北肿发补方案最终版51139.pdf

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1、 北肿发补方案最终版(总 12页)本页仅作为文档封面，使用时可以删除 This document is for reference only-rar21year.March 方案编号：NHCIP001-3 发补临床试验方案 产品名称：人 EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ALK、ROS1 基因突变检测试剂盒（半导体测序法）包装规格：48 测试/盒 临床试验类型：发补临床试验 方案版本号和日期：承担临床试验的医疗机构（签章）：北京肿瘤医院 主要研究者姓名（签字）：联系电话：统计学负责人（签名）：统计学负责单位（盖章）：北京大学第一医院医学统计室 注册申请人（盖章）：天津诺禾致源生物信息

2、科技有限公司 注册申请人联系人：张双华 联系电话：/0 一、实验目的 根据人 EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ALK、ROS1 基因突变检测试剂盒（半导体测序法）注册审评的发补要求：1）补充待考核试剂盒与已上市荧光 PCR 试剂盒在检验临床样本时的一致性研究，检验基因包括 EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ALK、ROS1。2）补充待考核试剂盒与已经充分联合药物临床评价的伴随诊断试剂作为对比试剂的比对研究临床试验，检验基因（突变）包括 EGFR（19del、L858R）、ALK、ROS1。二、待考核试剂盒和对比试剂盒的检测原理、方法：待考核试剂盒基于半导体测序法，针对与非

3、小细胞肺癌靶向治疗密切相关的基因（包括 EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ALK 和 ROS1）的多个位点的特异靶序列进行多重PCR 扩增，构建文库，混样后进行半导体测序。待考核试剂盒基于半导体测序法，在半导体芯片的微孔中固定 DNA 链，测序时依次加入 A/C/G/T 碱基，DNA 聚合酶以固定的单链DNA 为模板，按碱基互补原理，合成互补的 DNA 链，并释放氢离子，所释放出的 H 离子在穿过孔底部时能被检测到，然后通过对所释放H 离子的检测，实时判读碱基。如果DNA 链含有连续碱基，则记录的电压信号加倍。如果碱基不匹配，则无氢离子释放，也就没有电压信号的变化。这种方法属于直接检

4、测 DNA 的合成，因少了 CCD 扫描，荧光激发等环节，几秒钟就可检测合成插入的碱基，大大缩短了运行时间。运行结束后，利用生物信息学方法将测得序列与参考序列比对，通过数据分析判断靶序列是否发生突变或融合。比对试剂中荧光 PCR 法试剂盒都采用 Taqman 荧光 PCR，即在扩增时，加入引物的同时加入特异性的荧光探针，该探针为寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。但由于 taq 酶的5端-3端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分

5、子形成，实现了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全同步。利用 PCR 引物的 3端末位碱基必须与其模板 DNA 互补才能有效扩增的原理，在设计探针时，附加错配突变设计在 3端引物序列中，若出现错配则不会出现扩增，如此引物仅仅识别突变序列，而不识别正常序列。仪器通过检测反应孔中的荧光信号，而达到检测相关已知突变基因型的目的。比对试剂中荧光原位杂交法（FISH 法）试剂盒设计了两种探针分别标记 ALK 基因的两端，300 kb 的 3端和 442 kb 的 5端分别标记为橘红色和绿色。在无 ALK 融合基因表达的肿瘤细胞中，橘红色和绿色重叠为黄色或者相互粘合（两个信号之间的间隔小于两个信号的直径）

6、；而在存在 ALK 融合基因表达的肿瘤细胞中，橘红色和绿色信号相互分离（间隔2 个信号直径）。根据荧光信号差异从而判断检测样本中是否存在 ALK 融合。三、试验设计 1、试验机构的选择 该验证试验计划在北京肿瘤医院进行。2、参与人员及其职责 试验人员 职务/职称 所在单位科室 在试验研究中的职责 林冬梅 主任医师 北京大学肿瘤医院病理科 主要研究者，试验方案、报告审核，样本入组，试验指导 贾玲 技师 北京大学肿瘤医院病理科 样本准备，试验操作，记录表格填写 王萍 主管技师 北京大学肿瘤医院病理科 样本准备，试验操作，CRF 表填写 王跃 技师 北京大学肿瘤医院病理科 样本准备，试验操作，CRF

