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1、第二部分 微生物的代谢生物大分子降解为小分子代谢中间体-丙酮酸TCA环发酵与呼吸代谢中能量的释放与利用合成代谢次级代谢与调节代谢控制发酵发酵工艺基础知识生物大分子分解微生物发酵基质主要包括淀粉、蛋白质、纤维素、果胶、核酸、脂类等淀粉淀粉淀粉酶液化型糖化型（a淀粉酶）葡糖生成酶淀粉酶异淀粉酶葡萄糖葡萄糖1、（淀粉1，4葡萄糖苷酶）（淀粉1，6葡萄糖苷酶）（淀粉1，4麦芽糖苷酶）工业上常用的碳源（工业上常用的碳源（carbon sourcecarbon source）1.1.谷物淀粉（玉米、马铃薯、木薯淀粉）谷物淀粉（玉米、马铃薯、木薯淀粉）应用最广。应用最广。使用条件：使用条件：微生物必须能分泌
2、水解淀粉、糊精的酶类。微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类。缺点：缺点：a.a.难利用、发酵液比较稠、一般难利用、发酵液比较稠、一般2.0%2.0%时加入时加入 一定的一定的-淀粉酶。淀粉酶。b.b.成分较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等。成分较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等。优点：优点：来源广泛、价格低，可解除葡萄糖效应。来源广泛、价格低，可解除葡萄糖效应。2.2.葡萄糖葡萄糖所有的微生物都能利用葡萄糖，但会引起葡所有的微生物都能利用葡萄糖，但会引起葡萄糖效应。萄糖效应。工业上常用淀粉水解糖工业上常用淀粉水解糖,但是糖液必须达到一但是糖液必须达到一定的质量指标。定的质量指标。DEDE值：值：dex
3、trose equivalent valuedextrose equivalent value （葡萄糖当量值）葡萄糖当量值）表示淀粉糖的含糖量。表示淀粉糖的含糖量。还原糖含量（）还原糖含量（）DEDE值值 100100 干物质含量（）干物质含量（）淀粉水解糖的制备方法及原理淀粉水解糖的制备方法及原理（一）酸解法（一）酸解法（acid hydrolysis methodacid hydrolysis method）以酸为催化剂，在高温高压下使淀粉以酸为催化剂，在高温高压下使淀粉水解生成葡萄糖的方法。水解生成葡萄糖的方法。1.1.水解过程：水解过程：总反应式：总反应式：(C(C6 6H H101
4、0O O5 5)n n+nH+nH2 2O nCO nC6 6H H1212O O6 6过程：过程：(C(C6 6H H1010O O5 5)n n (C(C6 6H H1010O O5 5)x x C C1212H H2222O O11 11 C C6 6H H1212O O6 6 淀粉淀粉 糊精糊精 麦芽糖麦芽糖 葡萄糖葡萄糖 H H+对作用点无选择性，对作用点无选择性，-1,4-1,4-糖苷键和糖苷键和-1,6-1,6-糖苷糖苷键均被切断。键均被切断。评价评价优点：工艺简单，水解时间短，生产效率高，设备周转快。优点：工艺简单，水解时间短，生产效率高，设备周转快。缺点：缺点：（1）副产物多
5、，影响糖液纯度，一般）副产物多，影响糖液纯度，一般DE值只有值只有90左右。左右。（2）对淀粉原料要求严格，不能用粗淀粉，只能用纯度较高的精制）对淀粉原料要求严格，不能用粗淀粉，只能用纯度较高的精制淀粉。淀粉。淀粉淀粉 葡萄糖葡萄糖 复合二糖复合二糖 5 5羟甲基糠醛羟甲基糠醛 复合低聚糖复合低聚糖 有机酸、有色物质有机酸、有色物质损失葡萄糖量损失葡萄糖量 7 7 11复合反应复合反应分解反应分解反应盐酸盐酸酶解法酶解法（enzyme hydrolysis methodenzyme hydrolysis method）用专一性很强的淀粉酶及糖化酶将淀粉用专一性很强的淀粉酶及糖化酶将淀粉水解为葡
6、萄糖的工艺。水解为葡萄糖的工艺。分两步：分两步：（1 1）液化：液化：用用-淀粉酶将淀粉转化为糊精和低聚糖淀粉酶将淀粉转化为糊精和低聚糖（2 2）糖化：用糖化酶（又称葡萄糖淀粉酶）将糊精）糖化：用糖化酶（又称葡萄糖淀粉酶）将糊精 和低聚糖转化为葡萄糖。和低聚糖转化为葡萄糖。所以，淀粉的液化和糖化均在酶作用下进行，又所以，淀粉的液化和糖化均在酶作用下进行，又称双酶法称双酶法(double enzyme hydrolysis method)(double enzyme hydrolysis method)。1.1.液化（液化（liquificationliquification）2.2.淀粉酶水解
