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1、第四章 酶学分析技术1 1、掌握掌握酶活性的国际单位定义，酶活性浓度的表示方法及酶活性单位酶活性的国际单位定义，酶活性浓度的表示方法及酶活性单位的计算公式；酶活性测定的连续监测法和定时法的概念、区别和结果的计算公式；酶活性测定的连续监测法和定时法的概念、区别和结果的计算方法；酶偶联反应的在酶活性测定和酶法分析代谢物中的应用；的计算方法；酶偶联反应的在酶活性测定和酶法分析代谢物中的应用；以以NADNAD（P P）H H为指示系统和色素原底物在酶活性测定中的应用为指示系统和色素原底物在酶活性测定中的应用.n本章学习要求：本章学习要求：2 2、熟悉熟悉酶促反应进程；酶促反应底物动力学；酶学分析在临床
2、诊断上酶促反应进程；酶促反应底物动力学；酶学分析在临床诊断上的应用。的应用。3 3、了解了解KmKm值、值、VmaxVmax值的应用及值的应用及KmKm和和VmaxVmax的测定；同工酶测定和酶活性的测定；同工酶测定和酶活性测定最适条件的选择。测定最适条件的选择。v酶是由活组织细胞合成的具有催化功能的一类特殊酶是由活组织细胞合成的具有催化功能的一类特殊蛋白质，又称催化剂。在酶学中，常把由酶催化的蛋白质，又称催化剂。在酶学中，常把由酶催化的化学反应成为酶反应，酶作用的物质称为底物（亦化学反应成为酶反应，酶作用的物质称为底物（亦称基质），酶催化一定化学反应的能力称酶活性或称基质），酶催化一定化学反
3、应的能力称酶活性或酶活力，酶失去其催化能力称为酶失活。酶活力，酶失去其催化能力称为酶失活。v酶活性的大小可以用在一定条件下，测定单位时间酶活性的大小可以用在一定条件下，测定单位时间下酶促化学反应的速度来表示。下酶促化学反应的速度来表示。第一节第一节 酶活性测定的基本知识酶活性测定的基本知识一、酶活性的概念一、酶活性的概念一、酶活性的概念一、酶活性的概念 酶活性酶活性即酶促反应速度，指在规定条件下单位时即酶促反应速度，指在规定条件下单位时间内底物的减少量或产物的生成量。间内底物的减少量或产物的生成量。底物浓度为底物浓度为S S,产物浓度为产物浓度为P P,时间为时间为t t，反应速度为，反应速度
4、为v vv=-dS/dt 或或 v=dP/dt。注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的生成量为好。生成量为好。一、酶活性的概念一、酶活性的概念v血液及其他体液标本的酶活性测定是临床化学检验中最常见的检验项目，其测定的结果类临床医师对疾病的诊断、治疗及预后提供了极为有用的信息。v临床常见的血清酶活性测定项目有：丙氨酸氨基转移酶（ALT或GPT），乳酸脱氢酶（LDH），肌酸激酶（CK）等。二、酶活性单位v酶是极微量的蛋白质，临床化学检验难以直接测定酶蛋白的绝对含量。有用酶是一类催化效率极高的生物催化剂，微量的酶可以催化大量的底物发生
5、化学反应，故临床以酶的活性测定取代酶的含量测定，以酶活性单位来间接表示酶的浓度大小。v定义：定义：指在一定条件下使酶促反应达到某一指在一定条件下使酶促反应达到某一速度时所需要的酶量。酶活性单位是一个人速度时所需要的酶量。酶活性单位是一个人为规定的标准。为规定的标准。二、酶活性单位v酶活性单位表示方法v1、习惯单位：（也称惯用单位）由酶活性测定方法的建立酶活性测定方法的建立者所规定的单位。者所规定的单位。它是任意选择时间与量的单位。由于不同它是任意选择时间与量的单位。由于不同的酶，甚至同一种酶不同的测定方法都有不同的单位定义，的酶，甚至同一种酶不同的测定方法都有不同的单位定义，没有统一的标准，故
