细胞培养基本知识优秀PPT.ppt

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1、细胞培育基本学问细胞培育基本学问依据中华人民共和国传染病防治法实施方法规定：凡从事致病性微生物试验的科研、教学和生产单位，作为各类传染病菌（毒）探讨操作的基本单元，试验室必需有防止致病性微生物扩散的制度和人体防护措施。不同危害群的微生物必需在不同的物理性防护的条件下进行操作，一方面防止试验人员和其他物品受到污染，同时也防止其释放到环境中。传染病原危害等级。第一级危害群微生物：与人类成人健康和疾病无关；（无或极低的个体和群体危急）不太可能引起人或动物致病的微生物其次级危害群微生物：在人类所引起的疾病很少是严峻的，而且通常有预防及治疗的方法；（个体危急中等，群体危急低）试验室暴露或许会引起严峻感染

2、，但对感染有有效的预防和治疗措施，并且疾病传播的危急有限。第三级危害群微生物：在人类可以引起严峻或致死的疾病，可能有预防和治疗的方法；第四级危害群微生物：在人类可以引起严峻或致死的疾病，通常无预防和治疗的方法，如炭疽杆菌、霍乱弧菌、埃博拉病毒、天花病毒等。隔离的设备、试验室的设计及试验实施等3个方面所组成.依据其密封程度的不同，分为P1、P2、P3和P4四个生物平安等级。P是英文protect（爱护）的缩写。四级生物平安（P4）是生物平安试验室等级最高的试验室，可以有效阻挡传染性病原释放到环境中，同时给探讨人员供应生物平安的保证。试验室可分：基础试验室一级生物平安水平、基础试验室二级生物平安水

3、平、防护试验室三级生物平安水平最高防护试验室四级生物平安水平。依据操作不同危急度，等级微生物所需的试验室设计特点、建筑构造、防护设施、仪器、操作以及操作程序来确定试验室的生物平安水平。有关的手册有叙述：与不同危急度等级相对应的（而非“等同的”）各危急度等级微生物所要求的试验室生物平安水平。生物平安试验室（生物平安试验室（P1、P2、P3、P4）11级级基础试验室基础试验室一级生物平安水平基础的教学、探讨一级生物平安水平基础的教学、探讨,GMT,GMT不须要；开放试验台不须要；开放试验台22级级基础试验室基础试验室二二级生物平安水平级生物平安水平初级卫生服务；初级卫生服务；诊断、探讨诊断、探讨G

4、MTGMT加防护服、生物危加防护服、生物危害标记害标记开放试验台，此外开放试验台，此外需需BSCBSC用于防护可能生用于防护可能生成的气溶胶成的气溶胶33级级防护试验室防护试验室三三级生物平安水平特殊的诊级生物平安水平特殊的诊断、研断、研究究，在二级生物平安防护水平上增加特殊，在二级生物平安防护水平上增加特殊防护服、防护服、进入制度、定向气流进入制度、定向气流BSCBSC和或其他全和或其他全部试验室工作所须要的基本设备部试验室工作所须要的基本设备44级级最高防护试验室最高防护试验室四级生物平安水平四级生物平安水平危急病原体探讨在三级生物平安防护水平上增危急病原体探讨在三级生物平安防护水平上增加

5、气锁入口、出加气锁入口、出口淋浴、污染物品的特殊处理口淋浴、污染物品的特殊处理级级BSCBSC或或级级BSCBSC。穿着正压服、双开门高压灭。穿着正压服、双开门高压灭菌器（穿过墙体）、经过滤的空气。菌器（穿过墙体）、经过滤的空气。BSCBSC：生物平安柜；：生物平安柜；GMTGMT：微生物学操作技术：微生物学操作技术规范规范我国在生物平安方面也制定过一些相应的条例和法规。中华人民共和国卫生行业标准（WS2332002）微生物生物医学试验室生物平安通用准则中对生物平安三级（P3）试验室进行了规定。每个试验室都应当接受“平安手册”或“操作手册”，其中定义了已知的和潜在的危害，并规定了特殊的操作程序