7、底物内部的淀粉酶水解底物内部的 1,41,4糖糖苷键，不能水解苷键，不能水解 1,61,6糖苷键，一般采用耐糖苷键，一般采用耐高温淀粉酶，使液化速度加快。高温淀粉酶，使液化速度加快。85859090度度 。液化程度的控制（液化后需糖化的原因）液化程度的控制（液化后需糖化的原因）a.a.糖液的糖液的DEDE值低（值低（-淀粉酶不能水解淀粉酶不能水解-1,6-1,6糖苷键）糖苷键）b.b.液化在较高温度下进行，液化时间加长，淀粉老化，液化在较高温度下进行，液化时间加长，淀粉老化，使糖化酶难以利用。使糖化酶难以利用。c.c.糖化酶水解的底物分子要求有一定的大小范围。糖化酶水解的底物分子要求有一定的大
8、小范围。根据生产经验，根据生产经验，DEDE值在值在2020 3030之间为好，之间为好，液化终点可通过碘液判断，此时呈棕色。液化终点可通过碘液判断，此时呈棕色。2.2.糖化（糖化（saccharificationsaccharification）糖化酶从非还原性末端水解糖化酶从非还原性末端水解-1,4-1,4糖苷键糖苷键和和-1,6-1,6糖苷键。糖苷键。终点确定：终点确定：DEDE值达最高时，停止酶反应。值达最高时，停止酶反应。3.3.评价评价 优点优点：（1 1）反应条件温和，不需高温、高压设备。）反应条件温和，不需高温、高压设备。（2 2）副反应少，水解糖液纯度高。）副反应少，水解糖液
9、纯度高。（3 3）对原料要求粗放，可用粗原料并在较高淀粉乳浓）对原料要求粗放，可用粗原料并在较高淀粉乳浓 度下水解。度下水解。（4 4）糖液颜色浅，质量高。）糖液颜色浅，质量高。缺点：缺点：（1 1）生产周期长，一般需要）生产周期长，一般需要4848小时。小时。（2 2）需要更多的设备，且操作严格。）需要更多的设备，且操作严格。（三）酸酶结合法（三）酸酶结合法 （acid-enzyme hydrolysis methodacid-enzyme hydrolysis method）集酸解法和酶解法的优点而采取的生产集酸解法和酶解法的优点而采取的生产工艺。根据原料淀粉性质分：工艺。根据原料淀粉性质
10、分：1.1.酸酶法：先将淀粉酸水解成糊精和低聚酸酶法：先将淀粉酸水解成糊精和低聚糖，再用糖化酶将其水解为葡萄糖。糖，再用糖化酶将其水解为葡萄糖。2.2.适用：淀粉颗粒坚硬（如玉米、小麦）的原适用：淀粉颗粒坚硬（如玉米、小麦）的原料，若用料，若用-淀粉酶液化，短时间液化，反应淀粉酶液化，短时间液化，反应往往不彻底往往不彻底。2.2.酶酸法：先用酶酸法：先用-淀粉酶液化，再用酸水解。淀粉酶液化，再用酸水解。适用：颗粒大小不一（如碎米淀粉）的淀适用：颗粒大小不一（如碎米淀粉）的淀粉原料，若用酸法，则水解不均匀。粉原料，若用酸法，则水解不均匀。（四）不同糖化工艺的比较（四）不同糖化工艺的比较项目项目酸
11、解法酸解法酸酶结合法酸酶结合法酶酶解法解法DEDE值值919195959898羟羟甲基糠醛（）甲基糠醛（）0.30.30.0080.0080.0030.003色度色度10100.30.30.20.2淀粉转化率淀粉转化率909095959898工艺条件工艺条件高温加压高温加压高温加压高温加压常温常温过程耗能过程耗能多多多多少少副副产物产物多多中中少少生产周期生产周期短短中中长长设备规模设备规模小小中中大大防腐要求防腐要求高高较高较高低低适合发酵工艺情况适合发酵工艺情况 差差中中有利有利2.纤维素的降解纤维素是自然界中最丰富的可再生资源，占地球总生物量的40%，它也是地球生物圈碳素和能量循环的主要
12、部分。由于纤维素具有水不溶性的高结晶构造，其外围又被木质素层包围着，要把它水解成可利用的葡萄糖相当困难，所以到目前为止仍没有得到很好地利用。近几年随着原油价格的不断攀升，纤维素资源的利用引起了世界各国的极大关注和高度重视。我国出于对能源战略的考虑，近几年也加大了对纤维素利用的研究的投入。（1）纤维素的结构天然纤维素是由D-吡喃式葡萄糖通过-1,4-糖苷键结合形成的线形长链分子，约由700-150,000个左右的残基所构成，一般在3000个左右。通过分子间的氢键(O3-HO5andO6 H-O2)和分子链间的氢键(O6-H O3)形成网状平面并通过疏水面的堆积构成纤维素的晶体结构。O3-HO5O
