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1、细胞培养基本技术概述细胞培养基本技术概述细胞培养所用玻璃及塑料细胞培养所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒制品的清洗与消毒清洗清洗 在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感敏感敏感敏感,均能影响培养细胞的生长均能影响培养细胞的生长均能影响培养细胞的生长均能影响培养细胞的生长微生物产品附带杂物微生物产品附带杂物微生物产品附带杂物微生物产品附带杂物上次细胞残留物上次细胞残留物上次细胞残留物上次细胞残留物非营养成分的化学物质非营养成分的化学物质非营养成分的化学
2、物质非营养成分的化学物质 需要清洗的培养用品需要清洗的培养用品需要清洗的培养用品需要清洗的培养用品玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗胶塞的清洗胶塞的清洗胶塞的清洗胶塞的清洗塑料制品的清洗塑料制品的清洗塑料制品的清洗塑料制品的清洗浸泡浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉浸泡，以使附着物软化或被溶掉浸泡，以使附着物软化或被溶掉浸泡，以使附着物软化或被溶掉新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表新的初次使
3、用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等些对细胞有害的物质等些对细胞有害的物质等些对细胞有害的物质等 先用自来水简单刷洗，然后用先用自来水简单刷洗，然后用先用自来水简单刷洗，然后用先用自来水简单刷洗，然后用5 5稀盐酸液浸泡过夜，稀盐酸液浸泡过夜，稀盐酸液浸泡过夜，稀盐酸液浸泡过
4、夜，以中和其中的碱性物质以中和其中的碱性物质以中和其中的碱性物质以中和其中的碱性物质再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉固后不易洗掉固后不易洗掉固后不易洗掉 用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上浮在液面上浮在液面上浮在液面上刷洗：刷洗：用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿
5、表面附用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质着较牢的杂质刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度浸酸：浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液中玻璃器皿浸泡到清洁液中玻璃器皿浸泡到清洁液中玻璃器皿浸泡到清洁液中清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质不掉的微量杂质不掉的微量杂质不掉的微量杂质浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液
6、面浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面浸泡时间：一般为过夜，不应少于浸泡时间：一般为过夜，不应少于浸泡时间：一般为过夜，不应少于浸泡时间：一般为过夜，不应少于6 6 6 6 小时小时小时小时 清洁液清洁液清洁液清洁液 常用三种：重铬酸钾（常用三种：重铬酸钾（常用三种：重铬酸钾（常用三种：重铬酸钾（g g g g）浓硫酸（）浓硫酸（）浓硫酸（）浓硫酸（mlmlmlml）蒸馏水（）蒸馏水（）蒸馏水（）蒸馏水（mlmlmlml）强清洁液强清洁液强清洁液强清洁液 631000200 631000200 631000200 63100020
7、0 次强清洗液次强清洗液次强清洗液次强清洗液 120 2001000 120 2001000 120 2001000 120 2001000 弱清洁液弱清洁液弱清洁液弱清洁液 100 1001000 100 1001000 100 1001000 100 1001000 配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分及身体裸露部分及身体裸露部分及身体裸露部分 配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不
8、配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色制品。配成后清洁液一般为棕红色制品。配成后清洁液一般为棕红色制品。配成后清洁液一般为棕红色冲洗冲洗在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分在使用后，刷洗及浸泡后
9、都必须用水充分在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或清洁液的残迹冲洗。使之尽量不留污染或清洁液的残迹冲洗。使之尽量不留污染或清洁液的残迹冲洗。使之尽量不留污染或清洁液的残迹最好用洗涤装置最好用洗涤装置最好用洗涤装置最好用洗涤装置如用手工操作如用手工操作如用手工操作如用手工操作 需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，最好用蒸馏水清洗最好用蒸馏水清洗最好用蒸馏水清洗最好用蒸馏水清洗3-5 3-5 3-5 3-5 次，晾干备用次，晾干备用次，晾干备用
