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1、双重或多重免疫组化标记双重或多重免疫组化标记一、基本原理一、基本原理 双重或多重标记是利用免疫学和细胞化学双重或多重标记是利用免疫学和细胞化学原理，在原理，在同一张切片上原位示踪同一张切片上原位示踪组织或细胞组织或细胞内内不同抗原不同抗原大分子物质的一项标记染色技术。大分子物质的一项标记染色技术。示踪剂：示踪剂：-荧光素荧光素 -酶酶 -胶体金等胶体金等操作的原则和要求基本上与单标免疫组化操作的原则和要求基本上与单标免疫组化方法雷同方法雷同优点：优点：不同抗原成分位置、功能关系更直观不同抗原成分位置、功能关系更直观缺点：缺点：流程长流程长 脱片机率更高脱片机率更高 前后重染色试剂间有交叉干扰前
2、后重染色试剂间有交叉干扰二、技术类型二、技术类型（一）双重或多重免疫荧光标记染色（一）双重或多重免疫荧光标记染色 采用呈现不同颜色的荧光色素配伍，采用呈现不同颜色的荧光色素配伍，分别标记不同的抗体，再通过各自与同一分别标记不同的抗体，再通过各自与同一切片上的相应抗原特异性结合而加以区别切片上的相应抗原特异性结合而加以区别显示所建立起来的双重或多重免疫组化染显示所建立起来的双重或多重免疫组化染色技术。色技术。优点：方法敏感、特异优点：方法敏感、特异缺点：缺点：需选用各自特定的激发滤光片分别观察或需选用各自特定的激发滤光片分别观察或二次曝光显影二次曝光显影样本不能长期保存样本不能长期保存组织结构背
3、景不清晰组织结构背景不清晰。直接法直接法-特异、快速特异、快速 间接法间接法-敏感、多用敏感、多用 技术类型技术类型抗体试剂抗体试剂异种动物抗体异种动物抗体-常混合应用，操常混合应用，操作步骤少，脱片率相对较低作步骤少，脱片率相对较低同种动物抗体同种动物抗体-分别应用，操作步骤分别应用，操作步骤加倍，脱片机率较高；前后重免疫荧光标加倍，脱片机率较高；前后重免疫荧光标记交叉重叠机会多，需用酸性洗脱或多聚记交叉重叠机会多，需用酸性洗脱或多聚甲醛蒸气处理甲醛蒸气处理 操作举例：垂体腺瘤操作举例：垂体腺瘤-ACTH与与GH双重免疫荧光标记染色（间接法）双重免疫荧光标记染色（间接法）(1)石蜡切片，脱蜡
4、，梯度酒精水化，入石蜡切片，脱蜡，梯度酒精水化，入PBS。(2)1人血清白蛋白（人血清白蛋白（HAS）孵）孵育育10min(3)抗抗ACTH血清（血清（McAb）1:200，孵育孵育(4)0.05mol/L TBS洗洗(5)羊抗鼠羊抗鼠IgG-TRITC，避光反应，避光反应1h。(6)0.05mol/L TBS(pH7.4)洗洗(第一重第一重ACTH-TRITC标记染色已完成标记染色已完成)。(7)切片脱水，二甲苯透明，空气干燥后，置于装切片脱水，二甲苯透明，空气干燥后，置于装有多聚甲醛粉末的密闭容器内，放在有多聚甲醛粉末的密闭容器内，放在80烤箱或温烤箱或温箱内以甲醛蒸气固定箱内以甲醛蒸气固
5、定24h，使第一重染色中二抗，使第一重染色中二抗的抗原结合部位失活。的抗原结合部位失活。(8)切片以切片以TBS洗洗(9)1 HSA孵育孵育30min(10)抗抗GH血清血清(McAb)1:400，孵育，孵育30min(11)0.05mol/L TBS(pH7.4)洗洗(12)羊抗鼠羊抗鼠IgG-FITC，避光反应，避光反应1h。(13)0.05mol/L TBS(pH7.4)洗洗(第二重第二重GH-FITC标记染色完成标记染色完成)。(14)缓冲甘油封片。缓冲甘油封片。(15)荧光显微镜下分别以荧光显微镜下分别以546nm及及490nm波长的激发波长的激发光观察切片组织内光观察切片组织内TR