13、6 H-O2O6-H O3天然纤维素除了我们上面提到的结晶结构外，还有非结晶区。如下图。结晶区无定形区微生物降解纤维素的酶系降解和利用水不溶性的纤维素，微生物必须产生相应的酶。在过去二十几年里，根据酶对纤维素作用方式的研究，将纤维素降解的酶类分成三类：(i)纤维素内切酶 endoglucanases or 1,4-D-glucan-4-glucanohydrolases(EC 3.2.1.4)(ii)纤维素外切酶 exoglucanases,including 1,4-D-glucan glucanohydrolases(also known as cellodextrinases)(EC 3
14、.2.1.74)and 1,4Dglucan cellobiohydrolases(cellobiohydrolases)(EC 3.2.1.91)(iii)葡萄糖苷酶-glucosidases or-glucoside glucohydrolases(EC3.2.1.21).纤维素内切酶随机在纤维素的无定形区将糖链切断，产生新的链端。纤维素外切酶作用于纤维素链的两端产生纤维二糖。葡萄糖苷酶降解纤维素湖精和纤维二糖为葡萄糖。教材上也将纤维素酶分为三种C1酶、CX酶及葡萄糖苷酶天然纤维素短链纤维素葡萄糖纤维二糖纤维寡糖纤维二糖葡萄糖C1酶CX酶葡萄糖苷酶by Small Angle X-ray
15、Scattering.J.Biol.Chem.Vol.277 pp.4088740892,2002纤维素酶的结构可以分成三个部分：催化结构域、吸附结构域和连接肽。纤维素酶对纤维素的作用是一个识别、吸附和催化的过程。纤维素酶的结构和作用机理3、果胶半乳糖醛酸以a-1，4糖苷键形成的直链高分子化合物，常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等组成的侧链，游离的羧基部分或全部与钙、钾、钠离子，特别是与硼化合物结合在一起 75%羧基甲基化成甲酯从广义上讲，果胶酶可以被分为3种类型：原果胶酶：可以把不溶于水的原果胶分解为可溶于水的高聚合体果胶；果胶甲酯水解酶：脱去果胶中的甲氧基基团，促使果胶
16、的脱甲酯作用；果胶聚半乳糖醛酸（解聚酶）：促使果胶中D-半乳糖醛酸的-1，4糖苷键的裂解。目前国内外研究和应用较多的果胶酶产生菌是细菌和霉菌，也有链霉菌产生果胶酶的报道。在细菌中，欧文氏杆菌(Erwiniasp.)、芽孢杆菌(Bacillussp.)、节杆菌(Arthrobactersp.)和假单胞杆菌(Pseodomonassp.)都产生果胶酶。嗜碱性芽孢杆菌属和欧文氏杆菌属主要用于在苎麻和红麻的脱胶、生物制浆及污物的处理软化等方面，应用前景可观，受到较多的关注和研究。已见报道的产果胶酶的霉菌种类大约包括20个属，如曲霉属(Aspergillussp.)、灰霉菌属(Botrytissp.)、
17、镰孢菌属(Fusariumsp.)、炭疽菌属(Colletotrichumsp.)、核盘菌属(Scletoriumsp.)和玉圆斑菌属(Cochliobolussp.)等。目前，黑曲霉、根霉和盾壳霉作为产果胶酶的菌株已经商品化。国内外对霉菌发酵产果胶酶的研究主要集中在曲霉属中，而曲霉属中研究最多的是黑曲霉。其原因是，果胶酶被广泛应用于食品工业中，如用于果汁、果酒及中药营养液的深加工等，使得产品质量和外观得以改善，而生产食品酶制剂的菌株必须是安全菌株。黑曲霉分泌的胞外酶系较全，不仅可以产生大量果胶酶，而且黑曲霉属于安全菌株。另外，黑曲霉产生的果胶酶最适pH值一般在酸性范围内，这也是其被应用于食品
18、工业行业中的原因之一研究进展果胶酶微生物来源蛋白酶制剂常按最适微生物来源蛋白酶制剂常按最适pHpH分类分类 碱性：pH10以上（2709枯草菌蛋白酶）酸性：pH2-3以下 黑曲霉 中性：多蛋白酶分类：蛋白酶分类：内肽酶 （蛋白酶）外肽酶 羧肽酶、氨肽酶蛋白酶按活性中心可分为丝氨酸蛋白酶、天门冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶；按最适pH值来分又分酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶葡萄糖 丙酮酸 CO2和H2O蛋白、核酸降解自己了解（教材或生物化学）生物大分子微生物小分子代谢的中间体丙酮酸 葡萄糖葡萄糖 酵解途径酵解途径 丙酮酸丙酮酸 糖异生途径糖异生途径 乳酸、氨基酸、甘油乳酸、氨基酸、
19、甘油 糖原糖原 肝糖原分解肝糖原分解 糖原合成糖原合成 核糖核糖 +NADPH+H+磷酸戊糖途径磷酸戊糖途径 淀粉淀粉纤维素纤维素消化与吸收消化与吸收 丙酮酸位于无氧分解和有氧分解的交界点上，是糖代谢中具有关键作用的中间产物 从丙酮酸可直接生成丙氨酸，因为它可以与氨基转移反应相结合，故在氮代谢方面也起着重要的作用和CoA反应能形成乙酰CoA，与脂肪酸的代谢也有重要的关系 因此，丙酮酸在三大营养物质的代谢联系中起着重要的枢纽作用 丙酮酸合成路线主要有酒石酸与焦硫酸钾合成法、乳酸乙酯空气氧化法、羟基丙酮法、葡萄糖发酵法等 丙酮酸是一种用途非常广泛的有机酸，在化工、制药和日用化学品等工业及科学研究中