6、来避开或尽量减小这种危害。规范的微生物学操作技术是试验室平安的基础，而特地的试验设备仅仅是一种补充，绝不能替代正确的操作规范。在一级生物平安水平操作的微生物不太可能引起人类疾病或兽医学意义的动物疾病。但志向的做法是，全部试验室工作人员应进行上岗前的体检，并记录其病史。疾病和实验室意外事故应快速报告，全部工作人员都应意识到应用规范的试验室操作技术的重要性。在二级生物平安水平操作微生物的试验室工作人员1、必需有录用前或上岗前的体检。记录个人病史，并进行一次有目的的职业健康评估。2、试验室管理人员要保存工作人员的疾病和缺勤记录。3、育龄期妇女应知道某些微生物（如风疹病毒）的职业暴露对未诞生孩子的危害

7、。培训人为的失误和不规范的操作会影响所实行的平安措施对试验室人员的防护效果。因此，熟悉如何识别与限制试验室危害的、有平安意识的工作人员，是预防试验室感染、差错和事故的关键。管理者应确保将平安的试验室操作及程序融合到工作人员的基本培训中。全部试验室工作人员都会常常遇到的高危操作，包括：1、吸入危急（气溶胶产物），如运用接种环、划线接种琼脂平板、移液、制作涂片、打开培育物、采集血液血清标本、离心等2、食入危急，如处理标本、涂片以及培育物3、在运用注射器和针头时刺伤皮肤的危急4、处理动物时被咬伤、抓伤5、处理血液以及其他有潜在病理学危害的材料6、感染性材料的清除污染和处理。典型的二级生物平安水平试验

8、室门保持关闭并贴上适当的危急标记。潜在被污染的废弃物同一般废弃物隔开。基本生物平安设备1、移液协助器避开用口吸的方式移液2、生物平安柜，在以下状况运用：处理感染性物质；假如运用密封的平安离心杯，并在生物平安柜内装样、取样，则这类材料可在开放试验室离心空气传播感染的危急增大时进行极有可能产生气溶胶的操作时（包括离心、研磨、混匀、猛烈摇动、超声裂开、打开内部压力和四周环境压力不同的盛放有感染性物质的容器、动物鼻腔接种以及从动物或卵胚采集感染性组织）。3、一次性塑料接种环，也可在生物平安柜内运用电加热接种环，以削减生成气溶胶。4、螺口盖试管及瓶子。5、用于清除感染性材料污染的高压灭菌器或其他适当工具

9、。6、一次性巴斯德塑料移液管，尽量避开运用玻璃制品。7、在投入运用前，像高压灭菌器和生物平安柜等设备必需用正确方法进行验收。应参照生产商的说明书定期检测。废弃物处理首要原则：全部感染性材料必需在试验室内清除污染、高压灭菌或焚烧。用以处理潜在感染性微生物或动物组织的全部的试验室物品，在被丢弃前应考虑的主要问题有：1、是否已实行规定程序对这些物品进行了有效的清除污染或消毒？2、丢弃已清除污染的物品时，是否会对干脆参与丢弃的人员，或在设施外可能接触到丢弃物的人员造成任何潜在的生物学或其他方面的危害？3.清除污染高压蒸汽灭菌是清除污染时的首选方法。须要清除污染并丢弃的物品应装在容器中。任何高压灭菌后重

10、复运用的污染（有潜在感染性）材料不应事先清洗，任何必要的清洗、修复必需在高压灭菌或消毒后进行。也可接受其他除去或杀灭微生物的替代方法4.污染性材料和废弃物的处理和丢弃程序要对感染性物质及其包装物进行鉴别并分别进行处理，相关工作要遵守国家和国际规定。合适的环境和必需的条件合适的环境和必需的条件合适的环境和必需的条件合适的环境和必需的条件1养养分分须须要要22环环环环 境境境境 要要要要 求求求求3无毒及无污染无毒及无污染无无 毒：无毒是培育细胞的必需条件。毒：无毒是培育细胞的必需条件。凡与凡与 细胞干脆或间接接触的东西细胞干脆或间接接触的东西都必需都必需 是无毒的。是无毒的。无无污染污染微生物的

