《微生物限度检查操作规程(中国药典2023年版四部通则).doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《微生物限度检查操作规程(中国药典2023年版四部通则).doc（31页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、编码：KF-SOP-07-13-2标题微生物限度检查操作规程共 19 页第 1 页起 草 人审 核 人批 准 人起草日期审核日期批准日期起草部门质量管理部颁发部门办公室生效日期一、范围：本标准规定了微生物限度的检查方法和操作要求；适用于检品需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、控制菌的检查。二、引用标准：中国药典2015 年版(通则 1105-1106)三、目录 1微生物限度标准2. 设备、仪器及用具3. 消毒液、稀释剂、试液及培养基4. 检查总则（通则 1105：非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法，通则 1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法）5. 微生物计数法检查6. 控制菌检查法7.
2、 实验技术8. 附件1. 微生物限度标准非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准需氧菌总数(cfu/g或 cfu/ml)103霉菌和酵母菌总数(cfu/g 或 cfu/ml)102控制菌药用原料及辅料*未做统一规定。1.1 成品微生物限度标准法定标准需氧菌霉菌和酵控制菌需氧菌内控标准控制菌品总数母菌总数总数名大肠埃沙门(cfu/g 或(cfu/g 或cfu/ml)希菌菌cfu/ml)(cfu/g 或cfu/ml)乳糖1000100无100无水10010 乳糖/10g/100g100/100g蔗糖无无无无(1)“”为不得检出。 (2)目测霉变者以不合格论。10050霉菌和酵母菌总数(cfu/g大肠埃
3、沙门或 cfu/ml)希菌菌5010/10g(3)“无”为标准依据或无相应规定。编码：KF-SOP-07-13-2标题微生物限度检查操作规程共 19 页第 6 页1.2 工艺用水微生物限度标准法定标准内控标准品名生活饮用水纯化水需氧菌总数(cfu/ml)100lOO控制菌（MPN/100mL 需氧菌总数 控制菌（MPN/100mL或CFU/100mL）(cfu/ml)或CFU/100mL） 不得检出100不得检出不得检出80不得检出1.3 内包装材料微生物限度标准品名(单位)药用聚乙烯烃塑料袋(100cm2)需氧菌总数霉菌和酵母菌总数控制菌需氧菌总数霉菌和酵母菌总数控制菌1000cfu100c
4、fu100cfu10cfu说明： 1“”为每 100 cm2 中不得检出。2目测霉变者以不合格论。3“无”为标准依据或无相应规定。2. 设施、仪器及用具2.1 、设施：2.1.1. 微生物限度检查室及相关设施：微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。 2.1.2其他设备：高压蒸汽灭菌器；细菌培养箱（3035）；霉菌培养箱（2528）；电炉（或其他适宜的加热装置）；恒温水浴；电热干燥箱（ 250300）；电冰箱。生化试剂储存箱。2.2 仪器及器皿2.2.1.
5、 菌落计数器；显微镜（1500X）；电子天平或药物天平（感量0.1g）；pH 系列比色计。2.2.2. 玻璃器皿：锥形瓶（ 250300ml，内装玻璃珠若干）、研钵（玻璃或陶瓷制，1012cm）、培养皿（9 cm）、量筒（100 ml）、试管（18180mm）及塞、吸管（1ml分度 0.01， 10 ml 分度 0.1）、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。2.2.3 新购的玻璃器皿的清洁：先用流水冲洗，浸泡于 1%2%盐酸（工业用）液中约 26 小时，除去游离碱质，再用流水冲洗。用于化学分析的玻璃仪器，需用重铬酸钾清洁液浸泡数分钟后，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗 23 次，晾干备用。2.3
6、 用过的玻璃器皿：2.3.1 未被病原微生物污染的器皿：可随时洗涤。用清水冲洗（或浸泡），除容量仪器外，可用毛刷和肥皂粉，内外刷洗，再用清水涮洗干净，晾干备用。容量仪器宜用清洁液浸泡或涮洗，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗 23 次。2.3.2 已被病原微生物污染的器皿：需先经过灭菌处理后再按常法洗涤。试管及培养皿：先正放或直立于高压蒸汽灭菌器内，经 121灭菌 30 分钟。趁热倾出培养物，再以清水或用毛刷及肥皂粉刷洗，最后以流水涮净。吸管：全部直立浸没于清洁液的长筒形容器中，筒底应衬有棉或橡皮垫，以防管尖损坏。24 小时后，逐支用流水反复冲洗洁净，晾干后包扎灭菌备用。载、盖玻片：应分别浸泡于清