10、次，晾干备用塑料制品的清洗塑料制品的清洗塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品包装，打开包装即可用，多为一次性物品包装，打开包装即可用，多为一次性物品包装，打开包装即可用，多为一次性物品必要时用必要时用必要时用必要时用2%NaOH 2%NaOH 2%NaOH 2%NaOH 浸泡过夜，用自来水充分浸泡过夜，用自来水充分浸泡过夜，用自来水充分浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用冲洗，再用冲洗，再用冲洗，再用5%5%5%5%盐酸溶液浸泡盐酸溶液浸泡盐酸溶液
11、浸泡盐酸溶液浸泡30 30 30 30 分钟，最后用分钟，最后用分钟，最后用分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用消毒灭菌方法消毒灭菌方法物理消毒灭菌法物理消毒灭菌法物理消毒灭菌法物理消毒灭菌法紫外线：紫外线：紫外线：紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进用于空气，操作台表面和不能使用其它法进用于空气，操作台表面和不能使用其它法进用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培养器皿，行消毒的培养器皿，行消毒的培养器皿，行消毒的培养器皿，30min30min30min30min湿热（高
12、压蒸气灭菌法）：湿热（高压蒸气灭菌法）：湿热（高压蒸气灭菌法）：湿热（高压蒸气灭菌法）：121121121121，20min20min20min20min干烤：干烤：干烤：干烤：160,2 160,2 160,2 160,2 小时小时小时小时过滤：过滤：过滤：过滤：0.220.220.220.22mmmm化学消毒灭菌法化学消毒灭菌法化学消毒灭菌法化学消毒灭菌法70%70%70%70%酒精酒精酒精酒精 主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室
13、内的壁面处理1111新洁尔灭新洁尔灭新洁尔灭新洁尔灭 主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒抗生素抗生素抗生素抗生素主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染水水的制备：水的制备：细胞培养用水必须非常纯净，不含有离细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水 细
14、胞培养基细胞培养基市场上可提供干粉培养基和液体培养基市场上可提供干粉培养基和液体培养基干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点是配制过程繁琐，质量点是价格便宜。缺点是配制过程繁琐，质量点是价格便宜。缺点是配制过程繁琐，质量点是价格便宜。缺点是配制过程繁琐，质量不易控制不易控制不易控制不易控制液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，
15、而且使用十分方便不仅质量得到保证，而且使用十分方便不仅质量得到保证，而且使用十分方便不仅质量得到保证，而且使用十分方便常用的培养基种类常用的培养基种类RPMI-1640RPMI-1640RPMI-1640RPMI-1640（标准型）、（标准型）、（标准型）、（标准型）、DMEM-DMEM-DMEM-DMEM-高糖（标准型）高糖（标准型）高糖（标准型）高糖（标准型）、DMEM-DMEM-DMEM-DMEM-低糖（标准型）、低糖（标准型）、低糖（标准型）、低糖（标准型）、McCoys 5AMcCoys 5AMcCoys 5AMcCoys 5A、M199M199M199M199、F10F10F10F
16、10等等等等细胞培养基应用选择细胞培养基应用选择选择培养基没有一定的标准，有几点建议可供参考：选择培养基没有一定的标准，有几点建议可供参考：(1(1）建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞）建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。咨询。(2)(2)其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。以适合多种细胞。(3)(3)根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选小鼠细
17、胞株多选 RPMI1640 RPMI1640。(4)(4)用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。制备1000mlRPMI1640培养基RPMI1640干粉培养基10.4g（1包）蒸馏水400ml磁力搅拌至完全溶解加三蒸馏水定容至1000ml在超净台内无菌条件下，用灭菌后的并置有0.22m孔径滤膜的过滤器除菌，并分装成200ml/瓶，-20保存备用。用前取一瓶溶
18、解，每200ml培养液加灭活的小牛血清至终浓度为10%，即加22ml。再加青霉素和链霉素至终浓度各为100U/ml。-细胞培养液血清血清热灭活：热灭活：热灭活：热灭活：56,30 56,30 56,30 56,30 分钟加热已完全解冻的血清分钟加热已完全解冻的血清分钟加热已完全解冻的血清分钟加热已完全解冻的血清热灭活目的：灭活血清中的补体成分。热灭活目的：灭活血清中的补体成分。热灭活目的：灭活血清中的补体成分。热灭活目的：灭活血清中的补体成分。如果不做细如果不做细如果不做细如果不做细胞因子和免疫相关的实验，建议血清不要灭活。胞因子和免疫相关的实验，建议血清不要灭活。胞因子和免疫相关的实验，建议