20、有着广泛的用途 从代谢的角度看丙酮酸需要掌握的知识发酵发酵(fermentation),呼吸作用呼吸作用,氧化磷酸氧化磷酸化化,底物水平磷酸化底物水平磷酸化,新陈代谢新陈代谢,同型乳酸发同型乳酸发酵酵,异型乳酸发酵异型乳酸发酵,双歧杆菌发酵双歧杆菌发酵葡糖分解为丙酮酸的途径葡糖分解为丙酮酸的途径EMP途径特点、关键酶途径特点、关键酶HMP途径的重要意义、途径的重要意义、关键酶关键酶ED途径的特点、途径的特点、关键酶关键酶磷酸己糖酮解途径的特点、磷酸己糖酮解途径的特点、关键酶关键酶TCA循环的重要特点循环的重要特点单糖分解为丙酮酸的四（五）种途径单糖分解为丙酮酸的四（五）种途径分解葡萄糖生成丙酮
21、酸的过程 糖酵解在胞浆中进行葡糖糖需磷酸活化1分子葡萄糖经酵解可净生成2分子ATP是细胞摄入体内的葡萄糖最初经历的酶促分解过程，也是葡萄糖分解代谢所经历的共同途径是机体在缺氧情况下迅速获得能量的主要途径，也是成熟红细胞获得能量的唯一途径糖酵解是肿瘤细胞能量代谢的主要方式 关于关于糖酵解的认识糖酵解的认识EMP途径途径绝大多数微生物均存在,连接TCA、HMP、ED等途径的桥梁,提供ATP和NAD(P)H HMP戊糖代谢，提供NADPH 和碳骨架ED 不依赖上面两途径单独纯在，补偿途径PK and HK 某些细菌中（一）一）EMP途径途径葡萄糖的葡萄糖的 酵解作用酵解作用(又称：Embden-Me
22、yerhof-Parnas途径，简称：EMP途径途径)活化活化移位移位 氧化氧化磷酸化磷酸化葡萄糖激活的方式己糖异构酶磷酸果糖激酶果糖二磷酸醛缩酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶磷酸甘油酸激酶甘油酸变位酶烯醇酶丙酮酸激酶EMPEMP途径特点：途径特点：葡萄糖分子经转化成葡萄糖分子经转化成1 1，6 6二磷二磷酸果糖后，在醛缩酶的催化下，裂酸果糖后，在醛缩酶的催化下，裂解成两个三碳化合物分子，即磷酸解成两个三碳化合物分子，即磷酸二羟丙酮和二羟丙酮和3-3-磷酸甘油醛。磷酸甘油醛。3-3-磷酸甘油醛被进一步氧化生成磷酸甘油醛被进一步氧化生成2 2分子丙酮酸，分子丙酮酸，1 1分子葡萄糖可降解成分子葡萄糖可降
23、解成2 2分子分子3-3-磷酸甘油醛，并消耗磷酸甘油醛，并消耗2 2分子分子ATPATP。2 2分子分子3-3-磷酸甘油醛被氧化生成磷酸甘油醛被氧化生成2 2分子丙酮酸，分子丙酮酸，2 2分子分子NADH2NADH2和和4 4分子分子ATPATP。EMP途径关键步骤途径关键步骤1.葡萄糖磷酸化葡萄糖磷酸化1.6二磷酸果糖二磷酸果糖(耗能耗能)2.1.6二磷酸果糖二磷酸果糖2分子分子3-磷酸甘油醛磷酸甘油醛3.3-磷酸甘油醛磷酸甘油醛丙酮酸丙酮酸总反应式：总反应式：葡萄糖葡萄糖+2NAD+2Pi+2ADP 2丙酮酸丙酮酸+2NADH2+2ATP CoA 丙酮酸脱氢酶丙酮酸脱氢酶 乙酰乙酰CoA，
24、进入进入TCA葡萄糖激活的方式葡萄糖激活的方式好氧微生物：通过需要好氧微生物：通过需要Mg+和和ATP的己糖的己糖激酶激酶厌氧微生物：通过磷酸烯醇式丙酮酸厌氧微生物：通过磷酸烯醇式丙酮酸-磷酸磷酸转移酶系统，在葡萄糖进入细胞时即完成转移酶系统，在葡萄糖进入细胞时即完成了磷酸化了磷酸化磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶EMP途径的途径的关键酶关键酶，需要需要ATP和和Mg+在活细胞内催化的反应是不可逆的反应在活细胞内催化的反应是不可逆的反应 耗能阶段耗能阶段C6 2C3 产能阶段产能阶段 4 4 ATP 2ATP2C3 2 丙酮酸丙酮酸 2NADH2C C6 6H H1212O O6 6+2NAD+2NA
25、D+2ADP+2Pi 2CH+2ADP+2Pi 2CH3 3COCOOH+2NADHCOCOOH+2NADH2 2+2H+2H+2ATP+2H+2ATP+2H2 2O O EMP途径的总反应途径的总反应（二）（二）HMP途径途径(戊糖磷酸途径戊糖磷酸途径)（Hexose Monophophate Pathway）HMPHMP途径：途径：葡萄糖经转化成葡萄糖经转化成6-6-磷酸葡萄糖酸磷酸葡萄糖酸后，在后，在6-6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的磷酸葡萄糖酸脱氢酶的催化下，裂解成催化下，裂解成5-5-磷酸戊糖和磷酸戊糖和COCO2 2。磷酸戊糖进一步代谢有两种结局，磷酸戊糖进一步代谢有两种结局，磷酸戊糖经