7、洁液 1224 小时后，取出用流水冲洗，再放入 3%5% 肥皂水或 5%碳酸钠液内煮沸 1015 分钟，待自然冷却后，再用流水冲洗。沥干后置 95% 乙醇中浸泡，晾干备用。2，3，3 玻璃器皿用前应洗涤干净，无残留抗菌物质。吸管口上端距 0.5 cm 处塞入约 2cm 的适宜疏松棉花，置吸管桶内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒、试管均应加棉塞或硅胶塞， 若用振荡器制备混悬液时，尚需用玻璃纸包裹瓶塞（以免振荡时供试液污染瓶塞），再用牛皮纸包扎。玻璃器皿，均于 160干热灭菌 2 小时或高压蒸汽 121灭菌 30 分钟， 烘干备用。2.4 用具2.4.1 大、小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并应定期用
8、 70%75%乙醇溶液浸泡）。2.4.2 无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌，备用。也可用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。2.4.3 接种环（白铱金或镍铬合金，环径 45mm、长度 610cm）、乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子、灭菌称样纸、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆、陶瓦盖（12 cm）、实验记录纸等。3 消毒液、稀释剂、试液及培养基3.1 消毒液、稀释剂及试液。3.1.1 0.1%苯扎溴铵溶液：供洗手、擦拭操作台面用。3.1.2 5%石碳酸溶液：配制后装入玻璃消毒缸内，供消毒带菌吸管用，抑或选用其他适宜消毒液。3.1.375
9、%乙醇溶液：配好后制乙醇棉球，供擦手、擦拭操作工具用。3.1.40.9%无菌氯化钠溶液：取氯化钠 9.0g，加水使溶解成 1000ml，121灭菌 20 分钟。3.1.5. 司盘-80、单硬脂酸甘油酯、吐温-80：供非水溶性供试品供试液制备用。3.1.6. 无菌 0.1%氯化三苯四氮唑溶液（TTC）：取氯化三苯四氮唑 0.1g，加水使溶解成 10 ml。3.1.7. 甲基红指示液：取甲基红 0.1g，加入 95%乙醇 300ml，水适量，使溶解，再加水至 500ml。3.1.8V-P 试液：氢氧化钾试液：取氢氧化钾 40.0g，加水使溶解成 100ml；-萘酚乙醇试液：取-萘酚 6.0g，加无
10、水乙醇使溶解成 100ml。3.1.9革兰染色液：沙黄染液：取沙黄 0.25g，加 95%的乙醇 10ml，使完全溶解后， 加水至 100ml；结晶紫染液：取结晶紫 1.0g，加 95%的乙醇 20ml，使溶解，加 1%的草酸铵溶液 80ml，混匀。静置 48 小时使用，置密闭棕色瓶中储存；碘试液：取碘化钾 2.0g，加水 35ml 使溶解，加入碘片 1.0g，使全部溶解后，加水稀释至 300ml，置密闭棕色瓶中储存。3.1.10. 中性红指示液：取中性红 1.0g，研细，加 95%乙醇 60ml，使溶解，再加水到 100ml。变色范围 pH6.88.0（红黄）。3.1.11. 亚甲蓝指示液：
11、取亚甲蓝 0.5g，加水使溶解成 100ml。3.1.12. 溴麝香草酚蓝指示液：取溴麝香草酚蓝 0.4g，加 1mol/L 氢氧化钠溶液 0.64ml 使溶解，再加水至 100ml。变色范围 pH6.07.6（黄蓝）。3.1.13酸性品红指示液：以酸性品红0.5g，加水 100ml 使溶解，再逐渐加 1mol/L 氢氧化钠溶液 16ml，每加 1 滴均应将溶液充分摇匀后再加第二滴，直至溶液呈草黄色；于沸水内保持 15 分钟，再静置 2 小时，滤过，即得。优点：无色，在倒管内早期发酵易观察，不易被还原。变色范围 pH6.07.4（红黄）。3.1.14曙红钠指示液：取曙红钠 2.0g，加水使溶解
12、成 100ml。3.1.15靛基质试液：取对二甲氨基苯甲醛 1.0g，加入 95%乙醇 95ml，充分振摇，使完全溶解后，取浓盐酸 20ml 徐徐滴入，边加边振摇，以免骤热导致溶液色泽变深，置冰箱保存，备用。3.2 培养基 3.2.1培养基的制备及储存3,2,1,1 溶化：一般应放在玻璃器皿或搪瓷器内。加入纯化水，隔水加热以促其溶解，加热时应经常搅拌，防止焦结，待其溶解后补足水分。3.2.1.2 在使用干燥培养基时，先将纯化水按定量加入容器中，然后称取一定量培养基干粉放入水中，静置 1015 分钟，搅拌，振荡，或延长时间以促进溶解，一般不要加热， 必要时加热，但时间不宜过长，温度不宜过高，避免
