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1、实验十一实验十一 植物的组织培养植物的组织培养交大附中交大附中 冀朝辉冀朝辉植物组织培养植物组织培养n在无菌条件下，将离体的植物器官、组在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体，培养在人工配织、细胞以及原生质体，培养在人工配置的培养基上，给予适当的培养条件，置的培养基上，给予适当的培养条件，使其长成完整的植株。使其长成完整的植株。植物组织培养的理论根底植物组织培养的理论根底植物细胞的全能性植物细胞的全能性n植物细胞的全能性：植物细胞具有植物体全部遗传植物细胞的全能性：植物细胞具有植物体全部遗传的可能性，在一定条件下具有发育成完整植物体的的可能性，在一定条件下具有发育成完整植物体的
2、潜在能力。潜在能力。n原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从理论上讲，生物体的每一个活细胞都全部基因，从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。应该具有全能性。n科学研究说明：处于离体状态的植物活细胞，在一科学研究说明：处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。人工条件可能表现出全能性，发育成完整的植株。人工条件下实现的这一过程
3、，就是植物组织培养。下实现的这一过程，就是植物组织培养。植物细胞全能性的表达植物细胞全能性的表达n脱分化：将来自已分化组织的已停止分脱分化：将来自已分化组织的已停止分裂的细胞从植物体局部的抑制性影响下裂的细胞从植物体局部的抑制性影响下解脱出来，恢复细胞的分裂活性。解脱出来，恢复细胞的分裂活性。n再分化：经脱分化的组织或细胞在一定再分化：经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可有转变为各种不同细胞的培养条件下可有转变为各种不同细胞类型的能力。类型的能力。离体的植物离体的植物器官、组织、器官、组织、细胞细胞脱分化脱分化愈愈伤伤组组织织再分化再分化根根芽芽植植物物体体植物组织培养过程植物组织培养过程
4、植物组织培养条件植物组织培养条件含有全部营养成分的培养基、一定的温度、空气、无含有全部营养成分的培养基、一定的温度、空气、无菌环境、适合的菌环境、适合的pH、适时光照等。、适时光照等。愈伤组织愈伤组织:在人工培养基上在人工培养基上,由外植体形成的一团无序生长状态由外植体形成的一团无序生长状态的薄壁细胞。的薄壁细胞。愈伤组织愈伤组织应用领域应用领域 1 1、快速繁殖、快速繁殖 运用组织培养的途径，一个单株一年可以繁运用组织培养的途径，一个单株一年可以繁殖几万到几百万个植株。例如一株葡萄一年繁殖到殖几万到几百万个植株。例如一株葡萄一年繁殖到3 3万多株，一万多株，一株兰花一年繁殖到株兰花一年繁殖到
5、400400万株。万株。2 2、种苗脱毒、种苗脱毒 针对病毒对农作物造成的严重危害，通过组针对病毒对农作物造成的严重危害，通过组织培养可以有效地培育出大量的无病毒种苗。已经取得成功的织培养可以有效地培育出大量的无病毒种苗。已经取得成功的有马铃薯、草莓、香蕉、葡萄等等。有马铃薯、草莓、香蕉、葡萄等等。3 3、远缘杂交、远缘杂交 利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得成功，从而育成一些罕见的新物种。比方辽宁果树研究所利得成功，从而育成一些罕见的新物种。比方辽宁果树研究所利用这种方法获得苹果与梨的杂交种。用这种方法获得苹果与梨的杂交种。4 4、突变育种、突变育
6、种 采用组织培养可以直接诱变和筛选出具抗病、采用组织培养可以直接诱变和筛选出具抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种。象中国林科院用抗盐、高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种。象中国林科院用逐步加大培养基中盐的浓度，直接获得耐盐的杨树株系。逐步加大培养基中盐的浓度，直接获得耐盐的杨树株系。5 5、基因工程、基因工程 基因工程主要研究基因工程主要研究DNADNA的转导，而基因转导后的转导，而基因转导后必须通过组织培养途径才能实现植株再生。必须通过组织培养途径才能实现植株再生。6 6、生物制品、生物制品 有些极其昂贵的生物制品，如抗癌首选药物有些极其昂贵的生物制品，如抗癌首选药物紫杉醇等，可以用
