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1、第三章第三章 动植物细胞培育产酶动植物细胞培育产酶 与微生物细胞相比，动物细胞与微生物细胞相比，动物细胞和植物细胞具有各自不同的特性，和植物细胞具有各自不同的特性，需接受各自不同的培育工艺。需接受各自不同的培育工艺。一、植物细胞培育产酶一、植物细胞培育产酶 全世界用其制备自然芳香化合物全世界用其制备自然芳香化合物的价值超过的价值超过1515亿亿/年；年；美国用其生产药物超过美国用其生产药物超过3030亿亿/年；年；我国运用的中草药及其制备大部我国运用的中草药及其制备大部分来自植物；分来自植物；主要生产色素、药物、香精、酶主要生产色素、药物、香精、酶等次级代谢物。等次级代谢物。酶酶 植物细胞植物
2、细胞 糖苷酶糖苷酶 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 漆酶漆酶 过氧化物酶过氧化物酶-葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶 酸性转化酶酸性转化酶 碱性转化酶碱性转化酶 糖化酶糖化酶 木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶 苯丙氨酸氨裂合酶苯丙氨酸氨裂合酶 胡萝卜细胞胡萝卜细胞 紫苜宿细胞紫苜宿细胞 假挪威槭细胞假挪威槭细胞 甜菜细胞甜菜细胞 利马豆细胞利马豆细胞 甜菜细胞甜菜细胞 甜菜细胞甜菜细胞 甜菜细胞甜菜细胞 木瓜细胞木瓜细胞 花生细胞花生细胞 植物细胞发酵产酶植物细胞发酵产酶在细胞膜外，由纤维在细胞膜外，由纤维素构成。功能：素构成。功能：1.1.支支持细胞，使它有固定持细胞，使它有固定形态。形态。2.2.爱护细胞爱护细胞 叶绿体
3、：叶绿体：内内有叶有叶绿素，绿素，进行光进行光合行用合行用 植物细胞通常有植物细胞通常有较大的液泡较大的液泡 1.1.植物细胞培育植物细胞培育 植物细胞培育是指在离植物细胞培育是指在离体条件下，将愈伤组体条件下，将愈伤组织或其它易分散的组织或其它易分散的组织置于液体培育基中织置于液体培育基中进行振荡培育，得到进行振荡培育，得到分散成游离的悬浮细分散成游离的悬浮细胞，通过继代培育增胞，通过继代培育增殖，获得大量细胞的殖，获得大量细胞的一种技术。一种技术。植物细胞具有的特性植物细胞具有的特性细胞大，细胞壁以纤维素为主要成分，抗剪切细胞大，细胞壁以纤维素为主要成分，抗剪切实力低；实力低；生长速率慢，
4、为防止培育过程中染菌，需加抗生长速率慢，为防止培育过程中染菌，需加抗生素；生素；细胞培育需氧，而培育液粘度大，且不能强力细胞培育需氧，而培育液粘度大，且不能强力通风搅拌；通风搅拌；产物在细胞内且产量低；产物在细胞内且产量低；细胞常生长成各种大小的团块，增加了悬浮培细胞常生长成各种大小的团块，增加了悬浮培育的难度等。育的难度等。二、植物细胞培育的特点二、植物细胞培育的特点例如：紫草宁的生产，发例如：紫草宁的生产，发酵细胞中的紫草宁比紫草酵细胞中的紫草宁比紫草根中高根中高1010倍。倍。紫草宁的结构紫草宁的结构（1 1）提高产率）提高产率（2 2）缩短周期）缩短周期发酵周期发酵周期10103030
5、天，种植周期几个月几年。天，种植周期几个月几年。（3 3）易于管理）易于管理减低劳动强度；不受地理环境和气候条件等影减低劳动强度；不受地理环境和气候条件等影响。响。（4 4）提高产品质量）提高产品质量主要产物浓度高，易于分别纯化，削减环境中主要产物浓度高，易于分别纯化，削减环境中各种有害物质污染和侵蚀。各种有害物质污染和侵蚀。（5 5）其它）其它设计植物细胞生物反应器和限制工艺条件时应设计植物细胞生物反应器和限制工艺条件时应留意一些问题。留意一些问题。三、植物细胞培育的工艺条件及其限制三、植物细胞培育的工艺条件及其限制（一）植物细胞培育的工艺流程（一）植物细胞培育的工艺流程外植体外植体细胞细胞