19、血清不要灭活。胞因子和免疫相关的实验，建议血清不要灭活。因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，还会影因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，还会影因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，还会影因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，还会影响血清的质量。灭活后严重影响细胞生长速度，且响血清的质量。灭活后严重影响细胞生长速度，且响血清的质量。灭活后严重影响细胞生长速度，且响血清的质量。灭活后严重影响细胞生长速度，且细胞贴壁率降低。细胞贴壁率降低。细胞贴壁率降低。细胞贴壁率降低。血清中的沉淀物血清中的沉淀物血清中的沉淀物血清中的沉淀物絮状物絮状物絮状物絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造：血清中的脂
20、蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm,5 3000rpm,5 3000rpm,5 3000rpm,5 分钟去除，也可不用处理分钟去除，也可不用处理分钟去除，也可不用处理分钟去除，也可不用处理显微镜下显微镜下显微镜下显微镜下“小黑点小黑点小黑点小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形：经过热处理过的血清，沉淀物的形：经
21、过热处理过的血清，沉淀物的形：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点小黑点小黑点小黑点”，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更细胞生长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更细胞生长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更细
22、胞生长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清换另一批号的血清换另一批号的血清换另一批号的血清PBSPBSPBSPBS（Phosphate-Buffered SallinesPhosphate-Buffered SallinesPhosphate-Buffered SallinesPhosphate-Buffered Sallines）KCl KCl KCl KCl0.20g0.20g0.20g0.20g KH2PO4 KH2PO4 KH2PO4 KH2PO4 0.20g 0.20g 0.20g 0.20g NaCl NaCl NaCl NaCl8.00g8.00g8.00g
23、8.00g Na2HPO47H2ONa2HPO47H2ONa2HPO47H2ONa2HPO47H2O2.16g2.16g2.16g2.16gDPBSDPBS（Dulbeccos Phosphate-Buffered SallinesDulbeccos Phosphate-Buffered Sallines）标准型）标准型）标准型）标准型CaCl2(anhyd.)(CaCl2(anhyd.)(无水氯化钙无水氯化钙无水氯化钙无水氯化钙)0.10g 0.10gKClKCl 0.20g 0.20gKH2PO4KH2PO4 0.20g 0.20gMgCl26H2OMgCl26H2O 0.10g 0.10
24、gNaClNaCl 8.00g 8.00gNa2HPO47H2ONa2HPO47H2O 2.16g 2.16gD-Hanks D-Hanks D-Hanks D-Hanks 平衡盐溶液平衡盐溶液平衡盐溶液平衡盐溶液(D-Hanks Balanced Salt(D-Hanks Balanced Salt(D-Hanks Balanced Salt(D-Hanks Balanced Salt Solutions,D-HBSS)Solutions,D-HBSS)Solutions,D-HBSS)Solutions,D-HBSS)KClKClKClKCl0.40g0.40g0.40g0.40gKH2P
25、O4KH2PO4KH2PO4KH2PO40.06g0.06g0.06g0.06gNaClNaClNaClNaCl8.00g8.00g8.00g8.00gNaCO3NaCO3NaCO3NaCO3 0.35g 0.35g 0.35g 0.35gNa2HPO4Na2HPO4Na2HPO4Na2HPO40.048g0.048g0.048g0.048gD-GlucoseD-GlucoseD-GlucoseD-Glucose1.00g1.00g1.00g1.00gPhenol RedPhenol RedPhenol RedPhenol Red0.01g0.01g0.01g0.01g胰蛋白酶溶液胰蛋白酶溶液
26、主要作用：使细胞间的蛋白质水解，使主要作用：使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散细胞相互离散消化细胞时，加入一些血清或含血清的消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，能终止消化作用培养液，能终止消化作用称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许D-D-Hanks Hanks 平衡盐平衡盐溶液调成糊状，再补足溶液调成糊状，再补足D-D-Hanks Hanks 平衡盐溶液，搅拌混匀，置室温平衡盐溶液，搅拌混匀，置室温4 4 小小时或冰箱过夜，不断搅拌振荡时或冰箱过夜，不断搅拌振荡次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中，装入瓶中，