7、 表填写 3、试验样本（1）样本来源 根据注册审评发补要求，试验样本为人 EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ALK、ROS1基因突变检测试剂盒（半导体测序法）临床试验（方案编号：NHCIP001-1；方案版本号和日期：A/02，2016/7/2；临床试验备案号：津械临备）所入组的剩余核酸和新入组回顾性 FFPE 样本。（2）样本数量的要求 研究入组样本例数应符合每个基因阴、阳性都符合统计学的最小样本数的要求。按照阳性符合率和阴性符合率的样本量计算公式：22/2-1)1(Zeessn 2pp2/2-1)1(Zssn Z1-/2 表示标准正态分布 1-/2 的分位数，通常取=，此时 Z1

8、-/2=；表示精确度，可以根据 95%可信区间确定，通常不超过可信区间宽度的一半。根据上述计算方法，需入组样本总例数约为200 例。（3）剩余核酸入选/排除标准：入选标准：1）剩余核酸 DNA 含量约 400ng；RNA 总量约 600ng，2）患者就诊时确认为晚期或转移性非小细胞肺癌。排除标准：样本发生严重降解，核酸弥散条带的中值在300bp 以下。（4）新入组回顾性 FFPE 样本入选/排除标准：入选标准：1）患者就诊时确认为晚期或转移性非小细胞肺癌；2）临床剩余的石蜡包埋组织切片需大于 8 张，满足 3-5um 厚的要求；3）2 年以内的石蜡包埋组织切片样本；4）基本信息包括完整的临床确

9、诊资料、性别、年龄、采集日期等；5）HE 染色确认样本肿瘤细胞大于 30%。排除标准：1）FFPE 样本发生严重降解，核酸弥散条带的中值在 300bp 以下；2）样本提取后 DNA 含量低于 550ng；RNA 总量低于 1400ng。（5）剩余核酸、新入组回顾性 FFPE 样本剔除标准：1）试验分析发现的异常值；2）试验登记表信息记录不完整的样本；3）各机构主要研究者所认定的任何其他原因。4、验证试验用待考核试剂盒及对比试剂盒 待考核试剂盒 名称 厂商 规格 人 EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ALK、ROS1 基因突变检测试剂盒（半导体测序法）天津诺禾致源生物信息科技有限公司

10、48 测试/盒 对比试剂盒 名称 厂商 规格 注册号 试验目的 1 试验目的 2 1 人 KRAS 基因突变检测 试剂盒（荧光 PCR 法）北京雅康博生物科技有限公司 12 测试/盒 国食药监械（准）字 2013 第 3400175 号 2 人 BRAF 基因突变检测 试剂盒（荧光 PCR 法）北京雅康博生物科技有限公司 24 测试/盒 国食药监械（准）字 2014 第 3401045 号 3 人 PIK3CA 基因突变检测 试剂盒（荧光 PCR 法）北京雅康博生物科技有限公司 24 测试/盒 国食药监械（准）字 2014 第 3401044 号 4 人类 EML4-ALK 融合基因检测试剂盒

11、（荧光 PCR法）厦门艾德生物医药科技股份有限公司 12 测试/盒 国食药监械（准）字 2013 第 3400389 号 5 人类 EGFR 基因突变检测试剂盒（蝎形探针 ARMS荧光 PCR 法）QIAGEN Manchester Ltd 24 测试/盒 国食药监械（进）字 2014 第 3400761 号 6 人类 ROS1 基因融合检测 试剂盒（荧光 PCR 法）厦门艾德生物医药科技股份有限公司 12 测试/盒 国食药监械（准）字 2014 第 3401514 号 7 ALK 基因重组检测试剂盒（荧光原位杂交法）Abbott Molecular,Inc.20 检测/盒 国械注进 183

12、上述试剂盒中编号为 5、6、7 的试剂盒为已经充分联合药物进行临床评价的伴随诊断试剂盒，如下为此三种试剂盒的具体的对应治疗药物信息：名称 基因 位点 对应的 NSCLC 治疗药物 药物上市状态 人类 EGFR 基因突变检测试剂盒（蝎形探针 ARMS 荧光 PCR 法）EGFR 19del L858R 吉非替尼 阿法替尼 已在中国上市 人类 ROS1 基因融合检测试剂盒（荧光 PCR 法）ROS1 融合 克唑替尼 已在中国上市 ALK 基因重组检测试剂盒（荧光原位杂交法）ALK 融合 克唑替尼 已在中国上市 5、试验方案 根据人 EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ALK、ROS1 基因

