培养过程单克隆抗体制备过程三个“一”一个诱导细胞融合的新方法 灭活的病毒一个新细胞杂交瘤细胞一个优势单克隆抗体特异性 强、灵敏度高的优势教学反馈1.动物细胞融合技术最重要的用
9、途是 （）A.克服远源杂交不亲和 B.制备单克隆抗体C.培育新物种 D.生产杂种细胞B2.单克隆抗体是由下列哪种细胞产生的（）A.B淋巴细胞 B.T淋巴细胞 C.骨髓瘤细胞 D.杂交瘤细胞 D3.（多选）1975年米尔斯坦和柯勒成功地获得了单克隆抗体。下列细胞中与单克隆抗体的制备有关的是（）A.效应B细胞 BT淋巴细胞C.骨髓瘤细胞 D杂交瘤细胞 A B C D课后习题课后习题1.单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是 （）淋巴细胞 小鼠骨髓瘤细胞 B淋巴细胞自身融合细胞小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞 杂交瘤细胞A
10、.B.C.D.C2.动物细胞融合和植物原生质融合决定于 ()A.细胞膜的流动性 B细胞膜的选择透过性C.细胞质的流动性D细胞质酶的活性 A一.选择题3.“生物导弹”是指 （）A.单克隆抗体 B.杂交瘤细胞C.产生特定抗体的B淋巴细胞 D.在单克隆抗体上连接抗癌药物 D4.只能使动物细胞融合的常用诱导方法是 （）APEG B灭活的病毒 C电刺激 D离心A二.简答题1.淋巴细胞是由动物体-中的-细胞分化发育而来的。2.杂交瘤细胞从培养基中吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是-骨髓造血干主动运输 下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的实验方
11、案风杆菌的实验方案2 2、该方案能达到预期效果吗？为什么？、该方案能达到预期效果吗？为什么？4 4、图中、图中B B为为_过程，常用过程，常用_作为诱导剂，该细胞继作为诱导剂，该细胞继承承_的遗传特性，既能的遗传特性，既能_,_,又能又能_。1 1、该实验方案的目的是、该实验方案的目的是_3 3、A A是从小鼠的脾脏中取得是从小鼠的脾脏中取得_,_,该细胞能够产生该细胞能够产生_5 5、C C过程指细胞培养，该过程包括过程指细胞培养，该过程包括_培养和培养和_培养两个阶段，其培养两个阶段，其中中_代以内的的细胞属于细胞株。代以内的的细胞属于细胞株。制备单克隆抗体制备单克隆抗体B B细胞细胞抗体
12、抗体细胞融合细胞融合灭活病毒灭活病毒双亲细胞双亲细胞分泌抗体分泌抗体无限增殖无限增殖原代原代传代传代50B体外培养体外培养骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群足够数量的细胞群注射到注射到小鼠腹腔小鼠腹腔AC练一练练一练A A、B B细胞为动物细胞细胞为动物细胞,请据图回答问题请据图回答问题:A细胞细胞B细胞细胞C细细胞胞D细细胞胞(1)(1)若若A A细胞为骨髓瘤细胞细胞为骨髓瘤细胞B B细胞为淋巴细胞细胞为淋巴细胞,那么那么D D细胞细胞称为称为 细胞细胞,D,D细胞具有两个亲本细胞的细胞具有两个亲本细胞的特征特征,一方面因具有骨髓瘤细胞的一方面因具有骨髓瘤细胞的 性性质
13、质,通过通过 方式产生大量细胞方式产生大量细胞,我们称之我们称之为为 过程过程;另一方面能分泌大量的抗体另一方面能分泌大量的抗体,我我们把该过程分泌的抗体称们把该过程分泌的抗体称 .杂交瘤杂交瘤连续分裂连续分裂有丝分裂有丝分裂单克隆单克隆单克隆抗体单克隆抗体练一练练一练(2)D(2)D细胞中产生的抗体其化学本质是细胞中产生的抗体其化学本质是 ,合成该物质的场所是合成该物质的场所是 ,它是由它是由 控制合成的控制合成的,合成过程包括合成过程包括 和和 两个重要步骤两个重要步骤.球蛋白球蛋白核糖体核糖体基因基因转录转录翻译翻译(3)D(3)D细胞中产生的抗体具有细胞中产生的抗体具有 作用作用,与血
14、清抗体相比其优越之处在于与血清抗体相比其优越之处在于 强强 高高.免疫免疫特异性特异性灵敏度灵敏度(4)(4)若若A A为人细胞为人细胞,B,B为鼠细胞为鼠细胞,用同位素标记用同位素标记A A细胞膜上细胞膜上的蛋白质的蛋白质,B,B不标记不标记,在在C C细胞时细胞时,检测结果发现整个细检测结果发现整个细胞一半有放射性另一半没有胞一半有放射性另一半没有.在在D D细胞时细胞时,检测结果发检测结果发现整个细胞都有放射性现整个细胞都有放射性,请解释原因请解释原因 .构成细胞膜的蛋白质分子大都可以流动构成细胞膜的蛋白质分子大都可以流动教学参考教学参考1.已成功的动物细胞融合实例还有哪些？生物种类 细
15、胞来源 成功年代 酵母菌鸡 原生质体血红细胞 1975年人胡萝卜 腹水癌细胞原生质体 1976年人小鼠 纤维肉瘤细胞畸胎瘤细胞 1978年要知道更多的实例，需经常查阅更多科研报道。2.2.为什么不用两个而要用多个细胞进行动物细胞间的为什么不用两个而要用多个细胞进行动物细胞间的融合？融合？就目前常用的细胞融合方法来看，不管是用物理的、化学的方法，还是生物的方法，其融合率都不可能是100%。仅用两个细胞融合，其效率太低，不一定能得到融合细胞。更重要的是，即使两个细胞已发生融合，但并不一定是研究者期望得到的细胞类型。目前动物细胞融合技术最有价值的应用就是单克隆抗体的制备。我们以制备单克隆抗体为例来说
16、明这一问题。我们知道，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上，但是每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，如果仅取一个脾细胞（含B淋巴细胞）和一个瘤细胞杂交，我们不能确定该脾细胞分泌的抗体是否正是我们所需要的；若用大量的脾细胞和瘤细胞进行融合，就可以从融合细胞中筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。3.3.如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法”来选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行34次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。