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1、选修 1生物技术实践学问点归纳试验 1大肠杆菌的培育和分别1. 微生物是指构造简洁、形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞构造的低等生物，包括病毒、原核 生物、原生生物和某些真菌。细菌是单细胞的原核生物，有细胞壁肽聚糖、细胞膜、细胞质， 无成型的细胞核，只有一环状DNA 分子拟核。以分裂二分裂的方式生殖，分裂速度很快。 用革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性菌革兰氏染液染色后，再脱色处理，细菌仍保存染色液的 颜色和革兰氏阴性菌两大类，区分在细胞壁的成分不同。大肠杆菌是革兰氏阴性细胞壁薄，有荚膜、兼性厌氧的肠道杆菌。2. 细菌的分别方法有两种：划线分别法和涂布分别法。是消退污染杂菌的通用方法，也是用于筛
2、选 高表达量菌株的最简便方法之一。划线分别就是用接种环蘸菌液后在含有固体培育基的培育皿平板上划线，在划线的过程中菌液渐渐削减，细菌也渐渐削减，。划线最终，可使细菌间的距离加大。 将接种后的固体培育基培育 1020 小时后，一个细菌细胞就会生殖成很多细菌细胞，形成菌落， 不会重叠。在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是有一个细菌产生的后代。用于基因工程的大肠杆 菌的工程菌，可以用划线分别法获得产物表达力气高的菌株。由于工程菌的质粒中通常有抗性基因如抗氨苄青霉素基因，如在培育基中参与确定量的氨苄青霉素，由于非工程菌的其他杂菌都没有抗性基因，所以在划线后只有存在抗性基因的工程菌能生存下来。涂布分别时，需
3、要先将培育的菌液稀释，通常稀释到 10-510-7 之间，然后去 0.1ml 不同稀释度的稀释菌液放在培育皿的固体培育基上，用玻璃刮刀涂布在培育基平面上进展培育，在适当的稀释度 下，可产生相互分开的菌落。通常每个培育皿中有20 个以内的单菌落为最适宜。将每个菌落分别接种在斜面上扩增培育后，再做功能性试验。划线分别法，方法简洁；涂布分别法，单菌落更易分开，但操作简洁。3. 在培育微生物时，必需进展无菌操作。其首要条件是各种器皿必需是无菌的，各种培育基也必需 是无菌的，转移培育基、倒平板、接种、平板划线、平板稀释涂布等操作中的每一步都要做到无菌防止杂菌污染。进展恒温培育时，要将培育皿倒置，是由于培
4、育基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培育皿会使水蒸气分散成水滴后，落入培育基的外表并且集中，菌落中的细菌也会随水 集中，菌落见相互影响，很难在分成单菌落，达不到分别的目的。4. 细菌扩大培育要用LB 液体培育基通用培育基、常用于做生理学争论和发酵工业，划线分别要用 LB 固体培育基常用于微生物分别、鉴定、计数和菌种保存。“细菌喜荤，霉菌喜素”，通常细菌培育基要用蛋白胨和酵母提取物来配制，还要参与确定的氯化钠，以维持确定的渗透压；霉菌培 养基一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可。尽管培育基的配方各不一样，但其根本成分都一 样五类。人及动物的养分物质：水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类