13、某些营养成分被破坏。3.2.1.3 校正酸碱度：培养基必须有适当的 pH 值。测定 pH 值是培养基配制过程中的重要步骤之一，干燥培养基一般已校正过pH 值，用时也必须再验证。pH 值测定时，一般用指示剂滴入培养基中观察其颜色的变化，或用 pH 计校正，如与所需 pH 值不符，可用酸或碱液加以校正。一般用氢氧化钠校正的弱碱性培养基，高压灭菌前培养基的 pH 值高 0.2 左右，灭菌后基本合适。调整 pH 值后要加热过滤，使培养基澄清。3.2.2 培养基的分装：3.2.2.1 液体、半固体培养基一般在高压灭菌前分装，约装试管容积的 1/3，在灭菌后还要加入成分的液体、半固体培养基，灭菌后再分装于
14、灭菌试管或锥形瓶中。3.2.2.2 固体培养基一般分装在 250 ml、500 ml 锥形瓶中，高压灭菌后根据需要分装平皿或试管。平皿：如倾注平皿，应在无菌室中放置 34 小时，如用塑料平皿须在 35培养箱中倒置 3060 分钟。水蒸气会自然蒸发。斜面：制备低层斜面分装于试管，约占容积的 1/5，灭菌后趁热斜放于细玻璃棒和木杆上，使成斜度，分装时注意管口和瓶塞上勿沾有培养基，避免污染。制备高层斜面分装于试管，约占试管容积的 1/3，灭菌后趁热放置成高层短斜面， 待其凝固后应用。3.2.3 培养基的灭菌：培养基的灭菌多采用高压蒸汽灭菌，各种培养基的灭菌时间和压力， 按其成分不同而定。普通培养基多
15、采用 121、103.42kPa 灭菌 15 分钟，但容器和装量较大时，可延长至 20 分钟。高压灭菌应严格按照操作规程进行，必须逐渐加热，彻底排除灭菌器内的冷空气，再逐渐升压保持预定的压力和时间，达到全杀灭微生物的目的。3.2.4 培养基的储存：保存培养基的时间需视培养基中水分蒸发的程度及有无污染而定，已制备好培养基要保存于冷暗处或冰箱中，但由于各种培养基的性质不同，不可能固定一个保存期限。制备好的平板或试管培养基，为防止水分蒸发，应置于塑料袋内，4保存，可延长使用期限。微量生化反应管熔封于细玻管内，室温下可保存1 年左右。3.3 注意事项：3.3.1 采用干燥培养基时，按说明配制，应对灭菌
16、后的培养基pH 值进行校验。若为自配培养基，原料应挑选，琼脂凝固力应测定，以确定配制时琼脂的用量。试剂规格要求应为化学纯（CP）以上规格，其中不能含有对细菌、霉菌、大肠杆菌生长有害的抑制物。3.3.2 配制的培养基不应该有沉淀，如有沉淀，应于溶化后趁热过滤，并应于 2 小时内灭菌，避免细菌繁殖。3.3.3 培养基的分装量不得超过容器的 2/3，以免灭菌时溢出。包装时，塞子必须塞紧，以免松动或脱落造成染菌。3.3.4 配制培养基的 pH 值测定时，其波动范围应在规定的pH0.2 之内，还需注意高压灭菌后的 pH 值变化。3.3.5 每批培养基均应有配制记录，包括名称、配制量（各种成分用量）、配制
17、者、校对者、配制日期以及性能和无菌试验。3.3.6 每批培养基在用于样品的分离鉴定之前均应作性能试验，以保证微生物检验的质量。性能试验须用已知标准菌株进行预试，符合要求方可应用。3.3.7 棉塞以普通棉花制作，棉塞松紧应适宜，过松易污染杂菌，过紧影响透气性；每次用后需高压灭菌并随即烘干，要防尘、防霉；变硬无弹力时需更换。3.3.8 各种试管应先配上合适的棉塞，待高压灭菌后再分装培养基，可防止污染。3.3.9 培养基配制时，应先将有沉淀物的原料如蛋白胨、牛肉膏、盐类和琼脂配好，经调节 pH 值、加热并煮沸溶化后再滤清；滤清时注意趁热过滤，滤除异物、沉淀后，应将蒸发失去的溶液量按原溶液量加纯化水补
18、足。3.3.10 应严格遵守各种培养基规定的灭菌温度和时间，灭菌后培养基不得有混浊现象， 每瓶配制并灭菌后的培养基、稀释剂均应在外表清楚标明灭菌日期。3.3.11 每批稀释剂、培养基均应有空白试验，合格后方能使用。3.3.12 灭菌后的培养基在冷暗处保存，放置时间不能过长，一般在两周内用完。久存培养基失水过多、固体干涸变形、液体出现沉淀、棉塞松弛或脱落者均不得使用。已熔化的培养基应一次用完，开启后不宜再用。3.3.13 勿用电炉直接熔化琼脂培养基，以免营养成份过度受热而破坏，应用水浴或微波炉加热。4. 检查总则（1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法）4.1 微生物计数法适用范围：系
19、用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检査。如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检査时，若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。4.2 微生物计数法4.2.1 适用性试验用菌株(表1)计数培养基适用性检查计数方法适用性试验试验菌试验菌液株的制备需氧菌总数霉菌和酵母需氧菌总数霉菌和酵母计数菌总数计数计数菌总数计数金
20、黄色葡胰酪大豆胨胰酪大豆胨琼胰酪大豆胨琼萄球菌琼脂培养基脂培养基和胰脂培养基或胰( Staphylo或胰酪大豆酪大豆胨液体酪大豆胨液体coccus a u胨液体培养培养基，培养培养基（M P Nreu基，培养温度温度 30-35 法），培养温度s) C C M30 35培养时间不超30-35 ,培养C C (B )C，培养时过 3 天，接种时间不超过 326 003间量不大于天，接种量不1824 小时100cfu大于 100cfu铜绿假单胰酪大豆胨胰酪大豆胨琼胰酪大豆胨琼胞菌琼脂培养基脂培养基和胰脂培养基或胰(Pseudom或胰酪大豆酪大豆胨液体酪大豆胨液体onas胨液体培养培养基，培养培养基