26、转酮磷酸戊糖经转酮转醛酶系催转醛酶系催化，又生成磷酸己糖和磷酸丙糖化，又生成磷酸己糖和磷酸丙糖（3-3-磷酸甘油醛），磷酸丙糖借磷酸甘油醛），磷酸丙糖借EMPEMP途径的一些酶，进一步转化为途径的一些酶，进一步转化为丙酮酸。丙酮酸。称为称为不完全不完全HMPHMP途径途径。由六个葡萄糖分子参加反应，由六个葡萄糖分子参加反应，经一系列反应，最后回收五个葡经一系列反应，最后回收五个葡萄糖分子，消耗了萄糖分子，消耗了1 1分子葡萄糖分子葡萄糖（彻底氧化成（彻底氧化成COCO2 2 和水），称完和水），称完全全HMPHMP途径途径。HMP途径降解葡萄糖的三个阶段途径降解葡萄糖的三个阶段HMP是一条葡萄
27、糖不经是一条葡萄糖不经EMP途径和途径和TCA循环循环途径而得到彻底氧化，并能产生大量途径而得到彻底氧化，并能产生大量NADPH+H+形式的还原力和多种中间代谢产物形式的还原力和多种中间代谢产物的代谢途径的代谢途径1.葡萄糖经过几步氧化反应产生核酮糖葡萄糖经过几步氧化反应产生核酮糖-5-磷磷酸和酸和CO22.核酮糖核酮糖-5-磷酸发生同分异构化或表异构化磷酸发生同分异构化或表异构化而分别产生核糖而分别产生核糖-5-磷酸和木酮糖磷酸和木酮糖-5-磷酸磷酸3.上述各种戊糖磷酸在无氧参与的情况下发生上述各种戊糖磷酸在无氧参与的情况下发生碳架重排，产生己糖磷酸和丙糖磷酸碳架重排，产生己糖磷酸和丙糖磷酸
28、HMP途径关键步骤：途径关键步骤：1.葡萄糖葡萄糖6-磷酸葡萄糖酸磷酸葡萄糖酸2.6-磷酸葡萄糖酸磷酸葡萄糖酸5-磷酸核酮糖磷酸核酮糖 5-磷酸木酮糖磷酸木酮糖 5-磷酸核糖磷酸核糖参与核酸生成参与核酸生成3.5-磷酸核酮糖磷酸核酮糖6-磷酸果糖磷酸果糖+3-磷酸甘油醛磷酸甘油醛(进入进入EMP6 葡萄糖葡萄糖-6-磷酸磷酸+12NADP+6H2O 5 葡萄糖葡萄糖-6-磷酸磷酸+12NADPH+12H+12CO2+PiHMP途径的总反应途径的总反应HMP途径的重要意义途径的重要意义1.1.为核苷酸和核酸的生物合成提供戊糖为核苷酸和核酸的生物合成提供戊糖-磷酸。磷酸。2.2.产产生生大大量量N
29、ADPH2NADPH2，一一方方面面为为脂脂肪肪酸酸、固固醇醇等等物物质质的的合合成成提提供还原力，另方面可通过呼吸链产生大量的能量。供还原力，另方面可通过呼吸链产生大量的能量。3.3.与与EMPEMP途途径径在在果果糖糖-1-1，6-6-二二磷磷酸酸和和甘甘油油醛醛-3-3-磷磷酸酸处处连连接接，可以调剂戊糖供需关系。可以调剂戊糖供需关系。4.4.途途径径中中的的赤赤藓藓糖糖、景景天天庚庚酮酮糖糖等等可可用用于于芳芳香香族族氨氨基基酸酸合合成成、碱基合成、及多糖合成。碱基合成、及多糖合成。5.5.途途径径中中存存在在3737碳碳的的糖糖，使使具具有有该该途途径径微微生生物物的的所所能能利利用
30、用利利用的碳源谱更为更为广泛。用的碳源谱更为更为广泛。6.6.通通过过该该途途径径可可产产生生许许多多种种重重要要的的发发酵酵产产物物。如如核核苷苷酸酸、若若干氨基酸、辅酶和乳酸（异型乳酸发酵）等。干氨基酸、辅酶和乳酸（异型乳酸发酵）等。7.7.HMPHMP途途径径在在总总的的能能量量代代谢谢中中占占一一定定比比例例，且且与与细细胞胞代代谢谢活活动动对其中间产物的需要量相关。对其中间产物的需要量相关。又称又称2-酮酮-3-脱氧脱氧-6-磷酸葡糖酸（磷酸葡糖酸（KDPG）裂解途径。裂解途径。1952年在年在Pseudomonas saccharophila中发现，后来中发现，后来证明存在于多种细
31、菌中证明存在于多种细菌中（革兰氏阴性菌中分布较广）（革兰氏阴性菌中分布较广）。ED途径可不依赖于途径可不依赖于EMP和和HMP途径而单独存在，途径而单独存在，是少数缺乏完整是少数缺乏完整EMP途径的微生物的一种替代途途径的微生物的一种替代途径，未发现存在于其它生物中。径，未发现存在于其它生物中。（三）（三）ED途径途径ED途径途径 ATP ADP NADP+NADPH2葡萄糖葡萄糖 6-磷酸磷酸-葡萄糖葡萄糖 6-磷酸磷酸-葡萄葡萄酸酸 激酶激酶 （与（与EMP途径连接）途径连接）氧化酶氧化酶 (与与HMP途径连接途径连接)EMP途径途径 3-磷酸磷酸-甘油醛甘油醛 脱水酶脱水酶 2-酮酮-3