5、； 植物的养分物质：矿质元素、水、二氧化碳等三类；微生物的养分物质：水、无机盐、碳源、氮源及生长因子等五类。4. 无菌技术（1） 获得纯洁培育物的关键是防止外来杂菌的入侵，要留意以下几个方面：对试验操作的空间、操作者的衣着和手，进展清洁和消毒。将用于微生物培育的器皿、接种用具和培育基等器具进展灭菌。为避开四周环境中微生物的污染，试验操作应在酒精灯火焰四周进展。试验操作时应避开已经灭菌处理的材料用具与四周的物品相接触。（2） 消毒与灭菌的区分消毒指使用较为温存的物理或化学方法仅杀死物体外表或内部一局部对人体有害的微生物不包括 芽孢和孢子。消毒方法常用煮沸消毒法，还有化学药剂如酒精、氯气、石炭酸等
6、消毒、红外线消毒。 灭菌则是指使用猛烈的理化因素杀死物体内外全部的微生物，包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。5. 培育基（1） 培育基可分为液体培育基和固体培育基依据物理性质。在液体培育基中参与凝固剂琼脂后 ，制成琼脂固体培育基。微生物在固体培育基外表生长，可以形成肉眼可见的菌落。依据菌落的特 征可以推断是哪一种菌。（2） 各种培育基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐四种养分物质。满足微生物生长还需要适宜的 pH、氧气的要求依据微生物的需求供给有氧或无氧环境、特别养分物质等。碳源：能为微生物的代谢供给碳元素的物质。如 CO 、NaHCO 等无机碳源；糖类、蛋白质、脂肪等
7、23有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。氮源：能为微生物的代谢供给氮元素的物质。如N 、NH 、NO -、蛋白质、氨基酸等。只有固氮微生233物才能利用N 。2（3） 培育基配制的原则：目的要明确、PH 值要适宜、养分要协调和要经济节约。试验 4果汁中的果胶和果胶酶1. 果胶是植物细胞壁的以及胞间层的主要成分之一，由半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯组成。下面是果胶的构造式：山楂的果实中果胶含量最多，煮沸的山楂泥可制成山楂糕，就是由于果胶的作用。果胶起着将植物细胞粘合在一起的作用，去掉果胶，就会使植物组织变得松散。果胶不溶于乙醇，这是鉴别果胶的一种简易方法。2. 果胶是植物细胞壁
8、和胞间层的主要组成成分之一。在果汁加工中，果胶的存在易导致果汁出汁率 低，果汁浑浊。果胶酶分解果胶的作用是：瓦解植物的细胞壁及胞间层，使榨取果汁更简洁； 把果胶分解为可溶性的半乳糖醛酸，使浑浊的果汁变得澄清，因此可以解决果汁加工中消灭的问题。 果胶酶是一类酶的总称，包括：多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶和果胶酯酶。在植物细胞工程中果 胶酶的作用是与纤维素酶一起除去植物细胞的细胞壁。试验 5加酶洗衣粉的使用条件和效果1. 洗衣粉主要成分：外表活性剂，水软化剂，碱剂，漂白剂等成分，有的洗衣粉中还含有增白剂， 香精和色素，以及填充剂等。2. 加酶洗衣粉是指含有酶制剂的洗衣粉,目前常用的酶制剂有四类：蛋白
9、酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶 。其中应用最广泛、效果最明显的是碱性蛋白酶和碱性脂肪酶。3.碱性蛋白酶的作用是使蛋白质水解成可溶于水的小分子肽和氨基酸。蛋白质酶多肽酶氨基酸脂肪酶的作用是将大分子的脂肪水解为小分子的物质，甘油和脂肪酸。脂肪酶甘油 + 脂肪酸4. 影响酶活性的因素有温度、酸碱度和外表活性剂。此外，加酶洗衣粉也不宜长期存放，存放时间过长会导致酶活力损失。5. 试验操作课题名称：温度对加酶洗衣粉洗涤效果的影响。试验目的：比较不同温度下加酶洗衣粉的洗涤效果。试验原理：酶的催化活性受温度影响，在适宜温度下酶的催化活性最高，温度过低或过高酶的催化力气降低。试验材料：加酶洗衣粉、天平、白色棉布