21、（M P Naeruginosa基，培养温度温度 30-35 法），培养温)30-35，培培养时间不超度 30-35，培CCMCC养时间 18过 3 天，接种养时间不超过( B )24 小时量 不 大 于3 天，接种量不10 104100cfu大于 100cfu枯草芽孢胰酪大豆胨胰酪大豆胨琼胰酪大豆胨琼杆菌琼脂培养基脂培养基和胰脂培养基或胰.Bacill或胰酪大豆酪大豆胨液体酪大豆胨液体us胨液体培养培养基，培养培养基（M P Nsubtilis基，培养温度温度 30-35法），培养温)30-35培养培养时间不超度 30-35，培 CMCC(B时 间 18-24过 3 天，接种养时间不超过 3
22、)63 501小时量不大于天，接种量不大lOOcfu于 lOOcfu白色念珠沙氏葡萄糖胰酪大豆胨琼沙氏葡萄糖胰酪大豆胨琼沙氏葡萄糖菌(Candida琼脂培养基或沙氏葡萄脂培养基，培养温度琼 脂 培 养基，培养温脂培养基（法不适用）培琼 脂 培 养基，培养温albicans糖液体培养30-35 培养度 20-25养温度 3 0 3度 20-25 )基，培养温度时间不超过 5培养时间不5 C，培养培养时间不CCMCC(F)20-25培养天，接种量不超过 5 天，时间不超过 5超过 5 天，98 001时间 2-3 天大于 lOOcfu接种量不大天，接种量不大接种量不大于 lOOcfu于 lOOcf
23、u于 lOOcfuM P N标题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共 19 页第 7 页M C C (F )养基，培养温时间不超过 5培养时间不30-35培养培养时间不98 003度 20-25天，接种量不超过 5 天，时间不超过 5超过 5 天，培养时间 5大于 lOOcfu接种量不大天，接种量不接种量不大7 天，或直到获得丰富于 lOOcfu大于 lOOcfu于 lOOcfu的孢子黑 曲 霉（Asper 君山 wsniger)C C沙氏葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度沙氏葡萄糖琼 脂 培 养基，培养温度 20-25 胰酪大豆胨琼脂培养
24、基（法不适用）培M P N沙氏葡萄糖琼 脂 培 养基，培养温30-35 培 养养温度 度 20-25 注：当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时，应进行培养基适用性检查， 检査方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基。4.2.2 计数方法：包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-NumberMethod, 简称 MPN 法）。MPN 法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，M P N法可能是更适合的方法。供试品检查时，应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，检测的样品量应能保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。所选方法的适用
25、性须经确认。计数培养基适用性检査和供试品计数方法适用性试验供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。4.2.3 菌种及菌液制备4.2.3.1 菌种试验用菌株的传代次数不得超过 5 代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第 0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。4.2.3.2 计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验用菌株见（表 1）。菌液制备按(表 1)规定程序培养各试验菌株。取金黄色葡萄球菌、铜
26、绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用 PH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加人 35ml 含 0. 05% (m l/m l)聚山梨酯8 0 的 pH7_0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后， 采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含 0.05%(ml/ml)聚山梨酯 80 的 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或 0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在 2 小时内使用；若保存在 28，可在 2 4 小时内使用。黑曲霉孢子悬液