11、污染不同细胞类型的交叉污染细菌细菌霉菌霉菌支原体支原体等等试验准备试验用品：试验用品：超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸酸缸CO2培育箱培育箱倒置显微镜倒置显微镜酶标仪、微孔板震荡器酶标仪、微孔板震荡器液氮罐液氮罐自动双重纯水蒸馏器，纯水仪自动双重纯水蒸馏器，纯水仪耗材：培育瓶，吸管，电动吸引器，培育板，耗材：培育瓶，吸管，电动吸引器，培育板，冻存管冻存管自动双重纯水蒸馏器 纯水仪滤器酶标仪 微孔板震荡器培 养 板 及瓶清洗清洗 在组织细胞培育中，体外细胞对任何有害物质都特在组织细胞培育中，体外细胞对任何有害物质都特在组织细胞培育中

12、，体外细胞对任何有害物质都特在组织细胞培育中，体外细胞对任何有害物质都特别敏感别敏感别敏感别敏感,均能影响培育细胞的生长均能影响培育细胞的生长均能影响培育细胞的生长均能影响培育细胞的生长 微生物产品附带杂物微生物产品附带杂物微生物产品附带杂物微生物产品附带杂物 上次细胞残留物上次细胞残留物上次细胞残留物上次细胞残留物 非养分成分的化学物质非养分成分的化学物质非养分成分的化学物质非养分成分的化学物质 须要清洗的培育用品须要清洗的培育用品须要清洗的培育用品须要清洗的培育用品 玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗 胶塞的清洗胶塞的清洗胶塞的清洗胶塞的清洗 塑料制品的清洗塑料制品的

13、清洗塑料制品的清洗塑料制品的清洗玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗 包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤 浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、流水冲浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、流水冲浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、流水冲浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、流水冲洗、洗、洗、洗、60 60 60 60烘干、酸泡（烘干、酸泡（烘干、酸泡（烘干、酸泡（24242424小时）、流水冲洗、小时）、流水冲洗、小时）、流水冲洗、小时）、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、6

14、0606060烘干烘干烘干烘干 清洗后的玻璃器皿清洗后的玻璃器皿清洗后的玻璃器皿清洗后的玻璃器皿 干净透亮无油迹干净透亮无油迹干净透亮无油迹干净透亮无油迹 不能残留任何物质不能残留任何物质不能残留任何物质不能残留任何物质浸泡：初次运用和培育运用后的玻璃器浸泡：初次运用和培育运用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉或被溶掉新的初次运用的玻璃器皿，在生产及运新的初次运用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等对细胞

15、有害的物质等先用自来水简洁刷洗，然后用先用自来水简洁刷洗，然后用5 5稀盐酸稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质再次运用的玻璃器皿则常附有大量刚运再次运用的玻璃器皿则常附有大量刚运用过的蛋白质，干固后不易洗掉用过的蛋白质，干固后不易洗掉用后马上浸入水中，要求完全浸入，不用后马上浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上能留有气泡或浮在液面上刷洗：刷洗：用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质着较牢的杂质 刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度 浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液中浸酸：

16、玻璃器皿浸泡到清洁液中 清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质用可除掉刷洗不掉的微量杂质 浸泡时器皿要充溢清洁液，勿留气泡或器皿露浸泡时器皿要充溢清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面出清洁液面 浸泡时间：一般为过夜，不应少于浸泡时间：一般为过夜，不应少于6 6 小时小时 清洁液清洁液 常用三种：重铬酸钾（常用三种：重铬酸钾（g g）浓硫酸）浓硫酸（mlml）蒸馏水（）蒸馏水（mlml）强清洁液强清洁液 631000200 631000200 次强清洗液次强清洗液 120 2001000 120 2001000 弱清洁液弱清洁液