10、、1000mL 烧杯、玻棒、温度计、滴管、颖鸡血、水浴缸、温度分别为 5、15、25、35的清水。试验步骤：1取 10cm10cm 的白色棉布 4 块，用滴管各滴加 5 滴颖鸡血，晾干备用。（2） 取 1000mL 烧杯 4 个，用天平分别称取 0.5g 加酶洗衣粉，依次倒入 4 个烧杯中。（3） 将 5、15、25、35清水各 500mL 依次倒入 4 个烧杯中，用玻棒搅拌溶化洗衣粉。（4） 取水浴缸 4 个，依次倒入 5000mL 5、15、25、35清水，插入温度计保持恒温。（5） 将 4 个烧杯分别放到一样水温的水浴缸中，将带鸡血的棉布分别放到烧杯中浸泡20min。（6） 按一样方式用
11、不同玻棒搅拌棉布各，放到水浴缸中。结果分析与评价：不同种类的洗衣粉对同一污渍或不同污渍洗涤效果的列表比较污染物油渍 血渍 奶渍 果汁渍6. 常见问题解答蛋白酶洗衣粉复合酶洗衣粉一般洗衣粉为什么洗涤前先将衣物浸于加有适量洗衣粉的水内数小时？如何缩短衣物的浸泡时间？是为了使洗衣粉中的蛋白酶充分的分解衣物中的蛋白质污渍；用温水浸泡衣物，由于酶的催化作用需要适宜的温度。为什么不能在 60以上的水中使用此洗衣粉？使用加酶洗衣粉时，必需留意洗涤用水的温度，温度过高会使酶变性失活。在低温下酶的活性下降。试解释为什么此洗衣粉不能用于丝质及羊毛衣料？由于蛋白酶能使蛋白质水解，而丝质及羊毛衣料中含有蛋白质，这样会
12、损坏衣物。为什么使用加酶洗衣粉洗衣后，须彻底清洗双手？人体皮肤细胞有蛋白质，如不彻底清洗双手，就会使手的皮肤受到腐蚀。而使人患过敏性皮炎、湿疹等，因此，应避开与这类洗衣粉长时间地接触。脂肪酶对沾有矿物油的棉布是否起作用?不起作用。脂肪酶只对羟基和羧基形成的酯键起作用，而矿物油多为饱和链烃，没有酯键。试验 7-淀粉酶的固定化及淀粉水解1. 酶的生产提取法：承受确定的技术直接从动植物或微生物的组织、细胞中将酶提取出来。优点：简洁易行，在动植物或微生物资源丰富的地区具有应用价值。缺点：要有充分的原材料，广泛应用受到限制。发酵法常用方法：通过微生物发酵获得所需要的酶。优点：易培育、生殖速度快、便于大规
13、模生产。2. 酶制剂的优点：催化效率高、低能耗、低污染等。酶制剂的缺点：通常对强酸、强碱、高温存有机溶剂等条件格外敏感，简洁失活；溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产本钱；反响后会混在产物中(难分别，可能影响产品质量。 3.固定化酶：固定化酶技术。马上酶固定在确定空间内的技术如固定在不溶于水的载体上。固定化酶的优点：使酶既能与反响物接触，又能与产物分别；固定在载体上的没可以被反复利用。4.固定化酶方法：吸附法、交联法、包埋法、共价偶连法等。5.试验操作试验原理：本试验是用吸附法将 a-淀粉酶固定在石英砂上，确定浓度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精，用淀粉指示剂溶液测试，