27、可保存在 28 ,在验证过的贮存期内使用。4.2.4 阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。4.2.5 培养基适用性检査微生物计数用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。按(表1) 规定，接种不大于lOOcfu的菌液至胰酪大豆胨液体培养基管或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置表1 规定条件下培养。每一试验编码：KF-SOP-07-13-2标题微生物限度检查操作规程共 19 页第 9 页菌株平行制备2 管或2 个平皿。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试
28、验。被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.52 范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。4.3 计数方法适用性试验4.3.1 供试液制备根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时，应均勻加热，且温度不应超过45。供试液从制备至加入检验用培养基，不得 超过1 小时。常用的供试液制备方法如下（如果下列供试液制备方法经确认均不适用， 应建立其他适宜的方法）4.3.1.1 水溶性供试品取供试品，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或PH7. 2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨
29、液体培养基溶解或稀释制成1 : 1 0供试液。若需要，调节供试液p H值至68。必要时，用同一稀释液将供试液进一步1 0倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。4.3.1.2 水不溶性非油脂类供试品取供试品，用pH7. 0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或PH7. 2 磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基制备成1 : 1 0供试液。分散力较差的供试品，可在稀释液中加人表面活性剂如0.1 %的聚山梨酯80,使供试品分散均匀。若需要，调节供试液p H 值至68。必要时，用同一稀释液将供试液进一步1 0倍系列稀释。4.3.1.3油脂类供试品取供试品，加人无菌十四烷酸异丙酯使溶解，或与
30、最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯8 0或其他无抑菌性的无菌表面活性剂充分混勻。表面活性剂的温度一般不超过4 0 t：(特殊情况下，最多不超过45C) ，小心混合，若需要可在水浴中进行，然后加人预热的稀释液使成1 : 1 0 供试液，保温，混合，并在最短时间内形成乳状液。必要时，用稀释液或含上述表面活性剂的稀释液进一步10倍系列稀释。4.3.1.4 需用特殊方法制备供试液的供试品膜剂供试品取供试品，剪碎，加 P H 7 .0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或 P H 7 .2 磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基，浸泡， 振摇，制成 1 : 1 0 的供试液。若需要，调节供试液 p H 值至 6
31、8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步 10 倍系列稀释。肠溶及结肠溶制剂供试品取供试品，加人P H 6 .8 无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）或 PH7. 6 无菌磷酸盐缓冲液(用于结肠溶制剂）， 置 45水浴中，振摇，使溶解，制成1:10 的供试液。必要时，用同一稀释液将供试液进一步 10 倍系列稀释。4.3.1.5 气雾剂、喷雾剂供试品取供试品，置一20C或其他适宜温度冷冻约1小时，取出，迅速消毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。供试品亦可采用其他适宜的方法取出。用无菌注射器从每一容器中吸出药液于无菌容器中混合，然后取样检査。4.