7、大规模培养植物细胞来直接生产。近年国内紫杉醇等，可以用大规模培养植物细胞来直接生产。近年国内在红豆杉组织培养中获得生长量很高的细胞系，每升细胞培养在红豆杉组织培养中获得生长量很高的细胞系，每升细胞培养物中紫杉醇的产量可达。物中紫杉醇的产量可达。植物组织培养的分类植物组织培养的分类n广义的组织培养依外植体不同，可分为：器官培养、广义的组织培养依外植体不同，可分为：器官培养、茎尖分生组织培养、茎尖分生组织培养、愈伤组织培养愈伤组织培养、细胞培养、原、细胞培养、原生质体培养。生质体培养。n外植体：外植体：由活体植物体上提取下来的，接种在培养由活体植物体上提取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器
8、官等。基上的无菌细胞、组织、器官等。配制培养基配制培养基外植体的消毒外植体的消毒接种接种培养培养移栽移栽栽培栽培 组织培养实验步骤组织培养实验步骤 培养基及其配制培养基及其配制 一、培养基的成分一、培养基的成分 二、培养基的配制二、培养基的配制三、常用培养基配方及其特点三、常用培养基配方及其特点 一、培养基的成分一、培养基的成分 n无机盐无机盐n碳源和能源碳源和能源 n维生素类维生素类 n氨基酸及有机附加物氨基酸及有机附加物 n植物生长调节物质植物生长调节物质 n琼脂琼脂 无机盐无机盐 n无机盐包括大量元素和微量元素。无机盐包括大量元素和微量元素。n大量元素是指碳、氢、氧、氮、磷、钾、硫、钙、
9、氯、镁。大量元素是指碳、氢、氧、氮、磷、钾、硫、钙、氯、镁。n氮氮通通常常是是指指硝硝态态氮氮或或氨氨态态氮氮，但但在在培培养养基基中中多多以以KNO3KNO3或或Ca(NO3)2Ca(NO3)2的的硝硝态态氮氮形形式式来来满满足足培培养养物物对对氮氮素素的的需需求求，或或将将两两种混合使用。种混合使用。n磷磷是是植植物物的的必必须须元元素素之之一一，参参与与植植物物生生命命活活动动中中核核酸酸、蛋蛋白白质质合合成成、光光合合作作用用、呼呼吸吸作作用用及及能能量量的的贮贮存存、转转化化与与释释放放等等重重要生理生化过程，因此在组织培养物中需大量的磷。要生理生化过程，因此在组织培养物中需大量的磷
10、。n钾钾是是主主要要的的阳阳离离子子，近近年年来来在在培培养养基基中中的的用用量量呈呈逐逐渐渐提提高高的的趋趋势。钙、钠、镁的用量较少。势。钙、钠、镁的用量较少。n微微量量元元素素是是指指铁铁、硼硼、锰锰、锌锌、钴钴、钼钼、铜铜等等，其其需需要要量量很很少少，一般多为一般多为10-510-510-7mol/L10-7mol/L，稍多那么产生毒害。，稍多那么产生毒害。碳源和能源碳源和能源 n植物组织培养中被培养的外植体，由于其光合作用的植物组织培养中被培养的外植体，由于其光合作用的能力较低，需要在培养基中添加一些碳水化合物作为能力较低，需要在培养基中添加一些碳水化合物作为生长发育的能源。生长发育
11、的能源。一般是添加蔗糖、葡萄糖和果糖，一般是添加蔗糖、葡萄糖和果糖，其中以蔗糖为最常用，效果也最好。其中以蔗糖为最常用，效果也最好。n大多数植物细胞对蔗糖的需求范围是大多数植物细胞对蔗糖的需求范围是1%5%，但个，但个别植物组织培养中蔗糖的浓度也可高达别植物组织培养中蔗糖的浓度也可高达7%甚至甚至15%，如玉米、油菜等植物的花药培养。，如玉米、油菜等植物的花药培养。n糖类在培养基中除了作为糖类在培养基中除了作为碳源和能源碳源和能源以外，还具有以外，还具有维维持培养基一定的渗透压的作用持培养基一定的渗透压的作用。n一般来说，蔗糖作为碳源和渗透剂的比例约为一般来说，蔗糖作为碳源和渗透剂的比例约为3
12、132，即约有，即约有1/42/5的蔗糖用于保持培养的蔗糖用于保持培养基的渗透压。基的渗透压。维生素类维生素类 n维维生生素素类类与与植植物物体体内内各各种种酶酶的的形形成成有有关关。维维生生素素的的种种类类很很多多，在在植植物物组组织织培培养养中中通通常常以以Bmg/L，其其中中以以盐盐酸酸硫硫胺胺素素B1、盐盐酸酸吡吡哆哆素素B6、维维生生素素B12、烟烟酸酸、生生物物素素和和维维生生素素C最最为为常常用用。在在各各种种维维生生素素中中，1可可能能是是必必需的。其它可能只对外植体的生长起促进作用。需的。其它可能只对外植体的生长起促进作用。n肌肌醇醇本本身身不不促促进进外外植植体体的的生生长