6、临床上采用习惯单位表示的测定结果不没有统一的标准，故临床上采用习惯单位表示的测定结果不能比较，更不能替代，但因某些酶类测定尚无统一的测定方能比较，更不能替代，但因某些酶类测定尚无统一的测定方法，故习惯单位目前仍然被沿用。法，故习惯单位目前仍然被沿用。v如：如：100ml血清中的血清中的AMS，在，在3715min水解水解5mg淀粉为一淀粉为一个个AMS单位。单位。v大多数酶的习惯单位定义中，样品的用量通常为大多数酶的习惯单位定义中，样品的用量通常为100ml，而，而对底物的减少量或产物的生成量却未作统一的规定。对底物的减少量或产物的生成量却未作统一的规定。二、酶活性单位v酶活性单位表示方法v2
7、、1976年国际生化学会酶学委员会规定：在特定的条件下（如温度25、最适PH、最适底物浓度时），每分钟催化1mol底物转化为产物所需要的酶量为1个酶活性国际单位（U或IU）。由于酶的国际单位定义中并不包含体积，所以临床酶学中一般以每升或每毫升的样品体积单位，因此酶的活性可用U/L（IU/L）,或U/ml（IU/ml）表示，即1升或1毫升标本（如血清）中含的酶量。二、酶活性单位v酶活性单位表示方法v3、1979年该学会又推荐以催量单位（Katal）来表示酶的活性。vKatal单位单位：1Katal指在规定条件下，每秒钟指在规定条件下，每秒钟转化转化1mol底物的酶量。底物的酶量。二、酶活性单位n
8、中间产物学说：中间产物学说：酶促反应进行时，酶促反应进行时，酶首先与底物结合为中酶首先与底物结合为中间产物，然后再催间产物，然后再催化底物反应生成产物。化底物反应生成产物。E+SESE+P三、酶促反应动力学级级反应级数反应级数0级级 P S 反应时间反应时间 t三、酶促反应动力学v如果将酶反应中底物浓度S或产物浓度P对时间t做图，可得到酶促反应时间进程曲线。v由图看出，在酶反应的线性期内，P和S的变化量与时间呈线性关系，其变化量相当于直线的斜率K。三、酶促反应动力学第二节、酶学分析的类型第二节、酶学分析的类型v一、工具酶 工具酶：工具酶：将作为试剂用于测定待测酶活性或底物浓度的酶。将作为试剂用
9、于测定待测酶活性或底物浓度的酶。偶偶 联：联：工具酶与待测酶、工具酶与工具酶之间的联合。工具酶与待测酶、工具酶与工具酶之间的联合。工具酶有工具酶有氧化还原酶类、转移酶类和水解酶类氧化还原酶类、转移酶类和水解酶类一、工具酶一、工具酶常用工具酶的名称及其缩写符号常用工具酶的名称及其缩写符号 名名 称称 缩写符号缩写符号 名名 称称 缩写符号缩写符号乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 LDH苹果酸脱氢酶苹果酸脱氢酶 MDH6-磷酸葡萄糖脱氢酶磷酸葡萄糖脱氢酶 G6PD谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶 GLDH葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 GOD胆固醇氧化酶胆固醇氧化酶 COD磷酸甘油氧化酶磷酸甘油氧化酶 GPO过氧化物酶过氧
10、化物酶 POD己糖激酶己糖激酶 HK肌酸激酶肌酸激酶 CK丙酮酸激酶丙酮酸激酶 PK甘油激酶甘油激酶 GK脂蛋白脂肪酶脂蛋白脂肪酶 LPL胆固醇酯酶胆固醇酯酶 CE二、酶活性的测定方法v1、定时法 测定酶反应开始后在某一时间内（t1到t2）产物或底物浓度的总变化量来求酶反应初速度的方法。由于t1到t2是整个反应过程中的两个点，故又称两点法。v2、连续监测法 连续测定（每个15s1min监测一次）酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化，来求酶反应初速度的方法。亦称动力学法或速率法。该法也被国际临床化学学会（IFCC）推荐位酶活性测定的标准化参考方法。v3、平衡法 通过测定酶反应开始至反