32、3.1.6 贴剂供试品取供试品，去掉防粘层，将粘贴面朝上放置在无菌玻璃或塑料器皿上，在粘贴面上覆盖一层适宜的无菌多孔材料(如无菌纱布），避免贴膏剂粘贴在一起。将处理后的贴膏剂放入盛有适宜体积并含有表面活性剂（如聚山梨酯8 0或卵磷脂）稀释液的容器中，振荡至少3 0分钟。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。4.3.2. 接种和稀释按下列要求进行供试液的接种和稀释，制备微生物回收试验用供试液。所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%。为确认供试品中的微生物能被充分检出，首先应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性试验。4.3.2.1 试验组取上述制备好的供试液，加入试验菌液，混勻，使
33、每lm l供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于lOOcfu。4.3.2.2 供试品对照组取制备好的供试液，以稀释液代替菌液同试验组操作。4.3.2.3 菌液对照组取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液，按试验组操作加人试验菌液并进行微生物回收试验。4.3.2.4 若因供试品抗菌活性或溶解性较差的原因导致无法选择最低稀释级的供试液进行方法适用性试验时，应采用适宜的方法对供试液进行进一步的处理。如果供试品对微生物生长的抑制作用无法以其他方法消除，供试液可经过中和、稀释或薄膜过滤处理后再加人试验菌悬液进行方法适用性试验。4.4 抗菌活性的去除或灭活供试液接种后，按下列“微生物回收” 规定
34、的方法进行微生物计数。若试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值小于菌液对照组菌落数值的50% ,可采用下述方法消除供试品的抑菌活性。4.4.1 增加稀释液或培养基体积。4.4.2 加入适宜的中和剂或灭活剂。中和剂或灭活剂（表 2 )可用于消除干扰物的抑菌活性，最好在稀释液或培养基灭菌前加入。若使用中和剂或灭活剂，试验中应设中和剂或灭活剂对照组，即取相应量稀释液替代供试品同试验组操作，以确认其有效性和对微生物无毒性。中和剂或灭活剂对照组的菌落数与菌液对照组的菌落数的比值应在 0 .5 2 范围内。表2 常见干扰物的中和剂或灭活方法干扰物可选用的中和剂或灭活方法戊二醛、汞制剂亚硫酸氢钠酚类、乙醇、
35、醛类、吸附物稀释法醛类甘氨酸季铵化合物、对羟基苯甲酸、双卵磷脂胍类化合物季铵化合物、碘、对羟基苯甲酸聚山梨酯 水银巯基醋酸盐水银、汞化物、醛类硫代硫酸盐EDTA、唆喏酮类抗生素镁或钙离子磺胺类对氨基苯甲酸内酰胺类抗生素 内酰胺酶4.4.3 采用薄膜过滤法4.4.4 上述几种方法的联合使用。若没有适宜消除供试品抑菌活性的方法，对特定试验菌回收的失败，表明供试品对该试验菌具有较强抗菌活性，同时也表明供试品不易被该类微生物污染。但是，供试品也可能仅对特定试验菌株具有抑制作用，而对其他菌株没标题微生物限度检查操作规程编码：KF-SOP-07-13-2共 19 页第 10 页有抑制作用。因此，根据供试品
36、须符合的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响检验结果判断的前提下，应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行计数方法适用性试验。若方法适用性试验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检査。4.5 供试品中微生物的回收表1所列的计数方法适用性试验用的各试验菌应逐一进行微生物回收试验。微生物的回收可采用平皿法、薄膜过滤法或M PN法。4.5.1 平皿法平皿法包括倾注法和涂布法。表 1 中每株试验菌每种培养基至少制备 2 个平皿，以算术均值作为计数结果。倾注法：取照上述“ 供试液的制备” “ 接种和稀释”和“抗菌活性的去除或灭活” 制备的供试液 lml，置直径 90mm 的