32、-脱氧脱氧-6-磷酸磷酸-葡萄糖葡萄糖酸酸 EMP途径途径 丙酮酸丙酮酸 醛缩酶醛缩酶 有氧时与有氧时与TCA环连接环连接 无氧时进行细菌发酵无氧时进行细菌发酵 ED途径途径ED途径ED途径的特点途径的特点葡萄糖经转化为葡萄糖经转化为2-2-酮酮-3-3-脱氧脱氧-6-6-磷酸葡萄糖酸后，磷酸葡萄糖酸后，经脱氧酮糖酸醛缩酶催化，裂解成丙酮酸和经脱氧酮糖酸醛缩酶催化，裂解成丙酮酸和3-3-磷酸磷酸甘油醛，甘油醛，3-3-磷酸甘油醛再经磷酸甘油醛再经EMP途径途径转化成为丙酮转化成为丙酮酸。结果是酸。结果是1 1分子葡萄糖产生分子葡萄糖产生2 2分子丙酮酸，分子丙酮酸，1 1分子分子ATPATP。
33、ED途径的特征反应是途径的特征反应是关键中间代谢物关键中间代谢物2-酮酮-3-脱氧脱氧-6-磷酸葡萄糖酸（磷酸葡萄糖酸（KDPG）裂解为丙酮酸和裂解为丙酮酸和3-磷酸甘油磷酸甘油醛。醛。ED途径的特征酶是途径的特征酶是KDPG醛缩酶醛缩酶.反应步骤简单，产能效率低反应步骤简单，产能效率低.此途径此途径可与可与EMP途径、途径、HMP途径和途径和TCA循环相连循环相连接，可互相协调以满足微生物对能量、还原力和不接，可互相协调以满足微生物对能量、还原力和不同中间代谢物的需要同中间代谢物的需要。好氧时与好氧时与TCA循环相连，厌循环相连，厌氧时进行乙醇发酵氧时进行乙醇发酵.ED途径的总反应途径的总反
34、应 ATP C6H12O6 ADP KDPGATP 2ATP NADH2 NADPH2 2丙酮酸丙酮酸 6ATP 2乙醇乙醇 (有氧时经过呼吸链有氧时经过呼吸链)（无氧时进行细菌乙醇发酵）（无氧时进行细菌乙醇发酵）ED途径的总反应途径的总反应关键反应：关键反应：2-酮酮-3-脱氧脱氧-6-磷酸葡萄糖酸的裂解磷酸葡萄糖酸的裂解催化的酶：催化的酶：6-磷酸脱水酶，磷酸脱水酶，KDPG醛缩酶醛缩酶相关的发酵生产：细菌酒精发酵相关的发酵生产：细菌酒精发酵优点：代谢速率高，产物转化率高，菌体生成优点：代谢速率高，产物转化率高，菌体生成少，代谢副产物少，发酵温度较高，不必定期少，代谢副产物少，发酵温度较高
35、，不必定期供氧。供氧。缺点：缺点：pH5，较易染菌；细菌对乙醇耐受力低较易染菌；细菌对乙醇耐受力低ATP有氧时经呼吸链6ATP无氧时进行发酵2乙醇2ATPNADH+H+NADPH+H+2丙酮酸ATPC6H12O6KDPGED途径的总反应（续）途径的总反应（续）由表可见，在微生物细胞中，有的同时存在多条途径来降解葡萄糖，有的只有一种。在某一具体条件下，拥有多条途径的某种微生物究竟经何种途径代谢，对发酵产物影响很大。（四）磷酸酮解途径（四）磷酸酮解途径存在于某些细菌如明串珠菌属和乳杆菌属中的一存在于某些细菌如明串珠菌属和乳杆菌属中的一些细菌中。些细菌中。进行磷酸酮解途径的微生物缺少醛缩酶，所以它进
36、行磷酸酮解途径的微生物缺少醛缩酶，所以它不能够将磷酸己糖裂解为不能够将磷酸己糖裂解为2个三碳糖。个三碳糖。磷酸酮解酶途径有两种：磷酸酮解酶途径有两种：磷酸戊糖酮解途径（磷酸戊糖酮解途径（PK）途径途径 磷酸己糖酮解途径（磷酸己糖酮解途径（HK）途径途径 葡萄糖葡萄糖 6-P-葡萄糖葡萄糖6-P-葡萄糖酸葡萄糖酸 5-P-核酮糖核酮糖 5-P-木酮糖木酮糖3-P-甘油醛甘油醛 丙酮酸丙酮酸乙酰磷酸乙酰磷酸乙酰乙酰CoA 乙醛乙醛ATPADPNAD+NADH+H+CO2乳酸乙醇异构化作用NAD+NADH+H+磷酸戊糖酮解酶CoAPi2ADP+Pi2ATP-2H-2H-2HNAD+NADH+H+磷酸
37、戊糖酮解途径磷酸戊糖酮解途径磷酸戊糖酮解途径的特点磷酸戊糖酮解途径的特点:分解分解1分子葡萄糖只产生分子葡萄糖只产生1分子分子ATP，相当于相当于EMP途径的一半途径的一半;几乎产生等量的乳酸、乙醇和几乎产生等量的乳酸、乙醇和CO2磷酸己糖解酮途径磷酸己糖解酮途径 2葡萄糖葡萄糖 2葡萄糖葡萄糖-6-磷酸磷酸6-磷酸果糖磷酸果糖 6-磷酸磷酸-果糖果糖4-磷酸磷酸-赤藓糖赤藓糖 乙酰磷酸乙酰磷酸2木酮糖木酮糖-5-磷酸磷酸2甘油醛甘油醛-3-磷酸磷酸 2乙酰磷酸乙酰磷酸2乳酸乳酸2乙酸乙酸乙酸磷酸己糖解酮酶磷酸己糖解酮酶磷酸己糖解酮酶戊磷酸己糖解酮酶戊逆逆HMP途径途径同同EMP乙酸激酶乙酸激