13、长，但但可可能能有有助助于于活活性性物物质质发发挥挥作作用用，从从而而促促进进外外植植体体生生长长、胚胚状状体体及及芽芽的的形形成成。培培养养基基中中肌肌醇醇的的用用量量为为50100mg/L。氨基酸及有机附加物氨基酸及有机附加物 n在一些培养基中可参加一些氨基酸，如甘氨酸、丝氨在一些培养基中可参加一些氨基酸，如甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺等，它们是培养基酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺等，它们是培养基中重要的有机氮源。水解酪蛋白中重要的有机氮源。水解酪蛋白CH和水解乳蛋和水解乳蛋白白LH也是多种氨基酸的混合物，对胚状体或不也是多种氨基酸的混合物，对胚状体或不定芽或多胚的分化有良好
14、的促进作用，常用量为定芽或多胚的分化有良好的促进作用，常用量为500mg/L。n在某些植物组织培养中还参加一些天然的有机物，例在某些植物组织培养中还参加一些天然的有机物，例如椰子乳如椰子乳1020%，酵母提取物，酵母提取物0.5%，香蕉泥，香蕉泥100200mg/L，其作用是提供一些必要的微量营，其作用是提供一些必要的微量营养成分、生理活性物质和生长激素等。如培养基中参养成分、生理活性物质和生长激素等。如培养基中参加加100200mg/L的香蕉泥，具有较大的的香蕉泥，具有较大的pH缓冲作缓冲作用，主要用于兰花的组织培养，对幼苗的发育有较大用，主要用于兰花的组织培养，对幼苗的发育有较大的促进作用
15、。的促进作用。植物生长调节物质植物生长调节物质 n生长调节物质是培养基中不可缺少的关键物生长调节物质是培养基中不可缺少的关键物质，其用量虽极少，但它们对外植体愈伤组质，其用量虽极少，但它们对外植体愈伤组织的诱导和器官分化起着重要和明显的调节织的诱导和器官分化起着重要和明显的调节作用，其中以作用，其中以生长素类生长素类和和细胞分裂素细胞分裂素最为常最为常用。用。生长素生长素 n主要作用是促进细胞的生长、分裂和分化；诱主要作用是促进细胞的生长、分裂和分化；诱导愈伤组织的形成、胚状体的产生及试管苗的导愈伤组织的形成、胚状体的产生及试管苗的生根，更重要的是配合一定比例的细胞分裂素生根，更重要的是配合一
16、定比例的细胞分裂素诱导腋芽及不定芽的产生。诱导腋芽及不定芽的产生。n生长素常用的是生长素常用的是2,4-D2,4-D2,4-2,4-二氯苯氧乙酸、二氯苯氧乙酸、NAANAA萘乙酸、萘乙酸、IAAIAA吲哚乙酸、吲哚乙酸、IBAIBA吲哚吲哚丁酸，它们作用的强弱顺序为：丁酸，它们作用的强弱顺序为：n 2,4-D 2,4-DNAANAAIBAIBAIAA IAA n2,4-D2,4-D常用于诱导愈伤组织，常用于诱导愈伤组织，NAANAA、IBAIBA、IAAIAA10mg/L10mg/L。细胞分裂素细胞分裂素 n主要作用是促进细胞的分裂和器官的分化、延缓组主要作用是促进细胞的分裂和器官的分化、延缓
17、组织的衰老、增强蛋白质的合成、促进芽的生长。织的衰老、增强蛋白质的合成、促进芽的生长。n常用的细胞分裂素类有：冲动素常用的细胞分裂素类有：冲动素KT、6-苄基腺苄基腺嘌呤嘌呤6-BA、玉米素、玉米素ZT、2-异戊烯腺嘌呤异戊烯腺嘌呤2-iP、吡效隆、吡效隆4PU，CPPU和噻重氮苯基和噻重氮苯基脲脲TDZ。n它们作用的强弱顺序为它们作用的强弱顺序为TDZ 4PU ZT 2-iP 6-BA KT。但在组织培养中通常使用人工合成。但在组织培养中通常使用人工合成的、性能稳定的而价格适中的的、性能稳定的而价格适中的KT和和6-BA，二者的，二者的最适浓度为最适浓度为1-10mg/L。植物植物组织培养中
18、植物生培养中植物生长调节剂的使用的使用 琼脂琼脂n琼脂是从海藻中提取的一种高分子碳水琼脂是从海藻中提取的一种高分子碳水化合物，化合物，它的主要作用是使培养基在常它的主要作用是使培养基在常温下凝固，同时不参与代谢温下凝固，同时不参与代谢，所以在组，所以在组织培养中一直被作为首选的培养基质而织培养中一直被作为首选的培养基质而广泛应用。广泛应用。二、培养基的配制二、培养基的配制n水和药品水和药品 n母液的配制和保存母液的配制和保存 n培养基配制程序培养基配制程序培养基配制程序培养基配制程序 水和药品水和药品 n用于配制培养基的水最好是蒸馏水；用于配制培养基的水最好是蒸馏水；n化学药品应尽可能采用分析
19、纯或化学纯化学药品应尽可能采用分析纯或化学纯级别的试剂；级别的试剂；n药品的称量及定容都要准确。药品的称量及定容都要准确。配制配制MS培养基母液成分表培养基母液成分表母液母液种种类类成分成分规规定定量量（mg/lmg/l）扩扩大大倍倍数数称称取取量量（g g）母液母液定容定容体体积积（mlml）配配1L MS1L MS培养基培养基吸取量吸取量（mlml）大量大量元素元素母液母液1 1NHNH4 4NONO3 316501650505082.582.5100010002020KNOKNO3 31900190095.095.0MgSOMgSO4 4.7H.7H2 2O O37037018.518.