6、的获的获取取细胞细胞培养培养分离分离纯化纯化产物产物1、外植体的选择与处理、外植体的选择与处理外植体是指从植株取出，经过预处理后，用于植物组织外植体是指从植株取出，经过预处理后，用于植物组织和细胞培育的植物组织（包括根、茎、叶、芽、花、果和细胞培育的植物组织（包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等）的片段或小块；实、种子等）的片段或小块；选择无病虫害、生长旺盛的植株；选择无病虫害、生长旺盛的植株；切成小块，消毒，漂洗切成小块，消毒，漂洗水稻的外植体（幼胚）水稻的外植体（幼胚）2、植物细胞的获得、植物细胞的获得（）干脆分别法：通常有机械法、酶解法；（）干脆分别法：通常有机械法、酶解法；机械法机械法
7、具体做法：具体做法：将叶片轻轻研碎、过滤离心、收集净化将叶片轻轻研碎、过滤离心、收集净化从未分化的疏松易碎的愈伤组织，通过摇床从未分化的疏松易碎的愈伤组织，通过摇床振荡获得分散的单细胞或小细胞团振荡获得分散的单细胞或小细胞团优点：优点：细胞不受酶损害；有利于进行细胞的生理和细胞不受酶损害；有利于进行细胞的生理和生化探讨。生化探讨。n酶解法酶解法n酶对细胞壁有确定的软化作用，所酶对细胞壁有确定的软化作用，所以接受酶法时，必需加入甘露醇等以接受酶法时，必需加入甘露醇等渗透压爱护剂。渗透压爱护剂。n优点优点n可获得较多的叶肉游离细胞（但对可获得较多的叶肉游离细胞（但对禾本科植物叶片效果不好）。禾本科
8、植物叶片效果不好）。2、植物细胞的获得、植物细胞的获得（）干脆分别法，有机械法、酶解法；（）干脆分别法，有机械法、酶解法；（）愈伤组织诱导法；（）愈伤组织诱导法；（）原生质体再生法（）原生质体再生法愈伤组织：愈伤组织：将上述外植体植入诱导培育基中，于将上述外植体植入诱导培育基中，于2525左右培育一段时间，从外植体的切口左右培育一段时间，从外植体的切口部位长出小细胞团。部位长出小细胞团。水稻的愈伤组织（幼胚）水稻的愈伤组织（幼胚）1 1、植物细胞培育基的特点、植物细胞培育基的特点（1 1）须要大量无机盐，除）须要大量无机盐，除P P、S S、K K、CaCa、MgMg外，外，还需还需B B、M
9、nMn、ZnZn、MoMo、CuCu、CoCo、I I（2 2）须要多种维生素和植物生长激素，如硫）须要多种维生素和植物生长激素，如硫胺素、吡哆素、烟酸、肌醇、分裂素等。胺素、吡哆素、烟酸、肌醇、分裂素等。（3 3）一般为无机氮源。）一般为无机氮源。（4 4）一般以蔗糖为碳源。）一般以蔗糖为碳源。（二）植物细胞培育的培育基（二）植物细胞培育的培育基2.2.几种常用的植物细胞培育基几种常用的植物细胞培育基几种常见的培育基是：几种常见的培育基是：MSMS、B5B5、WhiteWhite等。等。3 3、植物细胞培育基的配制、植物细胞培育基的配制（三）温度的限制室温（三）温度的限制室温（2525）（四
10、）（四）pHpH值的限制值的限制 微酸性（微酸性（pH5pH56 6）（五）溶解氧的调整限制（五）溶解氧的调整限制代谢慢，耗氧少，对剪切力敏感，搅拌不宜猛烈。代谢慢，耗氧少，对剪切力敏感，搅拌不宜猛烈。（六）光照的限制（六）光照的限制（七）前体的添加提高次级代谢物的产量。（七）前体的添加提高次级代谢物的产量。（八）刺激剂（八）刺激剂(electior)(electior)的应用的应用强化次级代谢产物的生物合成。常用微生物细胞强化次级代谢产物的生物合成。常用微生物细胞壁碎片和胞外酶。壁碎片和胞外酶。四、植物细胞培育产酶的工艺过程四、植物细胞培育产酶的工艺过程SOD是生物体内清除超氧化物阴是生物体
11、内清除超氧化物阴离子自由基离子自由基(O 2)的重要金属酶的重要金属酶类。它和过氧化氢酶、过氧化物酶类。它和过氧化氢酶、过氧化物酶一起构成了生物体内重要的酶促反一起构成了生物体内重要的酶促反应防卫体系，从而维护生物体内细应防卫体系，从而维护生物体内细胞正常的生理代谢和生化反应。苍胞正常的生理代谢和生化反应。苍老自由基学说认为苍老源于机体正老自由基学说认为苍老源于机体正常代谢过程中产生过量的自由基对常代谢过程中产生过量的自由基对机体损害的结果。超氧化物歧化酶机体损害的结果。超氧化物歧化酶(SOD)作为能催化超氧阴离子发生作为能催化超氧阴离子发生歧化反应的自由基清除剂，具有延歧化反应的自由基清除剂