17、100 1001000 100 1001000 配制时应留意平安，须穿戴耐酸手套和围裙，配制时应留意平安，须穿戴耐酸手套和围裙，并要爱护好面部及身体袒露部分并要爱护好面部及身体袒露部分 配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后渐渐配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后渐渐加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色清洁液一般为棕红色 冲洗冲洗 在运用后，刷洗及浸泡后都必需用水充在运用后，刷洗及浸泡后都必需用水充分冲洗。使之尽量不留污染或清洁液的分冲洗。使之尽量不留污染

18、或清洁液的残迹残迹 最好用洗涤装置最好用洗涤装置 如用手工操作如用手工操作 需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，最好用蒸馏水清洗倒干净，最好用蒸馏水清洗3-5 3-5 次，晾次，晾干备用干备用胶塞的清洗胶塞的清洗 新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理自来水冲洗，再做常规处理自来水冲洗，再做常规处理自来水冲洗，再做常规处理 常规清洗方法常规清洗方法常规清洗方法常规清洗方法 每次用后马上置入水中浸泡，用每次用后马

19、上置入水中浸泡，用每次用后马上置入水中浸泡，用每次用后马上置入水中浸泡，用2%NaOH 2%NaOH 2%NaOH 2%NaOH 或洗或洗或洗或洗衣粉煮沸衣粉煮沸衣粉煮沸衣粉煮沸10-20 10-20 10-20 10-20 分钟（以除掉培育中的蛋白质）分钟（以除掉培育中的蛋白质）分钟（以除掉培育中的蛋白质）分钟（以除掉培育中的蛋白质），自来水冲洗，蒸馏水冲洗，自来水冲洗，蒸馏水冲洗，自来水冲洗，蒸馏水冲洗，自来水冲洗，蒸馏水冲洗2-32-32-32-3次，晾干备用次，晾干备用次，晾干备用次，晾干备用塑料制品的清洗塑料制品的清洗 塑料制品现多是接受无毒并已经特殊处理的包装，打塑料制品现多是接受

20、无毒并已经特殊处理的包装，打塑料制品现多是接受无毒并已经特殊处理的包装，打塑料制品现多是接受无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品开包装即可用，多为一次性物品开包装即可用，多为一次性物品开包装即可用，多为一次性物品 必要时用必要时用必要时用必要时用2%NaOH 2%NaOH 2%NaOH 2%NaOH 浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用用用用5%5%5%5%盐酸溶液浸泡盐酸溶液浸泡盐酸溶液浸泡盐酸溶液浸泡30 30 30 30 分钟，最终用自来水和蒸馏水分钟，最终用自来水和蒸馏水分钟，最终

21、用自来水和蒸馏水分钟，最终用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用冲洗干净，晾干备用冲洗干净，晾干备用冲洗干净，晾干备用 本试验：本试验：本试验：本试验：自来水洗、蒸馏水洗、蒸馏水煮、甩干水、干自来水洗、蒸馏水洗、蒸馏水煮、甩干水、干自来水洗、蒸馏水洗、蒸馏水煮、甩干水、干自来水洗、蒸馏水洗、蒸馏水煮、甩干水、干燥、装盒；燥、装盒；燥、装盒；燥、装盒；消毒。消毒。消毒。消毒。消毒消毒 细胞培育的最大危急是发生培育物的细菌、细胞培育的最大危急是发生培育物的细菌、细胞培育的最大危急是发生培育物的细菌、细胞培育的最大危急是发生培育物的细菌、真菌和病毒等微生物的污染真菌和病毒等微生物的污染真菌和病毒等微生物

22、的污染真菌和病毒等微生物的污染 常见缘由：常见缘由：常见缘由：常见缘由：操作间或四周空间的不洁操作间或四周空间的不洁操作间或四周空间的不洁操作间或四周空间的不洁 培育器皿和培育液消毒不合格或不彻底培育器皿和培育液消毒不合格或不彻底培育器皿和培育液消毒不合格或不彻底培育器皿和培育液消毒不合格或不彻底 由于有关培育的每个环节的失误均能导致培由于有关培育的每个环节的失误均能导致培由于有关培育的每个环节的失误均能导致培由于有关培育的每个环节的失误均能导致培育失败，故细胞培育的每个环节都应严格遵育失败，故细胞培育的每个环节都应严格遵育失败，故细胞培育的每个环节都应严格遵育失败，故细胞培育的每个环节都应严