20、52 2CaclCacl2 2.2H.2H2 2O O44044010010022.022.050050010103 3KHKH2 2POPO4 41701701001008.58.55005001010微量微量元素元素5 5H H3 3BOBO3 36.26.250500.310.31100010002020MnSOMnSO4 4.4H.4H2 2O O22.322.31.1151.115ZnSOZnSO4 4.7H.7H2 2O O8.68.60.430.43KIKI0.830.830.04150.0415NaNa2 2MoOMoO4 4.2H.2H2 2O O0.250.250.0125
21、0.0125CuSOCuSO4 4.5H.5H2 2O O0.0250.0250.001250.00125CoclCocl2 2.6H.6H2 2O O0.0250.0250.001250.00125铁盐铁盐4 4NaNa2 2-EDTA-EDTA37.337.31001001.8651.8655005001010FeSOFeSO4 4.7H.7H2 2O O27.827.81.3901.390有机有机成分成分6 6肌醇肌醇1001002002005.05.02502505 5甘氨酸甘氨酸2 20.10.1烟酸烟酸0.50.50.0250.025V VB6B60.50.50.0250.025V
22、 VB1B10.10.10.0250.025三、常用培养基及其特点三、常用培养基及其特点nMS培养基是培养基是1962年年Murashige和和Skoog为培养烟草材料为培养烟草材料而设计的。特点是无机盐的浓度高，有加速愈伤组织生长而设计的。特点是无机盐的浓度高，有加速愈伤组织生长的作用，能满足植物组织对矿质营养的要求。铵盐和硝酸的作用，能满足植物组织对矿质营养的要求。铵盐和硝酸盐含量高，比例也较为适宜，也不需要添加更多的有机附盐含量高，比例也较为适宜，也不需要添加更多的有机附加物，这是目前应用的最广泛的一种培养基。与加物，这是目前应用的最广泛的一种培养基。与MS较为较为接近的还有接近的还有L
23、S、RM等培养基。等培养基。nN6培养基是培养基是1974年由我国的朱至清等为水稻等禾谷类作年由我国的朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的，其物花药培养而设计的，其KNO3和和NH42SO4浓度高浓度高且不含钼。目前在国内已广泛用于小麦、水稻及其它植物且不含钼。目前在国内已广泛用于小麦、水稻及其它植物的花粉和花药的培养和其它的组织培养。的花粉和花药的培养和其它的组织培养。nB5培养基它的主要特点是含有较低的铵盐，该营养成分可培养基它的主要特点是含有较低的铵盐，该营养成分可能对不少培养物的生长有抑制作用，对有些植物如双子叶能对不少培养物的生长有抑制作用，对有些植物如双子叶植物特别是木本植物
24、更加适合。植物特别是木本植物更加适合。菊花的组织培养菊花的组织培养 菊花的组织培养结果菊花的组织培养结果生根培养基生根培养基发芽培养基发芽培养基一、外殖体无菌苗接种操作一、外殖体无菌苗接种操作一实验步骤一实验步骤1用用%的酒精棉消毒的酒精棉消毒 和和 。2点燃点燃 。3对剪刀进行对剪刀进行 处理，准备用于接种的处理，准备用于接种的生物材料。生物材料。4接种操作：叶接种操作：叶 朝上，朝上，朝下；朝下；茎段茎段 放在培养基中。放在培养基中。5熄灭酒精灯。熄灭酒精灯。6填写标签，培养瓶送至组培室填写标签，培养瓶送至组培室。7整理实验台。整理实验台。台面台面 手手7070酒精灯酒精灯灭菌灭菌 上表皮上表皮插插下表皮下表皮