37、无菌平皿中，注入 1520ml 温度不超过 45熔化的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀， 凝固，倒置培养。若使用直径较大的平皿，培养基的用量应相应增加。按表1 规定条件培养、计数。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。计算各试验组的平均菌落数。涂布法：取 1520ml 温度不超过 45的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，注人直径 90mm 的无菌平皿，凝固，制成平板，采用适宜的方法使培养基表面干燥。若使用直径较大的平皿，培养基用量也应相应增加。每一平板表面接种上述照“供试液的制备” “接种和稀释” 和“抗菌活性的去除或灭活” 制备的供试液不少于 0.1ml。按表1 规定条件培养、
38、计数。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。计算各试验组的平均菌落数。4.5.2 薄膜过滤法薄膜过滤法所采用的滤膜孔径应不大于0.45pm，直径一般为50mm，若采用其他直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。供试品及其溶剂应不影响滤膜材质对微生物的截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品， 其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量一般为100ml。总冲洗量不得超过1000
39、ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。取照上述“供试液的制备” “ 接种和稀释” 和“抗菌活性的去除或灭活” 制备的供试液适量（一般取相当于lg 、lm l或10cm2的供试品，若供试品中所含的菌数较多时，供试液可酌情减量），加至适量的稀释液中，混匀，过滤。用适量的冲洗液冲洗滤膜。若测定需氧菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上；若测定霉菌和酵母总数，转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上。按表1 规定条件培养、计数。每株试验菌每种培养基至少制备一张滤膜。同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。4.5.3 MPN法M P N法的精密度和准确度不及薄膜过滤法和平皿计数法，仅在供
40、试品需氧菌总数没有适宜计数方法的情况下使用，本法不适用于霉菌计数。若使用M P N法， 按下列步骤进行。取照上述“供试液的制备” “ 接种和稀释” 和“ 抗菌活性的去除或灭活” 制备的供试液至少 3 个连续稀释级，每一稀释级取 3 份 lm l 分别接种至 3 管装有 910ml 胰酪大豆胨液体培养基中，同法测定菌液对照组菌数。必要时可在培养基中加入表面活性剂、中和剂或灭活剂。接种管置 3035C 培养 3 天，逐日观察各管微生物生长情况。如果由于供试品的原因使得结果难以判断，可将该管培养物转种至胰编码：KF-SOP-07-13-2标题微生物限度检查操作规程共 19 页第 12 页酪大豆胨液体
41、培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基，在相同条件下培养 1 2 天，观察是否有微生物生长。根据微生物生长的管数从表 3 查被测供试品每 l g 或每 lm l 中需氧菌总数的最可能数。表 3 微生物最可能数检索表生长管数每管含样品的g 或m l数需氧菌总数最可能数95%置信限0. 10. 010.0010001100注：表内所列检验量如改用l g (或m l )、0. l g ( 或m l )和O.Olg(或m l )时，表内数字应相应降低1 0 倍；如改用O .O lg ( 或m l)、O.OOlg( 或m l )和O.OOOlg( 或m l )时，表内数字应相应增加1 0 倍，其余类推。5. 微生物计数法检查5.1 计数方法适用性试验中，采用平皿法或薄膜过滤法时，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在 0 .52 范围内；采用 M P N 法时，试验组菌数应在菌液对照组菌数的 95%置信限内。若各试验菌的回收试验均符合要求，照所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计 数。方法适用性确认时，若采用上述方法还存在一株或多株试验菌的回收达不到要求， 那么选择回收最接近要求的方法和试验条件进