23、格遵守操作常规，防止发生污染守操作常规，防止发生污染守操作常规，防止发生污染守操作常规，防止发生污染消毒灭菌方法消毒灭菌方法 物理消毒灭菌法物理消毒灭菌法物理消毒灭菌法物理消毒灭菌法 紫外线：用于空气，操作台表面和不能运用其它紫外线：用于空气，操作台表面和不能运用其它紫外线：用于空气，操作台表面和不能运用其它紫外线：用于空气，操作台表面和不能运用其它法进行消毒的培育器皿，法进行消毒的培育器皿，法进行消毒的培育器皿，法进行消毒的培育器皿，30min30min30min30min 湿热（高压蒸气灭菌法）：湿热（高压蒸气灭菌法）：湿热（高压蒸气灭菌法）：湿热（高压蒸气灭菌法）：12112112112

24、1，20min20min20min20min 干烤：干烤：干烤：干烤：160,2 160,2 160,2 160,2 小时小时小时小时 过滤：过滤：过滤：过滤：0.22m0.22m0.22m0.22m 化学消毒灭菌法化学消毒灭菌法化学消毒灭菌法化学消毒灭菌法 70%70%70%70%酒精酒精酒精酒精 主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理的壁面处理的壁面处理的壁面处理 1111新洁尔灭新洁尔灭新洁尔灭新洁尔灭 主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试主要

25、用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒消毒消毒消毒 抗生素抗生素抗生素抗生素 主要用于培育用液灭菌或预防培育物污染主要用于培育用液灭菌或预防培育物污染主要用于培育用液灭菌或预防培育物污染主要用于培育用液灭菌或预防培育物污染细胞培育基应用选择细胞培育基应用选择选择培育基没有确定的标准，有几点建议可供参考：选择培育基没有确定的标准，有几点建议可供参考：(1(1）建立某种细胞株所用的培育基应当是培育这种细胞首选的培育）建立某种细胞株所用的培育基应当是培育这种细胞首选的培育基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时询问

26、。基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时询问。(2)(2)其它试验室惯用的培育基不妨一试，很多培育基可以适合多种其它试验室惯用的培育基不妨一试，很多培育基可以适合多种细胞。细胞。(3)(3)依据细胞株的特点、试验的须要来选择培育基。如小鼠细胞株依据细胞株的特点、试验的须要来选择培育基。如小鼠细胞株多选多选 RPMI1640 RPMI1640。(4)(4)用多种培育基培育目的细胞，视察其生长状态，可以用生长曲用多种培育基培育目的细胞，视察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标推断，依据试验结果选择最佳培育基，这是线、集落形成率等指标推断，依据试验结果选择最佳培育基，这是最客观的方法，但比较

27、繁琐。最客观的方法，但比较繁琐。常用的培育基种类常用的培育基种类RPMI-1640RPMI-1640（标准型）、（标准型）、DMEM-DMEM-高糖（标准型）、高糖（标准型）、DMEM-DMEM-低糖（标准型）低糖（标准型）、McCoys 5AMcCoys 5A、M199M199、F10F10等等 制备1000mlRPMI1640培育基RPMI1640干粉培育基10.4g（1包）蒸馏水400ml磁力搅拌至完全溶解加三蒸馏水定容至1000ml在超净台内无菌条件下，用灭菌后的并置有0.22m孔径滤膜的过滤器除菌，并分装成200ml/瓶，-20保存备用。用前取一瓶溶解，每200ml培育液加灭活的小牛

28、血清至终浓度为10%，即加22ml。再加青霉素和链霉素至终浓度各为100U/ml。-细胞培育液 胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分别。分别。分别。分别。胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过确定限胰蛋白