12、，具有延缓苍老的作用。缓苍老的作用。天瑞天瑞SOD苹果苹果 以大蒜细胞培育生产超氧化物歧化酶（以大蒜细胞培育生产超氧化物歧化酶（SOD）为例）为例(1)(1)大蒜愈伤组织的诱导大蒜愈伤组织的诱导 选取牢固、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外选取牢固、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用皮，先用70%70%乙醇消毒乙醇消毒20s20s，再用，再用0.1%0.1%升汞消毒升汞消毒10min10min，然后无菌水漂洗然后无菌水漂洗3 3次。次。在无菌条件下，切成在无菌条件下，切成0.5cm30.5cm3的小块，植入含有的小块，植入含有3mg/L 2,4-D3mg/L 2,4-D和和1.2mg/L
13、6-BA 1.2mg/L 6-BA 的半固体的半固体MSMS培育基中，培育基中，在在2525，600lux600lux，12h/d12h/d光照条件下培育光照条件下培育18d18d，诱导得，诱导得到愈伤组织，每到愈伤组织，每1818天继代一次。天继代一次。(2)(2)大蒜悬浮细胞培育大蒜悬浮细胞培育 将上述在半固体将上述在半固体MSMS培育基上培育培育基上培育18d18d的愈伤组织，在无菌条件下转入含有的愈伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D3mg/L 2,4-D和和 1.2mg/L 6-BA 1.2mg/L 6-BA（苄基腺（苄基腺嘌呤）嘌呤）的液体的液体MSMS培育基中，加入
14、灭菌的培育基中，加入灭菌的玻璃珠，玻璃珠，2525，600lux600lux，12h/d12h/d光照条件光照条件下震荡培育下震荡培育18d18d，使愈伤组织分散成为小，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。细胞团或单细胞。然后在无菌条件下，经过筛网将小然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有细胞团或单细胞转入含有3mg/L 2,4-D3mg/L 2,4-D和和1.2mg/L 6-BA 1.2mg/L 6-BA 的液体的液体MSMS培育基中，培育基中，25,600lux25,600lux，12h/d12h/d光照条件下震荡培光照条件下震荡培育育18d18d。(3)(3)酶的分别纯化酶
15、的分别纯化 细胞培育完成后，收集细胞，经过细胞培育完成后，收集细胞，经过细胞裂开、提取、分别得到超氧化物歧细胞裂开、提取、分别得到超氧化物歧化酶。化酶。二、动物细胞培育产酶二、动物细胞培育产酶 动物细胞可产生较高价值的物质动物细胞可产生较高价值的物质,特特殊是激素、疫苗，单克隆抗体和酶等动殊是激素、疫苗，单克隆抗体和酶等动物功能蛋白。物功能蛋白。动物细胞模式图一、动物细胞的特性一、动物细胞的特性（1 1）无细胞壁）无细胞壁,脆弱脆弱;（2 2）体积比微生物细胞大几千倍）体积比微生物细胞大几千倍,稍小于稍小于植物细胞植物细胞;（3 3）具有群体效应、锚地依靠性、接触抑）具有群体效应、锚地依靠性、
16、接触抑制性、功能全能性；制性、功能全能性；（4 4）养分要求困难。）养分要求困难。二、动物细胞培育的特点二、动物细胞培育的特点（1 1）主要用于生产各种功能蛋白）主要用于生产各种功能蛋白质；质；（2 2）生长缓慢；）生长缓慢；（3 3）需加抗生素防污染；）需加抗生素防污染；（4 4）细胞体积大，无细胞壁爱护，）细胞体积大，无细胞壁爱护，对剪切力敏感；对剪切力敏感；（5 5）具锚地依靠性，宜贴壁培育；）具锚地依靠性，宜贴壁培育；部分用悬浮培育；部分用悬浮培育；（6 6）培育基成分困难，反应过程）培育基成分困难，反应过程成本高，产品价格贵成本高，产品价格贵 ；（7 7）原代细胞培育）原代细胞培育5