38、酶磷酸己糖酮解途径的特点：磷酸己糖酮解途径的特点：有两个磷酸酮解酶参加反应；有两个磷酸酮解酶参加反应；在没有氧化作用和脱氢作用的参与下，在没有氧化作用和脱氢作用的参与下，2分子葡萄糖分分子葡萄糖分解为解为3分子乙酸和分子乙酸和2分子分子3-磷酸磷酸-甘油醛，甘油醛，3-磷酸磷酸-甘油醛在甘油醛在脱氢酶的参与下转变为乳酸；乙酰磷酸生成乙酸的反应则脱氢酶的参与下转变为乳酸；乙酰磷酸生成乙酸的反应则与与ADP生成生成ATP的反应相偶联；的反应相偶联；每分子葡萄糖产生每分子葡萄糖产生2.5分子的分子的ATP；许多微生物（如双歧杆菌）的异型乳酸发酵即采取此方许多微生物（如双歧杆菌）的异型乳酸发酵即采取此
39、方式。式。研究问题：代谢流分析 MetabolicfluxanalysisisananalysistechniquesimilartoFluxBalanceAnalysisusedtodeterminetherateatwhichametaboliteisproducedduringabioprocess.Metabolicfluxanalysis(MFA)iswidelyusedtoquantifymetabolicpathwayactivity 代谢物流分析是代谢工程的重要分析技术，通过计算各种途径的活性，尤其与代谢物的生产研究有关途径的定量，使尽可能多的碳从基质流向代谢产物。酵母型酒精发
40、酵同型乳酸发酵丙酸发酵混合酸发酵2,3丁二醇发酵丁酸发酵丙酮酸的发酵产物丙酮酸的发酵产物 微生物能在不同条件下对不同物质或基本相微生物能在不同条件下对不同物质或基本相同的物质进行不同的发酵，不同微生物对不同的物质进行不同的发酵，不同微生物对不同物质发酵可以得到不同的产物；不同微生同物质发酵可以得到不同的产物；不同微生物对同一物质进行发酵，或同一微生物在不物对同一物质进行发酵，或同一微生物在不同条件下进行发酵都可以得到不同的产物，同条件下进行发酵都可以得到不同的产物，所有这些都取决于微生物自身的代谢特点和所有这些都取决于微生物自身的代谢特点和发酵条件。发酵条件。（一）乙醇发酵（一）乙醇发酵 细菌
41、的乙醇发酵细菌的乙醇发酵 菌种：运动发酵单胞菌等菌种：运动发酵单胞菌等 途径：途径：EDED 酵母菌（在酵母菌（在pH3.5-4.5pH3.5-4.5时）的乙醇发酵时）的乙醇发酵 脱氢酶 脱羧酶 丙酮酸丙酮酸 乙醛乙醛 乙醇乙醇 通过通过EMPEMP途径产生乙醇，总反应式为：途径产生乙醇，总反应式为：C C6 6H H1212O O6 6+2ADP+2Pi 2C+2ADP+2Pi 2C2 2H H5 5OH+2COOH+2CO2 2+2ATP+2ATP C6H12O62CH3COCOOH 2CH3CHO 2CH3CH2OHNADNADH2-2CO2EMP2ATP乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶酵母菌的乙醇
42、发酵：酵母菌的乙醇发酵：概念概念菌种菌种途径途径特点特点发生条件发生条件该乙醇发酵过程只在该乙醇发酵过程只在pH3.54.5以及厌氧的条件下发生，以及厌氧的条件下发生，又又称第一型发酵称第一型发酵。通过通过EMPEMP途径产生乙醇，总反应式为：途径产生乙醇，总反应式为：C C6 6H H1212O O6 6+2ADP+2Pi 2C+2ADP+2Pi 2C2 2H H5 5OH+2COOH+2CO2 2+2ATP+2ATP 当发酵液处在碱性条件（当发酵液处在碱性条件（PH7.6PH7.6）下，酵母下，酵母的乙醇发酵会改为的乙醇发酵会改为第三型发酵第三型发酵（甘油发酵）。（甘油发酵）。原因：该条件
43、下产生的乙醛不能作为正常原因：该条件下产生的乙醛不能作为正常受氢体，结果受氢体，结果2 2分子乙醛间发生歧化反应，生分子乙醛间发生歧化反应，生成成1 1分子乙醇和分子乙醇和1 1分子乙酸；分子乙酸；CHCH3 3CHO+HCHO+H2 2O+NADO+NAD+CH CH3 3COOH+NADH+HCOOH+NADH+H+CH CH3 3CHO+NADH+HCHO+NADH+H+CH CH3 3CHCH2 2OH+NADOH+NAD+在适量的亚硫酸盐（在适量的亚硫酸盐（3%3%）可进行）可进行第二型发第二型发酵生成甘油，亚硫酸氢钠和乙醛反应，生成难酵生成甘油，亚硫酸氢钠和乙醛反应，生成难溶的磺化
44、羟基乙醛。溶的磺化羟基乙醛。迫使迫使磷酸二羟丙酮担任受氢体接受磷酸二羟丙酮担任受氢体接受3-磷酸甘油醛脱下的磷酸甘油醛脱下的氢而生成氢而生成 -磷酸甘油，后者经磷酸甘油，后者经-磷酸甘油酯酶催化，磷酸甘油酯酶催化，生成甘油。生成甘油。2葡萄糖葡萄糖 2甘油甘油+乙醇乙醇+乙酸乙酸+2CO2细菌的乙醇发酵细菌的乙醇发酵葡萄糖葡萄糖2-酮酮-3-脱氧脱氧-6-磷酸磷酸-葡萄糖酸葡萄糖酸3-磷酸甘油醛磷酸甘油醛 丙酮酸丙酮酸丙酮酸丙酮酸乙醛乙醛 乙醛乙醛2乙醇乙醇2CO22H2H+ATP2ATP菌种：运动发酵单胞菌等途径：EDv酵母菌（在酵母菌（在pH3.5-4.5时）的乙醇发酵时）的乙醇发酵 脱羧