29、酶液浓度越高，作用越强，但超过确定限胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过确定限胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过确定限度会损伤细胞。度会损伤细胞。度会损伤细胞。度会损伤细胞。胰蛋白酶液消化时间：胰蛋白酶液消化时间：胰蛋白酶液消化时间：胰蛋白酶液消化时间：2-102-102-102-10分钟。分钟。分钟。分钟。用含血清培育液终止其对细胞的消化作用用含血清培育液终止其对细胞的消化作用用含血清培育液终止其对细胞的消化作用用含血清培育液终止其对细胞的消化作用 称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许D-D-Hanks Hanks 平衡盐溶液调成糊状，再补足平衡盐溶液调成糊状，

30、再补足D-D-Hanks Hanks 平衡盐溶液，搅拌混匀，置室温平衡盐溶液，搅拌混匀，置室温4 4 小小时或冰箱过夜，不断搅拌振荡时或冰箱过夜，不断搅拌振荡 次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中，装入瓶中，-20-20保存备用（以免分解失效）保存备用（以免分解失效），常用浓度为，常用浓度为0.25%0.25%（0.1%-0.5%0.1%-0.5%）胰蛋白酶溶液偏酸，运用前可用碳酸氢钠溶胰蛋白酶溶液偏酸，运用前可用碳酸氢钠溶液调液调pH pH 至至7.2 7.2 左右左右胰蛋白酶溶液配制胰蛋白酶溶液配制D-Hanks D-Hanks D-Hank

31、s D-Hanks 平衡盐溶液平衡盐溶液平衡盐溶液平衡盐溶液(D-Hanks Balanced Salt(D-Hanks Balanced Salt(D-Hanks Balanced Salt(D-Hanks Balanced Salt Solutions,D-HBSS)Solutions,D-HBSS)Solutions,D-HBSS)Solutions,D-HBSS)KClKClKClKCl0.40g0.40g0.40g0.40gKH2PO4KH2PO4KH2PO4KH2PO40.06g0.06g0.06g0.06gNaClNaClNaClNaCl8.00g8.00g8.00g8.00gN

32、aCO3NaCO3NaCO3NaCO30.35g0.35g0.35g0.35gNa2HPO4Na2HPO4Na2HPO4Na2HPO40.048g0.048g0.048g0.048gD-GlucoseD-GlucoseD-GlucoseD-Glucose1.00g1.00g1.00g1.00gPhenolRedPhenolRedPhenolRedPhenolRed0.01g0.01g0.01g0.01g血清血清 热灭活：热灭活：热灭活：热灭活：56,30 56,30 56,30 56,30 分钟加热已完全解冻的血清分钟加热已完全解冻的血清分钟加热已完全解冻的血清分钟加热已完全解冻的血清 热灭活

33、目的：灭活血清中的补体成分。假如不做细热灭活目的：灭活血清中的补体成分。假如不做细热灭活目的：灭活血清中的补体成分。假如不做细热灭活目的：灭活血清中的补体成分。假如不做细胞因子和免疫相关的试验，建议血清不要灭活。胞因子和免疫相关的试验，建议血清不要灭活。胞因子和免疫相关的试验，建议血清不要灭活。胞因子和免疫相关的试验，建议血清不要灭活。因为热处理睬造成血清沉淀物显著增多，还会因为热处理睬造成血清沉淀物显著增多，还会因为热处理睬造成血清沉淀物显著增多，还会因为热处理睬造成血清沉淀物显著增多，还会影响血清的质量。灭活后严峻影响细胞生长速度，影响血清的质量。灭活后严峻影响细胞生长速度，影响血清的质量

34、。灭活后严峻影响细胞生长速度，影响血清的质量。灭活后严峻影响细胞生长速度，且细胞贴壁率降低。且细胞贴壁率降低。且细胞贴壁率降低。且细胞贴壁率降低。血清中的沉淀物血清中的沉淀物血清中的沉淀物血清中的沉淀物 絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心可用离心可用离心可用离心3000rp