14、流出物呈红色说明水解产物糊精生成。设备及用品：5ml 塑料注射器、50ml 烧杯、滴管、自行车用气门心及夹子、注射器架、试管及微量离心管 3 支。材料：-淀粉酶的固定化:在烧杯中将 5mg-淀粉酶溶于 4ml 蒸馏水中.由于酶不纯,可能有些不溶物。再参与 5g 石英砂,不时搅拌,30min 后装入 1 支下端接有气门心并用夹子封住的注射器中(石英砂体积约 4ml)。用 10 倍体积的蒸馏水洗涤此注射器以除去未吸附的游离淀粉酶,流速为 1ml/min。可溶性淀粉溶液:取 50ml 可溶性淀粉溶于 100ml 热水中,搅拌均匀。5mmol/L KI-I2 溶液：称取 0.127g 碘和 0.83g
15、 碘化钾。加蒸馏水 100ml 完全溶解后装入滴瓶中。步骤：将灌注了固定化酶的注射器放在注射器架上,用滴管滴加淀粉溶液 , 使淀粉溶液以0.3ml/min 的流速过柱。在流出 5ml 后接收 0.5ml 流出液,参与 12 滴 KI-I2 溶液,观看颜色.用水稀释 1 倍后再观看颜色。试验后,用 10 倍柱体积的蒸馏水洗涤此柱,放置在 4冰箱中,几天后再重复上述试验,看是否有一样的结果。试验反思：如何证明洗涤固定化酶柱的流出液中没有淀粉酶?可在试管中参与 1ml 可溶性淀粉，再加几滴淀粉酶柱流出液，保温几分钟后用碘液检验。如仍显蓝色，则流出液中没有淀粉酶了。一试验原理 1酵母菌的细胞呼吸试验
16、8果酒及果醋的制作酵母菌进展有氧呼吸大量生殖，反响式：C H O +O酶CO +H O+能量6 12 6222酵母菌进展无氧呼吸产生酒精和二氧化碳，表达式为：C H O 酶C H OH+CO +能量2酵母菌发酵的最正确环境6 12 62 52酵母菌在有氧和无氧的条件下都能生活：在有氧时，酵母菌大量生殖，但是不起到发酵效果；在无 氧时，生殖速度减慢，但是此时可以进展发酵。在利用酵母菌发酵时最好是先通入足够的无菌空气 在有氧环境下一段时间使其生殖，再隔绝氧气进展发酵。20左右最适合酵母菌生殖，酒精发酵的 最正确温度是在 1825，pH 最好是弱酸性。3醋酸菌好氧性细菌，当缺少糖源时和有氧条件下，可
17、将乙醇酒精氧化成醋酸。表达式为：C H OH酶CH COOH+H O；当氧气、糖源都充分时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸。2 532醋酸菌生长的最正确温度是在 3035(二)试验步骤选择葡萄冲洗榨汁酒精发酵果酒醋酸发酵果醋1. 对发酵瓶、纱布、榨汁机、盛葡萄汁的器皿等试验用具进展清洗并消毒。先用温水反复冲洗几次, 再用体积分数为 75%的酒精擦拭消毒，晾干待用。2. 取葡萄 500g，去除枝梗和腐烂的子粒。3. 用清水冲洗葡萄 12 遍除去污物，留意不要反复屡次冲洗。4. 用榨汁机榨取葡萄汁后，将其装入发酵瓶中或将葡萄打成浆后，用干净的纱布过滤至发酵瓶中， 盖好瓶盖。假设没有适宜的发酵装置，
18、可以用 500mL 的塑料瓶替代，但注入的果汁量不要超过塑料瓶总体积的 2/3。5.将发酵瓶置于适宜的温度下发酵。酵母菌，1825，1012d；醋酸菌，3035，78d。6.由于发酵旺盛期CO2 的产量格外大，因此需要准时排气，防止发酵瓶爆裂。假设使用简易的发酵装置，如瓶子最好选用塑料瓶，每天要拧松瓶盖 24 次，进展排气。7.10d 以后，可以开头进展取样检验工作。例如，可以检验酒味、酒精的含量、进展酵母菌的镜检等工作。8.当果酒制成以后，可以在发酵液中参与醋酸菌或醋曲，然后将装置转移至 3035 的条件下发 酵，适时向发酵液中充气。假设找不到醋酸菌菌种或醋曲，可尝试自然接种，但效果不是很好