45、酶脱羧酶 脱氢酶脱氢酶 丙酮酸丙酮酸 乙醛乙醛 乙醇乙醇 通过通过EMPEMP途径产生乙醇，总反应式为：途径产生乙醇，总反应式为：C C6 6H H1212O O6 6+2ADP+2Pi 2C+2ADP+2Pi 2C2 2H H5 5OH+2COOH+2CO2 2+2ATP+2ATP v细菌细菌(Zymomonas mobilis)的乙醇发酵的乙醇发酵 通过通过ED途径产生乙醇，总反应如下：途径产生乙醇，总反应如下：葡萄糖葡萄糖+ADP+Pi 2乙醇乙醇+2CO2+ATP细菌细菌(Leuconostoc mesenteroides)的乙醇发酵的乙醇发酵 通过通过HMP途径产生乙醇、乳酸等，总反
46、应如下：途径产生乙醇、乳酸等，总反应如下：葡萄糖葡萄糖+ADP+Pi 乳酸乳酸+乙醇乙醇+CO2+ATP同型乙醇发酵：产物中仅有乙醇一种有机物分子的酒精同型乙醇发酵：产物中仅有乙醇一种有机物分子的酒精发酵发酵异型乙醇发酵：除主产物乙醇外，还存在有其它有机物异型乙醇发酵：除主产物乙醇外，还存在有其它有机物分子的发酵分子的发酵利用Z.mobilis等细菌生产酒精优点：代谢速率高；产物转化率高；菌体生成少代谢副产物少；发酵温度高；缺点：pH5较易染菌；耐乙醇力较酵母低（二）乳酸发酵（二）乳酸发酵乳酸细菌能利用葡萄糖及其他相应的可发酵的糖产生乳酸细菌能利用葡萄糖及其他相应的可发酵的糖产生乳酸，称为乳酸
47、发酵。乳酸，称为乳酸发酵。由于菌种不同，代谢途径不同，生成的产物有所不同，由于菌种不同，代谢途径不同，生成的产物有所不同，将乳酸发酵又分为同型乳酸发酵、异型乳酸发酵和双将乳酸发酵又分为同型乳酸发酵、异型乳酸发酵和双歧杆菌发酵。歧杆菌发酵。同型乳酸发酵：（经同型乳酸发酵：（经EMPEMP途径）途径）异型乳酸发酵异型乳酸发酵：（经（经HMPHMP途径）途径）双歧杆菌发酵双歧杆菌发酵:（经（经HKHK途径途径磷酸己糖解酮酶途径磷酸己糖解酮酶途径）葡萄糖葡萄糖3-磷酸磷酸甘油醛甘油醛磷酸二羟丙酮磷酸二羟丙酮2(1,3-二二-磷酸甘油酸）磷酸甘油酸）2乳酸乳酸 2丙酮酸丙酮酸同型乳酸发酵同型乳酸发酵2N
48、AD+2NADH4ATP4ADP2ATP 2ADPLactococcus lactisLactobacillus plantarum概念概念菌种菌种途径途径特点特点异型乳酸发酵：异型乳酸发酵：葡萄糖葡萄糖6-磷酸磷酸葡萄糖葡萄糖6-磷酸葡磷酸葡萄糖酸萄糖酸5-磷酸磷酸木酮糖木酮糖3-磷酸磷酸甘油醛甘油醛乳酸乳酸乙酰磷酸乙酰磷酸NAD+NADHNAD+NADHATP ADP乙醇乙醇 乙醛乙醛 乙酰乙酰CoA2ADP 2ATP-2H概念概念菌种菌种途径途径特点特点-CO2（三）混合酸发酵（三）混合酸发酵v概念概念：埃希埃希氏菌、沙门氏氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌菌、志贺氏菌属的一些菌通属的一些菌通过过
49、EMP途径将途径将葡萄糖转变成葡萄糖转变成琥珀酸、乳酸、琥珀酸、乳酸、甲酸、乙醇、甲酸、乙醇、乙酸、乙酸、H2和和CO2等多种代等多种代谢产物，由于谢产物，由于代谢产物中含代谢产物中含有多种有机酸，有多种有机酸，故将其称为混故将其称为混合酸发酵。合酸发酵。v发酵途径：发酵途径：葡萄糖葡萄糖琥泊酸琥泊酸 草酰乙酸草酰乙酸 磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸 乳酸乳酸 丙酮酸丙酮酸 乙醛乙醛 乙酰乙酰 CoA 甲酸甲酸 乙醇乙醇 乙酰磷酸乙酰磷酸 CO2 H2 乙酸乙酸丙酮酸甲酸裂解酶乳酸脱氢酶甲酸-氢裂解酶磷酸转乙酰酶乙酸激酶PEP羧化酶乙醛脱氢酶+2HpH6.2（四）（四）2,3-丁二醇发酵丁二
50、醇发酵 葡萄糖葡萄糖 乳酸乳酸 丙酮酸丙酮酸乙醛乙醛 乙酰乙酰CoA 甲酸甲酸乙醇乙醇 乙酰乳酸乙酰乳酸 二乙酰二乙酰 3-羟基丁酮羟基丁酮 2,3-丁二醇丁二醇CO2 H2-乙酰乳酸合成酶-乙酰乳酸脱羧酶2,3-丁二醇脱氢酶概念：概念：肠杆菌、肠杆菌、沙雷氏菌、和沙雷氏菌、和欧文氏菌属中欧文氏菌属中的一些细菌具的一些细菌具有有-乙酰乳酸乙酰乳酸合成酶合成酶系而进系而进行丁二醇发酵。行丁二醇发酵。发酵途径：发酵途径：EMPTCA（五）（五）TCA循环循环三羧酸循环丙酮酸在进入三羧酸循环之先要脱羧生成乙酰CoA，乙酰CoA和草酰乙酸缩合成柠檬酸再进入三羧酸循环。循环的结果是乙酰CoA被彻底氧化成