13、突变检测试剂盒（半导体测序法）注册审评的发补要求，补充待考核试剂盒在临床样本检测中与已上市荧光 PCR检测的一致性评价，以及与已经充分联合药物临床评价的伴随诊断试剂作为对比试剂的比对研究临床试验。本临床试验样本来自北京肿瘤医院注册临床试验时的剩余样本核酸，和新入组的回顾性 FFPE 样本。按食药监局发布通知要求，所有样本患者来源符合相关药物上市说明书要求。对于剩余核酸，由于待考核试剂盒检测结果已在注册临床试验报告中体现，因此在本次研究中仅需完成对比试剂盒检测。对于新入组的 FFPE 样本，则需完成待考核试剂盒的检测与对比试剂盒的检测。待考核试剂盒的检测结果将与对比试剂盒检测结果进行对比与统计分

14、析，对不一致样本用对比试剂盒复测三次进行不一致分析。对比试剂盒的流程及结果判读严格按照对比试剂盒说明书；待考核试剂盒的流程严格按照待考核试剂盒的说明书操作，结果判读依据癌症基因数据处理软件完成。四、试验结果评价指标 采用待考核试剂盒检测的结果与对比试剂盒检测结果进行一致性对比，预计待考核试剂盒的阳性符合率大于 95%，阴性符合率大于 95%，即证明待考核试剂盒与荧光 PCR试剂盒性能一致；证明待考核试剂盒与已经充分联合药物临床评价的伴随诊断试剂盒临床评价具有一致性。五、统计处理方法 1.研究设计 本临床试验采用考核试剂检测结果与对比试剂盒检测结果进行同步盲法比较的试验设计类型。2.临床评价指标

15、 阳性符合率，及 95%置信区间；阴性符合率，及 95%置信区间；总体符合率，及 95%置信区间；Kappa 值；3.统计分析方法（1）一般原则 所有的统计检验均采用双侧检验。定量指标的描述将计算均值、标准差、中位数、最小值、最大值，下四分位数（Q1），上四分位数（Q3），分类指标描述各类的例数及百分数。（2）分析指标 人口学特征及基本描述 对纳入受试者的人口学信息（性别、年龄、病史等）进行描述。定量指标的描述将计算均值、标准差、中位数、最小值、最大值，下四分位数（Q1），上四分位数（Q3），分类指标描述各类的例数及百分数。产品与对比试剂盒检测结果的一致性分析 根据试验试剂盒和对比试剂盒检测方

16、法，对所有符合要求的试验数据采用 22 列联表整理，根据下表进行统计分析，并计算相应的评价质保、及总符合率：考核试剂 对照试剂 合计 阳性 阴性 阳性 a b a+b 阴性 c d c+d 合 计 a+c b+d N=a+b+c+d 灵敏度=a/(a+c)100%特异度=d/(b+d)100%总符合率=(a+d)/(a+b+c+d)100%95%置信区间的计算公式：p p(1-p)/n1/2（其中 p 为阳性符合率、阴性符合率、总符合率，n 为样本数量，若 p，则用 Wilson score method进行校正。）Kappa 值：根据配对资料四格表，应用 SAS 或以上版本统计软件计算 Ka

17、ppa 值。具体计算公式如下：1accPPKappaP，其中 Pa=adN，Pc=()()()()ab acbd cdNNN Kappa 值在 01 之间判断一致性才有意义。Kappa 值越大，表示一致性越好。对上述基数资料进行 Kappa 一致性分析，Kappa 系数，为高度一致，认为两系统等效；Kappa 系数认为一致，需进行阳性符合率和阴性符合率比较进行统计学分析；Kappa 系数则认为两系统不一致，两系统不等效。4.临床试验合格/不合格标准 采用 McNemar 2检验两者检测结果不一致的部分差别是否具有统计学意义(b+c40时，采用校正的 McNemar 2检验，b+c20 时，视情