27、-20-20保存备用保存备用（以免分解失效）（以免分解失效），常用浓度为常用浓度为0.25%0.25%（0.1%-0.5%0.1%-0.5%）胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氢钠溶胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氢钠溶液调液调pH pH 至至7.2 7.2 左右左右胰蛋白酶溶液配制胰蛋白酶溶液配制pH pH 调整液调整液NaHCO3 NaHCO3 NaHCO3 NaHCO3 溶液溶液溶液溶液常用浓度为常用浓度为常用浓度为常用浓度为7.5%7.5%7.5%7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压
28、灭菌，分装，或高压灭菌，分装，或高压灭菌，分装，或高压灭菌，分装，4444保存保存保存保存HEPESHEPESHEPESHEPES（分子量（分子量（分子量（分子量238.31238.31238.31238.31）溶液）溶液）溶液）溶液一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒性无毒性主要作用主要作用:防止培养基防止培养基pHpH迅速变动。在开放式培养条件迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了下，观察细胞时培养基脱离了5%CO25%CO2的环境，的环境，CO2CO2气体气体迅速逸出，迅速逸出，pHpH迅速升高，若加了迅速升高，若
29、加了HEPESHEPES，此时可以维持，此时可以维持pH7.0pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPESHEPES使用终浓度一般为使用终浓度一般为使用终浓度一般为使用终浓度一般为10-5010-5010-5010-50mmol/Lmmol/L常配成常配成常配成常配成1M 1M 1M 1M 储存液：用储存液：用储存液：用储存液：用20ml 20ml 20ml 20ml 双蒸水溶解双蒸水溶解双蒸水溶解双蒸水溶解4.764.764.764.76克克克克HEPESHEPESHEPESHEPES，过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，过
30、滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，4444保存。保存。保存。保存。使用时可使用时可向向100ml100ml培养液中加入培养液中加入2ml 2ml HEPESHEPESHEPESHEPES浓缩液，终浓度为浓缩液，终浓度为20mmol/L 20mmol/L 谷氨酰胺补充液谷氨酰胺补充液谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，易降解，44下放置下放置7 7天即可分解约天即可分解约50%50%，所以都是在，所以都是在使用前添加使用前添加
31、配制好的培养液（含谷氨酰胺）在配制好的培养液（含谷氨酰胺）在44放置放置2 2周以上周以上时，要重新加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制时，要重新加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加入培养液内谷氨酰胺，以便临时加入培养液内使用终浓度为使用终浓度为1-4mmol/L1-4mmol/L一般配制为一般配制为100100倍浓缩液，即浓度为倍浓缩液，即浓度为200mmol/L200mmol/L（29.22g/L29.22g/L），），配制方法为配制方法为：谷氨酰胺谷氨酰胺2.922g2.922g溶于三蒸水加至溶于三蒸水加至100ml100ml即配成即配成200mmol/L200mmol/
32、L的溶液，充分搅拌溶解后（应加温的溶液，充分搅拌溶解后（应加温3030），），过滤除菌，分装小瓶，过滤除菌，分装小瓶，-20-20保存，使用时可向保存，使用时可向100ml100ml培养液中加入培养液中加入0.5-2ml0.5-2ml谷氨酰胺浓缩液，终浓谷氨酰胺浓缩液，终浓度为度为1-4mmol/L 1-4mmol/L 酚红酚红大多数培养液中使用酚红作为大多数培养液中使用酚红作为pH pH 指示指示红色表示中性红色表示中性红色表示中性红色表示中性pHpHpHpH，黄色代表酸性，黄色代表酸性，黄色代表酸性，黄色代表酸性pHpHpHpH，紫色，紫色，紫色，紫色表示碱性表示碱性表示碱性表示碱性pHp
33、HpHpH在一些特殊培养液中不含酚红在一些特殊培养液中不含酚红因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）样作用醇激素（尤其是雌激素）样作用醇激素（尤其是雌激素）样作用醇激素（尤其是雌激素）样作用器材和液体的准备器材和液体的准备细胞培养用的玻璃器材细胞培养用的玻璃器材细胞培养用的玻璃器材细胞培养用的玻璃器材培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒
34、和铁筒中，中，中，中，160160160160，2 2 2 2小时干烤小时干烤小时干烤小时干烤灭菌后备用灭菌后备用灭菌后备用灭菌后备用手术器材、瓶塞、配制好的手术器材、瓶塞、配制好的手术器材、瓶塞、配制好的手术器材、瓶塞、配制好的PBSPBSPBSPBS液液液液15151515磅，磅，磅，磅，121121121121，20202020分钟分钟分钟分钟蒸气灭菌蒸气灭菌蒸气灭菌蒸气灭菌MEMMEMMEMMEM培养液、小牛血清、消化液培养液、小牛血清、消化液培养液、小牛血清、消化液培养液、小牛血清、消化液用用用用G6G6G6G6滤器负压滤器负压滤器负压滤器负压抽滤抽滤抽滤抽滤后备用后备用后备用后备用