6、ITC及及FITC所标示的所标示的ACTH及及GH抗原（抗原（TRITC阳性细胞呈红色，阳性细胞呈红色，FITC阳性细胞阳性细胞呈绿色）。呈绿色）。(16)用彩色底片对切片同一部位用用彩色底片对切片同一部位用546nm及及490nm波长激发光分别作两次曝光，即可在同一张照片上波长激发光分别作两次曝光，即可在同一张照片上显示不同颜色标示的显示不同颜色标示的ACTH与与GH两种抗原。两种抗原。TRITC-GAMIgG鼠抗人鼠抗人ACTH（IgG）FITC-GAMIgG鼠抗人鼠抗人GH（IgG）T游离游离FabTTTFGH抗原抗原ACTH抗原抗原FFab被灭活被灭活图图1 同种动物抗体间接法（分步固
7、定）双重免疫荧光荧色原理同种动物抗体间接法（分步固定）双重免疫荧光荧色原理（二）双重或多重免疫酶标记染色（二）双重或多重免疫酶标记染色 以酶催化不同底物呈现不同颜色产物标示以酶催化不同底物呈现不同颜色产物标示同一切片内两种或两种以上抗原为理论基础所建同一切片内两种或两种以上抗原为理论基础所建立起来的多重免疫标记染色方法。立起来的多重免疫标记染色方法。优点：优点：光镜下可以同时观察和对比光镜下可以同时观察和对比 一次曝光即可成像一次曝光即可成像 样品保存时间相对较长样品保存时间相对较长 常用标记酶与底物的配伍常用标记酶与底物的配伍 单酶双底物单酶双底物 DAB(棕色棕色):4CN(蓝色蓝色)AE
8、C(红色红色):4CN(蓝色蓝色)坚固红坚固红(fast red 红色红色)坚固蓝坚固蓝(fast blue 蓝色蓝色)HRPAP-萘酚萘酚AS-MX双酶双底物双酶双底物 HRP(DAB):AP(萘酚萘酚AS.MX-坚固蓝坚固蓝)HRP(4CN):AP(萘酚萘酚AS.MX-坚固红坚固红)直接法、间接法、桥法均可使用直接法、间接法、桥法均可使用灵敏度灵敏度以桥法中的复合物法最高以桥法中的复合物法最高特异性特异性则以直接法最佳则以直接法最佳 操作方法类同单酶标记，有直接法、操作方法类同单酶标记，有直接法、间接法、复合物法之分。间接法、复合物法之分。间接法与复合物法较常采用。间接法与复合物法较常采用
9、。操作举例操作举例 淋巴瘤轻链淋巴瘤轻链、的双重的双重酶酶标记标记（双（双酶酶双底物）双底物）(1)石蜡切片常规脱蜡进水（若用含汞固石蜡切片常规脱蜡进水（若用含汞固定液固定的组织则需用定液固定的组织则需用0.5%碘的乙醇溶液碘的乙醇溶液脱汞脱汞5min，乙醇浓度为乙醇浓度为70，经自来水洗，经自来水洗后，以后，以2.5%硫代硫到钠浸洗硫代硫到钠浸洗1min，水洗水洗)；(2)0.3%H2O2甲醇液浸泡切片甲醇液浸泡切片30min,自来自来水洗，蒸馏水洗水洗，蒸馏水洗,入入PBS(0.01mol/L pH7.2);(3)滴加正羊血清滴加正羊血清1:10，湿盒，室温，湿盒，室温，10min，不洗；
10、不洗；(4)加一抗加一抗(抗人抗人 PcAb与抗人与抗人McAb的的混混合液合液)1:200，湿盒，湿盒，37，45min或更或更长长；(5)PBS液，液，5min3(6)加二抗加二抗(GARGGAMG混合液混合液1:200)，温，温盒，盒，37，30min；(7)PBS洗，洗，5min3;(8)加酶抗酶抗体复合物加酶抗酶抗体复合物(兔兔PAP鼠鼠APAAP 混合液混合液1:100)，湿盒，湿盒，37，30min；(9)PBS洗，洗，5min3；(10)过氧化物酶显色反应：以过氧化物酶显色反应：以DAB-H2O2液显色液显色 710min(镜下控制显色程度镜下控制显色程度)，PBS洗，洗，5m