19、。假设没有充气装置，可以将瓶盖翻开，在瓶口盖上纱布，以削减空气中尘土等的污染。(三)留意事项请分析此装置中的充气口、排气口和出料口分别有哪些作用。为什么排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接？结合果酒、果醋的制作原理，你认为应当如何使用这个发酵装置？答：充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进展充气用的；排气口是在酒精发酵时用来排出CO2的；出料口是用来取样的。排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接，其目的是防止空气中微生物的污染。使用该装置制酒时，应当关闭充气口；制醋时，应将充气口连接气泵，输入氧气。四学问重点1. 酿酒和制醋有关的微生物分别是酵母菌真菌和醋杆菌细菌。制作酒和醋的过程：在糯米 或
20、大米与酒曲混匀后，放在温度较高的地方，米先变甜，即生成了糖，这是由于黑曲霉或黑根霉的 淀粉酶将淀粉水解成糖。甜度增加后，再放到温度低的地方保持厌氧条件，酵母就开头工作，使糖变成酒糖酵解。假设时间太长，在有氧条件下，醋酸菌就开头作用，将乙醇氧化成乙酸，也就是变酸生成醋。2. 用葡萄制作葡萄酒时，一般不加蔗糖，都只用野生酵母，但是本试验为了加速反响，使观看更直 观，需要有更多底物参与反响，所以参与酵母使酒精发酵占有优势。使用高锰酸钾溶液浸泡葡萄的 目的是为了防止杂菌污染，也是消灭了野生酵母。发酵瓶中的液体不能装满是由于发酵过程中气体 产生，假设装满会使液体外溢，导致发酵液损失和瓶口等处污染杂菌，影
21、响产物品质。用装着水的弯曲玻璃管可以防止氧气进入，发酵产生的二氧化碳可以出去，还可以防止空气中杂菌的污染。 3.制醋有固态发酵和液态发酵，本试验属于固定化菌体连续发酵工艺。制醋时要向发酵瓶中通入空 气，保证发酵是一个氧化过程，要用棉花过滤是防止空气中的微生物进入。试验 10泡菜的腌制和亚硝酸的测定1.泡菜腌制过程中起作用的主要是假丝酵母和乳酸菌。这类食品含有乳酸和丰富的维生素、矿物质等养分成分，但蛋白质含量低，还含有确定量的亚硝酸盐。所用原料是白菜、洋白菜等。在无氧的条件由所用容器的凹槽加水在加盖造成下，微生物利用菜中的糖和其他养分物进展发酵，乳酸菌将糖分转化为乳 酸，这是需氧菌被杀死；当有机
22、酸增加到确定程度时， 乳酸菌被杀死，消灭酵母和霉菌，并渐渐产生亚硝酸。加白酒的作用是可抑制杂菌的生长，也是一种调味 剂，增加醇香感。加盐不要太多，否则会使乳酸菌发酵缓慢。温度高则发酵快，但口味差些。2. 杂菌较少的缘由是乳酸菌产生的乳酸球菌肽对许多革兰氏阳性菌有抗菌作用，蛋白质含量低，白酒的抑制作用等。3. 亚硝酸盐是对人体有害，引起中毒，可致癌的物质，由假丝酵母产生。可与对氨根本磺酸发生重氮化反响，这一产物再与 N1萘基乙二胺偶联，形成紫红色产物，可用光电比色法定量。试验步骤包括样品处理、测定、标准曲线以亚硝酸钠质量为横坐标以光密度OD 值为纵坐标、计算亚硝酸盐含量mg/kgX1=通过标准曲
23、线得到的亚硝酸盐质量ugm21000样品处理液总体积 V1/ 样品质量m1测定样品液总体积V21000。试验 11植物组织培育一植物组织培育的原理与根本过程1.原理：细胞全能性。2.根本过程：外植体愈伤组织胚配装体植物体二影响植物组织培育的因素 1、培育基配制要进展严格的灭菌2、外植体的选取：生长旺盛的嫩枝生理状况好，简洁诱导脱分化和再分化3、消毒4、接种5、培育6、移栽和栽培三影响花药培育的因素选取适宜的材料和培育基组成是花粉植株诱导成功的关键。最适宜的花药发育时期会因植物种类和 品种的不同而不同，但对大多数植物而言，适宜进展花药培育的时期是单核居中期或单核靠边期。四试验操作指导植物组织培育