11、应达到平衡点时产物或底物浓度总变化量来求酶活性的方法。亦称终点法。三、酶活性单位的计算三、酶活性单位的计算n步骤：步骤：运用公式进行计算。运用公式进行计算。明确测定方法的明确测定方法的酶单位定义酶单位定义，按照酶单位，按照酶单位定义确定物质量、体积和时间的单位，定义确定物质量、体积和时间的单位，产物的增加量产物的增加量 每单位规定的保温时间每单位规定的保温时间 10001000（mlml）酶单位酶单位/升升 =每单位规定的产物增加量每单位规定的产物增加量 实际保温时间实际保温时间 实际标本用量（实际标本用量（mlml）分光光度法测定的公式：分光光度法测定的公式：（A A测定测定 A A对照）对
12、照）VV总总10106 6 每单位规定的保温时每单位规定的保温时间间酶单位酶单位/升升 =LVLV标标 实际保温时间实际保温时间三、酶活性单位的计算三、酶活性单位的计算标准曲线法公式：第三节、影响酶活性测定的因素v一、标本v1、溶血 红细胞中某些酶的活性比血清高。v2、抗凝剂 某些抗凝剂课抑制酶的活性。因此一般都采用血清做标本，确实需要使用血浆的，则使用肝素抗凝。v 3、样品存放时间 各种血清酶的稳定性不同，故而存放时间及存放方法不同都会影响到酶的活性。第三节、影响酶活性测定的因素v二、测定条件v酶活性易受到条件如温度、PH、底物浓度等影响。因此，在酶活性测定时，要控制在最佳条件下进行。这样，
13、不仅酶的活性最高，相对误差最小，而且酶活性受测定条件变化的影响也小。在此主要介绍底物浓度对酶活性影响及反映相互关系的米氏方程。第三节、影响酶活性测定的因素n米米-曼氏方程：曼氏方程：VmaxSv=S+Km 上式中上式中v v代表反应速度，代表反应速度，VmaxVmax代表最大反应速度，代表最大反应速度，S S代表底物浓度，代表底物浓度，KmKm称为米氏常数。称为米氏常数。第三节、影响酶活性测定的因素由米由米-曼氏方程可以导出：曼氏方程可以导出：（Vmax-v）SKm=v 当当v=1/2Vmaxv=1/2Vmax时，时，Km=Km=S S。因此。因此KmKm值为反应速度相当于值为反应速度相当于最
14、大反应速度一半时的底物浓度。最大反应速度一半时的底物浓度。KmKm值是酶的特征常数值是酶的特征常数，具有重，具有重要的应用价值。要的应用价值。第三节、影响酶活性测定的因素Km值的应用值的应用 Km值是酶的特征常数，在反应条件一定时，只与值是酶的特征常数，在反应条件一定时，只与酶的种类和底物的性质有关，与酶的浓度无关。酶的种类和底物的性质有关，与酶的浓度无关。不同种不同种类的酶其类的酶其Km值不同，对于一种未知的酶，可在规定的值不同，对于一种未知的酶，可在规定的条件下测定其条件下测定其Km值加以鉴定。值加以鉴定。第三节、影响酶活性测定的因素第三节、影响酶活性测定的因素v测定酶活性时注意事项：v1
15、、要规定反应条件v2、标本要新鲜v3、配制的底物浓度应准确且足够大，底物溶液中应加入不抑制该酶活性的防腐剂并冰箱保存，以防止底物被分解或变质v4、在测定过程中所用器材应绝对清洁，不应含有酶的抑制物v5、使酶活性测定在线性期内进行，第三节、影响酶活性测定的因素v测定酶活性时注意事项：v6、应正确设计适当的对照管，以消除所测结果中非酶反应生成的那一部分。测定管中的产物量必须减去对照管中的产物量才是有酶催化生成的产物量。v（1）、样品对照：只加样品不加底物v（2）、底物对照：不加样品只加底物v（3）、时间对照：含有酶和底物但反应时间为零的对照管；也可以先用蛋白沉淀剂或其他试剂停止反应后，再加底物予以抵销。