11、in3；(11)硷性磷酸酶显色反应：以萘酚硷性磷酸酶显色反应：以萘酚AS.MX及坚固蓝及坚固蓝(fast blue)显色显色1015min(镜下镜下控制显色程度控制显色程度)，PBS洗、自来水洗；洗、自来水洗；(12)缓冲甘油封片，光镜下观察缓冲甘油封片，光镜下观察PPPAAA 图图2 双酶双底物双酶双底物(复合物法复合物法)双重酶标染色原理双重酶标染色原理兔兔PAPGAR IgG兔抗兔抗KAg鼠鼠APAAPGAM.IgG鼠抗人鼠抗人注注：若用同种动物抗血清分别进行标记染色时，：若用同种动物抗血清分别进行标记染色时，尚需考虑在前后重染色之间是否设置尚需考虑在前后重染色之间是否设置“多聚甲多聚甲
12、醛蒸气处理醛蒸气处理2-4h（封闭固定）或用封闭固定）或用pH2.2的甘的甘氨酸氨酸-盐酸溶液处理盐酸溶液处理2h（酸洗脱）的操作步酸洗脱）的操作步骤骤”，目的为了避免前后重免疫试剂间的交叉，目的为了避免前后重免疫试剂间的交叉反应。可视预实验结果来确定。反应。可视预实验结果来确定。（三）双重及多重免疫金标记（三）双重及多重免疫金标记(电镜）电镜）电镜下的双重免疫标记染色不是靠电镜下的双重免疫标记染色不是靠颜色区分，而是靠标记物的不同电子密颜色区分，而是靠标记物的不同电子密度或颗粒的不同大小来区别不同抗原，度或颗粒的不同大小来区别不同抗原，有别于光镜下的双重免疫标记方法。有别于光镜下的双重免疫标
13、记方法。常用的方法多为双重免疫金标记常用的方法多为双重免疫金标记 优点：优点：高电子密度，分辨率高，抗原定高电子密度，分辨率高，抗原定 位精确，颗粒大小可人工控制，位精确，颗粒大小可人工控制，标记试剂易制备。标记试剂易制备。缺点：缺点：试剂质量要求高，非特异吸附干扰试剂质量要求高，非特异吸附干扰 大大(背景背景)金标抗体双重抗原标记常用间接法显金标抗体双重抗原标记常用间接法显示，且多采用异种动物抗体混合同步操作。示，且多采用异种动物抗体混合同步操作。优点：优点：敏感性提高，操作步骤减少敏感性提高，操作步骤减少缺点：缺点：标记二抗质量要求高，背景染色深。标记二抗质量要求高，背景染色深。可通过采用
14、固相吸附或过量二抗封闭，可通过采用固相吸附或过量二抗封闭，或用多聚甲醛蒸气处理，使二抗的游离抗或用多聚甲醛蒸气处理，使二抗的游离抗原结合部位（原结合部位（Fab段）灭活加以克服。段）灭活加以克服。（四）其它双重标记法（四）其它双重标记法 1.免疫荧光法与免疫酶法联合应用免疫荧光法与免疫酶法联合应用(先酶标先酶标 后荧光后荧光)；2.免疫荧光法与免疫金银法联合应用免疫荧光法与免疫金银法联合应用(先免先免疫金银标记后荧光标记疫金银标记后荧光标记)；3.免疫酶法与免疫金法联合应用免疫酶法与免疫金法联合应用(20nm,红红 色），此法忌用银液放大，易吸附干扰；色），此法忌用银液放大，易吸附干扰；4.免
15、疫金银法与免疫酶法联合应用免疫金银法与免疫酶法联合应用(对比明对比明 显显)。三、注意事项三、注意事项 1.标记染色的顺序确定需视组织标记抗原标记染色的顺序确定需视组织标记抗原的性质，量少、脆弱先标记，量多、耐受的性质，量少、脆弱先标记，量多、耐受后标记。后标记。2.结构保存与抗原保护并重，电镜样品一结构保存与抗原保护并重，电镜样品一般忌用饿酸后固定，般忌用饿酸后固定，PG固定液中的戊二醛固定液中的戊二醛(G)浓度不宜超过浓度不宜超过2，光镜样品的固定剂，光镜样品的固定剂类型和固定时间的选择也应如此；类型和固定时间的选择也应如此；3.严严格格操操作作步步骤骤，轻轻柔柔，洗洗涤涤应应彻彻底底，洗洗涤涤用用的的TBS中中常常加加入入1 Triton100或或Saponin；4.保保证证试试剂剂的的清清洁洁度度与与纯纯度度(双双蒸蒸水水，亲亲和和免免疫疫层层析析)，注注意意增增强强组组织织片片与与载载玻玻片片的的粘粘合合 度度，以以 减减 少少 脱脱 片片 机机 率率；5.封封片片剂剂选选择择应应注注意意显显色色剂剂的的溶溶解解特特性性，一一般般多多采采用用水水封封片片(10%缓缓冲冲甘甘油油)，保保存存时时间间不长，应及时观察记录。不长，应及时观察记录。