17、050代后，即会代后，即会退化死亡，须要重新分别细胞。退化死亡，须要重新分别细胞。三、动物细胞培育的方式三、动物细胞培育的方式来自血液、淋巴组织的来自血液、淋巴组织的细胞、肿瘤细胞、杂交细胞、肿瘤细胞、杂交瘤细胞等非锚定依靠性瘤细胞等非锚定依靠性细胞接受。细胞接受。类似于微生物细胞的深类似于微生物细胞的深层发酵，但工艺条件有层发酵，但工艺条件有较大差别。较大差别。杂交瘤细胞悬浮培育杂交瘤细胞悬浮培育（一）悬浮培育（一）悬浮培育细胞悬浮培育法的优点细胞悬浮培育法的优点n可连续收集部分细胞进行移植继代培育，可连续收集部分细胞进行移植继代培育，传代时无需消化分散，免遭酶类、传代时无需消化分散，免遭酶
18、类、EDTAEDTA及机械损害。及机械损害。n细胞收率高，并可连续测定细胞浓度，细胞收率高，并可连续测定细胞浓度，还有可能实现大规模干脆克隆培育。还有可能实现大规模干脆克隆培育。留意事项留意事项n培育过程中，为确保细胞呈单颗粒匀整悬浮状态，培育过程中，为确保细胞呈单颗粒匀整悬浮状态，需接受搅拌或气升式反应器，以较低搅拌速度及需接受搅拌或气升式反应器，以较低搅拌速度及确定速度通入含确定速度通入含5 5CO2CO2的无菌空气，保持细胞悬的无菌空气，保持细胞悬浮态并维持培育液溶解氧。浮态并维持培育液溶解氧。n此外不同细胞悬浮条件亦异，为使细胞不致凝集、此外不同细胞悬浮条件亦异，为使细胞不致凝集、成团
19、或沉淀，在配制培育基的基础盐溶液中不加成团或沉淀，在配制培育基的基础盐溶液中不加钙和镁离子。间歇或连续更换部分培育液，可维钙和镁离子。间歇或连续更换部分培育液，可维持持pHpH值，若运用值，若运用HEPESHEPES缓冲盐溶液时尚可不必连续缓冲盐溶液时尚可不必连续通入含通入含5 5CO2CO2空气。空气。大多数动物细胞，接受大多数动物细胞，接受:（1 1）滚瓶培育系统）滚瓶培育系统:结构简洁结构简洁,重现性好重现性好;（二）贴壁培育（二）贴壁培育将动物细胞吸附于微载体表面，在培育液中进行将动物细胞吸附于微载体表面，在培育液中进行悬浮培育，使细胞在微载体表面长成单层的培育悬浮培育，使细胞在微载体
20、表面长成单层的培育方法称为微载体培育法。方法称为微载体培育法。由葡聚糖凝胶制成微球由葡聚糖凝胶制成微球,动物细胞依附其上单层生动物细胞依附其上单层生长繁殖长繁殖,悬浮于培育液中悬浮于培育液中;特点特点:比表面积大比表面积大,单位体积培育液细胞产率高单位体积培育液细胞产率高;具具有悬浮培育的优点。有悬浮培育的优点。（2 2）微载体系统）微载体系统:制备微载体的材料主要有：制备微载体的材料主要有：n葡聚糖（葡聚糖（DEAESephadex ADEAESephadex A5050及及A A25 25）n塑料塑料n明胶明胶n玻璃玻璃n纤维素纤维素 四、动物细胞培育的工艺条件及其限制四、动物细胞培育的工
21、艺条件及其限制n种质细胞：体细胞、杂交瘤细胞；种质细胞：体细胞、杂交瘤细胞；n工艺过程：工艺过程：种质种质细胞细胞胰蛋白酶胰蛋白酶悬浮悬浮细胞细胞悬浮培悬浮培育或贴育或贴壁培育壁培育收集培收集培育液、育液、分别纯分别纯化化（一）动物细胞培育基组成成分（一）动物细胞培育基组成成分1 1、氨基酸：各种必需氨基酸，谷氨酰胺等，、氨基酸：各种必需氨基酸，谷氨酰胺等，作为碳源和能源利用；作为碳源和能源利用；2 2、维生素：血清中，、维生素：血清中，B B族和维族和维C C；3 3、无机盐：调整渗透压；、无机盐：调整渗透压；4 4、葡萄糖：作为碳源和能源；、葡萄糖：作为碳源和能源；5 5、激素：胰岛素、生
22、长激素、氢化可的松；、激素：胰岛素、生长激素、氢化可的松；6 6、生长因子：如表皮生长因子、神经生长、生长因子：如表皮生长因子、神经生长 因子、成纤维细胞生长因子。因子、成纤维细胞生长因子。（二）动物细胞培育基的配制（二）动物细胞培育基的配制n首先配制各类母液，运用前混合过滤除菌，运首先配制各类母液，运用前混合过滤除菌，运用时稀释至所需浓度；用时稀释至所需浓度；n各种动物培育基已商品化。各种动物培育基已商品化。（三）（三）温度的限制温度的限制一般限制在一般限制在36.5;36.5;温度也会影响温度也会影响pHpH值。值。（四）（四）pHpH值的限制值的限制n一般限制在一般限制在pH7.0pH7