35、m,5 3000rpm,5 3000rpm,5 3000rpm,5 分钟去除，也可不用处理分钟去除，也可不用处理分钟去除，也可不用处理分钟去除，也可不用处理 显微镜下显微镜下显微镜下显微镜下“小黑点小黑点小黑点小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀：经过热处理过的血清，沉淀：经过热处理过的血清，沉淀：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下视察物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下视察物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下视察物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下视察象象象象“小黑点小黑点小黑点小黑点”，常误认为血清受污染。一般状况下，常误认为血清受污染。一般状况下，

36、常误认为血清受污染。一般状况下，常误认为血清受污染。一般状况下，此小黑点不会影响细胞生长，但假如怀疑血清质量，此小黑点不会影响细胞生长，但假如怀疑血清质量，此小黑点不会影响细胞生长，但假如怀疑血清质量，此小黑点不会影响细胞生长，但假如怀疑血清质量，则应马上停止运用，更换另一批号的血清则应马上停止运用，更换另一批号的血清则应马上停止运用，更换另一批号的血清则应马上停止运用，更换另一批号的血清血清质量好坏是试验成败的关键。常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透亮，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消退补体活性）：

37、56，30分钟血清的消毒：过滤除菌EDTA4Na EDTA4Na 溶液溶液 一种化学螯合剂，对细胞有确定的离散作一种化学螯合剂，对细胞有确定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，运用便利用，而且毒性小，价格低廉，运用便利 常用工作液浓度为常用工作液浓度为0.02%0.02%。留意：运用留意：运用EDTA EDTA 处理细胞后，要用平衡处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的盐液冲洗干净，因残留的EDTA EDTA 会影响细会影响细胞生长胞生长 EDTA EDTA 溶液配制：用溶液配制：用D-Hanks D-Hanks 平衡盐溶平衡盐溶液溶解后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶，液溶解后，高压蒸汽灭菌，分

38、装成小瓶，44冰箱保存冰箱保存消化液消化液 分别组织和分散细胞分别组织和分散细胞 常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠钠(EDTA)(EDTA)两种溶液两种溶液 单独或混合运用单独或混合运用pH pH 调整液调整液 NaHCO3 NaHCO3 NaHCO3 NaHCO3 溶液溶液溶液溶液 常用浓度为常用浓度为常用浓度为常用浓度为7.5%7.5%7.5%7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤。配制时用三蒸水溶解后，过滤。配制时用三蒸水溶解后，过滤。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压灭菌，分装，除菌或高压灭菌，分装，除菌或高压灭菌，分装，除菌或高压灭菌，分装，4444

39、保存保存保存保存 HEPESHEPESHEPESHEPES（分子量（分子量（分子量（分子量238.31238.31238.31238.31）溶液）溶液）溶液）溶液 一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒性细胞无毒性细胞无毒性细胞无毒性 主要作用主要作用主要作用主要作用:防止培育基防止培育基防止培育基防止培育基pHpHpHpH快速变动。在开放式培育快速变动。在开放式培育快速变动。在开放式培育快速变动。在开放式培育条件下，视察细胞时培育基脱离了条件下，视察细胞时

40、培育基脱离了条件下，视察细胞时培育基脱离了条件下，视察细胞时培育基脱离了5%CO25%CO25%CO25%CO2的环境，的环境，的环境，的环境，CO2CO2CO2CO2气体快速逸出，气体快速逸出，气体快速逸出，气体快速逸出，pHpHpHpH快速上升，若加了快速上升，若加了快速上升，若加了快速上升，若加了HEPESHEPESHEPESHEPES，此时可以维持此时可以维持此时可以维持此时可以维持pH7.0pH7.0pH7.0pH7.0左右。一般在进行克隆化培育左右。一般在进行克隆化培育左右。一般在进行克隆化培育左右。一般在进行克隆化培育时要添加时要添加时要添加时要添加HEPESHEPESHEPES

41、HEPES 运用终浓度一般为运用终浓度一般为运用终浓度一般为运用终浓度一般为10-50mmol/L10-50mmol/L10-50mmol/L10-50mmol/L 常配成常配成常配成常配成1M 1M 1M 1M 储存液：用储存液：用储存液：用储存液：用20ml 20ml 20ml 20ml 双蒸水溶解双蒸水溶解双蒸水溶解双蒸水溶解4.764.764.764.76克克克克HEPESHEPESHEPESHEPES，过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，4444保保保保存。运用时可向存。运用时可向存。运用时可向存。运