24、不同于扦插、分根、叶插等常规无性生殖。由于植物组织培育所利用的植物材料体 积小、抗性差，所以对培育条件的要求较高。用于植物组织培育的培育基同样适合于某些微生物的 生长，如一些细菌、真菌等的生长。而培育物一旦受到微生物的污染，就会导致试验前功尽弃，因此要进展严格的无菌操作。无菌技术包括培育基消毒灭菌和植物材料外植体的消毒灭菌。对培育材料进展外表灭菌时， 一方面要考虑药剂的消毒效果；另一方面还要考虑植物材料的耐受力气。不同药剂、不同植物材料， 甚至不同器官要区分对待。对接种操作中污染状况的分析：接种 34 d 后，在接种操作中被杂菌污染的培育物会表现出被污染的现象。一般状况下，细菌污染可能是由接种
25、人员造成的，如未戴口罩，接种时说话，或手及器械消毒不严等。真菌污染可能是植物材料灭菌不当。妥当处理被污染的培育物：操作后常消灭培育物被污染的状况。一旦觉察培育材料被污染，特别 是真菌性污染，确定不要翻开培育瓶。应先将全部被污染的培育瓶统一放在高压蒸汽锅内进展高压蒸汽灭菌，然后再翻开培育瓶，进展清洗。有毒药品的处理：外植体灭菌用过的有毒药品要妥当处理如氯化汞等，以免引起环境污染。五学问重点1. 植物无性生殖的方法有扦插、嫁接和组织培育等。植物组织培育有两种形式：愈伤组织培育固体培育基、琼脂培育基和细胞悬浮培育液体培育基。植物组织培育的原理是细胞的全能性。 植物组织培育的应用在快速生殖、除去植物病
26、毒、品种的培育诱变育种、花药或花粉的单倍体培育、细胞融合、基因工程等、品种资源的保护、某些代谢产物如色素、芳香物质等的生产等方面。植物组织培育的过程包括脱分化和再分化。2. 培育基是组织培育时植物组织或器官赖以生长和发育的养分条件。包括植物需要的大量元素、微 量元素、有机成分、激素和琼脂。培育基中通常加确定量的蔗糖是除作为养分成格外，还用于维持确定的渗透压。细胞分裂素/生长素的摩尔浓度比打算组织是生根还是生芽，当两者比例高时细胞分裂素生长素，诱导芽的生成；两者大致相等时细胞分裂素=生长素，愈伤组织连续生长而不分化；两者比例低时细胞分裂素生长素，诱导根的形成。但试验中不用自然激素而是用人工合成的
27、激素如奈乙酸NAA、6苄基氨基腺嘌呤 BA 等是由于植物中存在相应的分解自然激素的酶而没有人工合成激素的相应的酶，所以自然激素在植物体内作用和存在的时间短，人工合成 激素的作用和存在的时间长，作用效果明显。最常用的MS 培育基生芽培育基、生根培育基。配制过程包括称量、溶解、调PH、溶化、分装三角瓶、加盖灭菌等步骤。3. MS 培育基与微生物培育基的比较微生物培育基以有机养分为主，而MS 培育基则需供给大量无机养分，无机盐混合物包括植物生长必需的大量元素和微量元素两大类。MS 培育基中微量元素和大量元素供给植物细胞生活所必需的无机盐；蔗糖供给碳源，同时能够维持细胞的渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到确定影响后所产生的特别养分需求。4. 植物组织培育技术与花药培育技术的一样之处是：培育基配制方法、无菌技术及接种操作等根本 一样。两者的不同之处在于：花药培育的选材格外重要，需事先摸索时期适宜的花蕾；花药裂开后释放出的愈伤组织或胚状体也要准时更换培育基；花药培育对培育基配方的要求更为严格。这些都 使花药培育的难度大为增加。培育过程应当在无菌的条件下进展，试验经过外植体愈伤组织丛 状苗生根苗移栽植株。需要确定的光照和温度的条件。