23、.07.6;7.6;n培育过程中须要对培育过程中须要对pHpH值进行监测和调整；值进行监测和调整；n接受接受CO2CO2和和NaHCO3NaHCO3溶液调整溶液调整:需留意溶解氧的限制；流加酸需留意溶解氧的限制；流加酸碱液；碱液；n加入缓冲系统；加入缓冲系统；n监测指示剂为酚红。监测指示剂为酚红。（五）渗透压的限制（五）渗透压的限制培育液渗透压应与细胞内的渗透压处于等渗状态。培育液渗透压应与细胞内的渗透压处于等渗状态。（六）溶解氧的限制（六）溶解氧的限制溶解氧的供应对动物细胞培育至关重要；溶解氧的供应对动物细胞培育至关重要；接受调整混合气体的量与比例的方法。接受调整混合气体的量与比例的方法。五
24、、动物细胞培育产酶的工艺过程五、动物细胞培育产酶的工艺过程以人黑色素瘤细胞培育生产组织纤溶酶原活化以人黑色素瘤细胞培育生产组织纤溶酶原活化剂剂(tPA)(tPA)为例：为例：tPAtPA是一种丝氨酸蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶,可以催化纤溶酶原水可以催化纤溶酶原水解，生成纤溶酶解，生成纤溶酶;纤溶酶催化血栓中的血纤维纤溶酶催化血栓中的血纤维蛋白水解，对血栓性疾病有显著疗效。蛋白水解，对血栓性疾病有显著疗效。生产组织纤溶酶原活化剂的工艺过程生产组织纤溶酶原活化剂的工艺过程、人黑色素瘤细胞培育基；、人黑色素瘤细胞培育基；、人黑色素瘤细胞培育；、人黑色素瘤细胞培育；、组织纤溶酶原激活剂的分别纯化。、组织
25、纤溶酶原激活剂的分别纯化。动、植物细胞培育与微生物培育区分动、植物细胞培育与微生物培育区分n动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固体或半固体的表面才能生长；对养分要求严格，除氨体或半固体的表面才能生长；对养分要求严格，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需有血基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需有血清。动物细胞对环境敏感，包括清。动物细胞对环境敏感，包括pHpH、溶氧、温度、剪、溶氧、温度、剪切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监测切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监测和限制。和限制。n植物细胞对养分要求较动物细
26、胞简洁。但由于植物细植物细胞对养分要求较动物细胞简洁。但由于植物细胞培育一般要求在高密度下才能得到确定浓度的培育胞培育一般要求在高密度下才能得到确定浓度的培育产物，以及植物细胞生长较微生物要缓慢，长时间的产物，以及植物细胞生长较微生物要缓慢，长时间的培育对无菌要求及反应器的设计也提出特殊的要求。培育对无菌要求及反应器的设计也提出特殊的要求。三者之间的差异主要有：三者之间的差异主要有：植物细胞植物细胞动物细胞动物细胞微生物细胞。微生物细胞。动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。长。植物细胞和微生物细胞的养分要求较简洁。植物细胞和微生物细胞的养分要求较简洁。植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求确定的光照。求确定的光照。植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。植物、微生物和动物细胞的主要目的产物植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。各不相同。