35、无菌操作中的注意事项无菌操作中的注意事项在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁操作前无菌室及无菌操作台以紫外灯照射操作前无菌室及无菌操作台以紫外灯照射操作前无菌室及无菌操作台以紫外灯照射操作前无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60 30-60 30-60 30-60 分分分分钟灭菌，以钟灭菌，以钟灭菌，以钟灭菌，以70%ethanol 70%ethanol 70%ethanol 70%ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开擦拭无菌操作抬面，并开擦拭无菌操作抬面，并开擦拭无
36、菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转启无菌操作台风扇运转启无菌操作台风扇运转启无菌操作台风扇运转10 10 10 10 分钟分钟分钟分钟操作时，小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。操作时，小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。操作时，小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。操作时，小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或容器瓶口，亦不要在打勿碰触吸管尖头部或容器瓶口，亦不要在打勿碰触吸管尖头部或容器瓶口，亦不要在打勿碰触吸管尖头部或容器瓶口，亦不要在打 开之容开之容开之容开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并器正上方操作实
37、验。容器打开后，以手夹住瓶盖并器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约握住瓶身，倾斜约握住瓶身，倾斜约握住瓶身，倾斜约45454545角取用角取用角取用角取用 在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行哺乳动物细胞冷冻保存哺乳动物细胞冷冻保存冷冻保存要点冷冻保存要点冷冻保存要点冷冻保存要点冷冻过程要缓慢。冷冻过程要缓慢。冷冻过程要缓慢。冷冻过程要缓慢。4 304 304 304 3060 60 60 60 分钟分钟分钟分钟-20 30-20
38、30-20 30-20 30 分钟分钟分钟分钟 -80 16-80 16-80 16-80 1618 18 18 18 小时（或过夜）小时（或过夜）小时（或过夜）小时（或过夜）液氮长期保存液氮长期保存液氮长期保存液氮长期保存冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90909090，无微，无微，无微，无微生物污染。细胞浓度控制在：生物污染。细胞浓度控制在：生物污染。细胞浓度控制在：生物污染。细胞浓度控制在：1101101101107 7 7 75105105105107 7 7 7/ml/ml
39、/ml/ml。常用细胞冷冻保存液常用细胞冷冻保存液常用细胞冷冻保存液常用细胞冷冻保存液10101010DMSO DMSO DMSO DMSO 完全细胞生长培养液（完全细胞生长培养液（完全细胞生长培养液（完全细胞生长培养液（20202020血清基础血清基础血清基础血清基础培养液）培养液）培养液）培养液）10101010甘油甘油甘油甘油 完全细胞生长培养液（完全细胞生长培养液（完全细胞生长培养液（完全细胞生长培养液（20202020血清基础培血清基础培血清基础培血清基础培养液）养液）养液）养液）冷冻保存细胞的解冻与复苏要点冷冻保存细胞的解冻与复苏要点快速解冻快速解冻快速解冻快速解冻冻存细胞从液氮中
40、取出后，立即放入冻存细胞从液氮中取出后，立即放入冻存细胞从液氮中取出后，立即放入冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37373737水浴中，水浴中，水浴中，水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在轻轻摇动冷冻管，使其在轻轻摇动冷冻管，使其在轻轻摇动冷冻管，使其在1 1 1 1 分钟内全部融化（不分钟内全部融化（不分钟内全部融化（不分钟内全部融化（不要超过要超过要超过要超过3 3 3 3 分钟）分钟）分钟）分钟）解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养，液的细胞培养瓶中直
41、接进行培养，液的细胞培养瓶中直接进行培养，液的细胞培养瓶中直接进行培养，24 24 24 24 小时后小时后小时后小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除DMSODMSODMSODMSO如果细胞对冷冻保护剂特别敏感如果细胞对冷冻保护剂特别敏感如果细胞对冷冻保护剂特别敏感如果细胞对冷冻保护剂特别敏感解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全
42、生长培养液的培养瓶中后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中解冻冷冻保存细胞的离心方法解冻冷冻保存细胞的离心方法从液氮中取出冻存的细胞，立即放入从液氮中取出冻存的细胞，立即放入从液氮中取出冻存的细胞，立即放入从液氮中取出冻存的细胞，立即放入37373737水浴中水浴中水浴中水浴中快速解冻快速解冻快速解冻快速解冻将将将将1 1 1 12ml 2ml 2ml 2ml 冻存细胞液加入到冻存细胞液加入到冻存细胞液加入到冻存细胞液加入到25ml 25ml 25ml 25ml 新鲜完全细胞新鲜完全细胞新鲜完全细胞新鲜完全细胞生长培养液中，