42、用时可向100ml100ml100ml100ml培育液中加入培育液中加入培育液中加入培育液中加入2ml HEPES2ml HEPES2ml HEPES2ml HEPES浓浓浓浓缩液，终浓度为缩液，终浓度为缩液，终浓度为缩液，终浓度为20mmol/L 20mmol/L 20mmol/L 20mmol/L 抗菌素的运用：在培育液配制后，培育液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。通常是青霉素和链霉素联合运用。培育基内青霉素、链霉素最终运用浓度为每毫升100单位。庆大霉素：每毫升100单位便利、广谱、稳定器材和液体的准备器材和液体的准备 细胞培育用的玻璃器材细胞培育用的玻璃器材细胞培育用的玻

43、璃器材细胞培育用的玻璃器材 培育瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒中，培育瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒中，培育瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒中，培育瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒中，160160160160，2 2 2 2小时干烤或小时干烤或小时干烤或小时干烤或15151515磅，磅，磅，磅，121121121121，20202020分钟蒸气灭菌后分钟蒸气灭菌后分钟蒸气灭菌后分钟蒸气灭菌后备用备用备用备用 手术器材、瓶塞、配制好的手术器材、瓶塞、配制好的手术器材、瓶塞、配制好的手术器材、瓶塞、配制好的PBSPBSPBSPBS液液液液 15151515磅，磅

44、，磅，磅，121121121121，20202020分钟蒸气灭菌分钟蒸气灭菌分钟蒸气灭菌分钟蒸气灭菌 MEMMEMMEMMEM培育液、小牛血清、消化液培育液、小牛血清、消化液培育液、小牛血清、消化液培育液、小牛血清、消化液 用用用用G6G6G6G6滤器负压抽滤后备用滤器负压抽滤后备用滤器负压抽滤后备用滤器负压抽滤后备用完全培育基的组成基础培育基80一95血清5一20碳酸氢钠2.0g/L青、链霉素各100卑位毫升无菌操作中的留意事项无菌操作中的留意事项 在无菌操作中，确定要保持工作区的无菌清洁在无菌操作中，确定要保持工作区的无菌清洁在无菌操作中，确定要保持工作区的无菌清洁在无菌操作中，确定要保持

45、工作区的无菌清洁 操作前无菌室及无菌操作台以紫外灯照射操作前无菌室及无菌操作台以紫外灯照射操作前无菌室及无菌操作台以紫外灯照射操作前无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60 30-60 30-60 30-60 分钟灭菌，以分钟灭菌，以分钟灭菌，以分钟灭菌，以70%ethanol 70%ethanol 70%ethanol 70%ethanol 擦拭无菌操作抬面，擦拭无菌操作抬面，擦拭无菌操作抬面，擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转并开启无菌操作台风扇运转并开启无菌操作台风扇运转并开启无菌操作台风扇运转10 10 10 10 分钟分钟分钟分钟 操作时，当心取用无菌之试验物品，避开造成操作

46、时，当心取用无菌之试验物品，避开造成操作时，当心取用无菌之试验物品，避开造成操作时，当心取用无菌之试验物品，避开造成污染。勿碰触吸管尖头部或容器瓶口，亦不要污染。勿碰触吸管尖头部或容器瓶口，亦不要污染。勿碰触吸管尖头部或容器瓶口，亦不要污染。勿碰触吸管尖头部或容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作试验。容器打开后，在打开之容器正上方操作试验。容器打开后，在打开之容器正上方操作试验。容器打开后，在打开之容器正上方操作试验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45454545角取用角取用角取用角取用 在整个无菌操作过程中都应当在酒精灯的四周在整个无菌操作过程中都应当在酒精灯的四周在整个无菌操作过程中都应当在酒精灯的四周在整个无菌操作过程中都应当在酒精灯的四周进行进行进行进行