18、况采用精确概率法)，同时采用 Kappa 检验检测两种方法的一致性。两种方法检验统计结果均应无统计学差异；阳性符合率应大于或等于 95%同时阴性符合率应大于或等于 95%以上，认为两者的一致性好。六、数据管理 申办方和研究者将保留有关这项研究的所有记录和文件，他们将可供适当的机构查阅。此外，研究者将保留原始文件，这些记录应被存放在一安全的存储设施中，由临床中心保留，未经申办方批注，研究者不应处理这些记录。七、对试验方案修订的规定 试验方案须在验证开始前与临床机构研究负责人进行讨论确认，并经伦理委员会通过后方可开展验证。在验证试验过程中，如需任何修改，试验机构应与天津诺禾致源生物信息科技有限公司

19、共同确认并论证后，再次提交伦理委员会评审，通过后方可执行，并对更改的时间、理由、更改过程等进行详细记录。八、伦理方面：1.资料保护和患者信息 患者的信息将被保护，只有主要研究者和资料管理员才可接触受试者临床登记资料，上述人员将对受试者信息进行保密；申办方和研究者对于研究结果的发表将不会泄露受试者的个人信息；除此之外，为确保本次研究符合相关法律法规要求，受试者样本的研究记录将有可能被食品药品管理监督局的代表和伦理审查委员会审阅。2.伦理问题说明 体外诊断试剂临床研究技术指导原则（国家食品药品监督管理总局2014 年第 16 号通告）二（一）1 条款要求规定：“临床试验必须符合赫尔辛基宣言的伦理学

20、准则，必须获得临床试验机构伦理委员会的同意。研究者应考虑临床试验用样本，如血液、羊水、胸水、腹水、组织液、胸积液、组织切片、骨髓等的获得或试验结果对受试者的风险性，应提交伦理委员会的审查意见及受试者的知情同意书。对于例外情况，如客观上不可能获得受试者的知情同意或该临床试验对受试者几乎没有风险，可经伦理委员会审查和批准后免于受试者的知情同意。”本次研究样本为临床试验机构针对待注册产品的临床试验之后的剩余样本以及日常检测过程中采集标本的剩余样本，并非为临床试验特意、专门提供，检测结果仅作为产品与已上市荧光 PCR 试剂盒检验符合率验证方案一致性的评估，不对病人发布，且不作为临床诊治依据，所有信息只

21、面向药监审评与考核部门。因此本次研究对受试者几乎没有风险性，可经伦理委员会审查和批准后免于受试者的知情同意。九、记录保存：研究者应保证将数据正确、完整、清晰、及时地导出打印备案，并进行临床统计分析。监查员须监查试验的进行是否遵循试验方案（如：检查有无不符合入选/排除标准的样本等），确认所有用于统计分析的数据正确完整，如有错误和遗漏，及时要求研究者改正。研究者需认真填写所有研究资料，试验结束后所有原始资料和相关资料信息由临床试验机构保留，其所有权属于天津诺禾致源生物信息科技有限公司。该项试验的结果将进行报告，并交给医疗器械审评中心用于该项目的发补资料，天津诺禾致源生物信息科技有限公司将保留在公认

22、的学术期刊公开发表项目总体结果的权利。其他用途需获得天津诺禾致源生物信息科技有限公司的许可。十、附件 附件一 医疗器械临床试验病例报告表10 附件二 人 KRAS 基因突变检测试剂盒（荧光 PCR 法）说明书 附件三 人 BRAF 基因突变检测试剂盒（荧光 PCR 法）说明书 附件四 人 PIK3CA 基因突变检测试剂盒（荧光 PCR 法）说明书 附件五 人类 EGFR 基因突变检测试剂盒（蝎形探针 ARMS 荧光 PCR 法)说明书 附件六 人类 EML4-ALK 融合基因检测试剂盒（荧光 PCR 法）说明书 附件七 人类 ROS1 基因融合检测试剂盒（荧光 PCR 法）说明书 附件八 ALK 基因重组检测试剂盒（荧光原位杂交法）说明书 伦理委员会意见：（盖章）年 月 日 临床试验管理部门意见 （盖章）年 月 日 统计学负责人意见 （盖章）年 月 日 注册申请人意见 （盖章）年 月 日