43、轻轻混匀生长培养液中，轻轻混匀生长培养液中，轻轻混匀生长培养液中，轻轻混匀用用用用80g 80g 80g 80g 离心离心离心离心2 2 2 23 3 3 3 分钟，弃上清液分钟，弃上清液分钟，弃上清液分钟，弃上清液用完全生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数细胞用完全生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数细胞用完全生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数细胞用完全生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数细胞接种细胞到培养瓶中，起始密度为接种细胞到培养瓶中，起始密度为接种细胞到培养瓶中，起始密度为接种细胞到培养瓶中，起始密度为3105/ml3105/ml3105/ml3105/ml。细胞的原代和传代培养细胞的原代和传代培
44、养原代细胞培养原理原代细胞培养原理细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。胞工程等问题的研究。胞工程等问题的研究。胞工程等问题的研究。由体内
45、直接取出组织或细胞进行培养叫原代培由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。似，适用于研究。似，适用于研究。似，适用于研究。幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养仔的脏器等更容易进行原代培养仔的脏
46、器等更容易进行原代培养仔的脏器等更容易进行原代培养原代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例）原代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例）原代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例）原代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例）取材：取材：取材：取材：用用用用颈椎脱位法颈椎脱位法颈椎脱位法颈椎脱位法使使使使孕鼠孕鼠孕鼠孕鼠迅速死亡。把迅速死亡。把迅速死亡。把迅速死亡。把整个孕鼠整个孕鼠整个孕鼠整个孕鼠浸入盛有浸入盛有浸入盛有浸入盛有75757575乙醇乙醇乙醇乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入的烧杯中数秒钟消毒，取出
47、后放在大平皿中携入超超超超净台净台净台净台。用消过毒的剪刀。用消过毒的剪刀。用消过毒的剪刀。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开在躯干中部环行剪开在躯干中部环行剪开在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出皮肤，剖腹取出皮肤，剖腹取出皮肤，剖腹取出子宫子宫子宫子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，剪开子宫，剪开子宫，剪开子宫，取出取出取出取出鼠胎，鼠胎，鼠胎，鼠胎，剪去剪去剪去剪去头、爪，头、爪，头、爪，头、爪，以以以以平衡盐溶液平衡盐溶液平衡盐溶液平衡盐溶液洗去血污洗去血污洗去血污洗去血污 切割：切割：切割：切
48、割：用用用用平衡盐溶液平衡盐溶液平衡盐溶液平衡盐溶液将取出的将取出的将取出的将取出的组织块组织块组织块组织块清洗三次，然后用眼科清洗三次，然后用眼科清洗三次，然后用眼科清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将手术剪刀仔细将手术剪刀仔细将手术剪刀仔细将组织反复剪碎组织反复剪碎组织反复剪碎组织反复剪碎，直到成，直到成，直到成，直到成1mm1mm1mm1mm3 3 3 3左右的小块左右的小块左右的小块左右的小块，再，再，再，再用用用用平衡盐溶液平衡盐溶液平衡盐溶液平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟，使清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟，使清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟，使清洗，洗到组织
49、块发白为止。静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清组织块自然沉淀到管底，弃去上清组织块自然沉淀到管底，弃去上清组织块自然沉淀到管底，弃去上清 消化、接种培养：消化、接种培养：消化、接种培养：消化、接种培养：加入加入加入加入0.250.250.250.25胰蛋白酶消化液胰蛋白酶消化液胰蛋白酶消化液胰蛋白酶消化液（5-105-105-105-10倍量倍量倍量倍量），），），），与组织块混匀。置与组织块混匀。置与组织块混匀。置与组织块混匀。置37373737水浴，观察消化情况水浴，观察消化情况水浴，观察消化情况水浴，观察消化情况（每隔几分钟摇（每隔几分钟摇（每隔几分钟摇（每隔几分钟摇动一下试管
50、），静止，吸去上清，加入动一下试管），静止，吸去上清，加入动一下试管），静止，吸去上清，加入动一下试管），静止，吸去上清，加入5 5 5 510ml10ml10ml10ml细胞培养液细胞培养液细胞培养液细胞培养液，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养中培养中培养中培养原代细胞培养结果原代细胞培养结果细胞接种后一般几小时内就能贴壁，细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长并开始生长如接种的细胞密度适宜，如接种的细胞密度