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1、体内药物分析体内药物分析 Biopharmaceutical AnalysisBiopharmaceutical Analysis体内药物分析方法及方法的设计与评价体内药物分析方法及方法的设计与评价生生物物样样本本经经预预处处理理后后，选选用用适适当当方方法法进进行行测测定定。可可供供生生物物体体液液中中药药物物及及其其代代谢谢物物含含量量测测定定的的分析方法很多，归纳起来主要有三类：分析方法很多，归纳起来主要有三类：（一）光谱分析法（一）光谱分析法（二）免疫分析法（二）免疫分析法（三）色谱分析法（三）色谱分析法除除以以上上三三类类主主要要方方法法外外，在在生生物物药药物物分分析析中中有有时时
2、还还使使用用同同位位素素标标记记药药物物，它它们们主主要要应应用用于于RIA、同同 位位 素素 逆逆 稀稀 释释 分分 析析，或或 作作 为为 GC-MS分分析析的的内内标标，以以及及在在药药物物分分离离中中作作示示踪踪应应用等。用等。此此外外，还还有有一一些些含含抗抗生生素素类类药药物物的的生生物物样样品品，它它们们可可用用微微生生物物方方法法测测定定，利利用用抗抗生生素素在在琼琼脂脂培培养养基基内内的的扩扩散散作作用用，比比较较样样品品与与药药物物标标准准品品两两者者对对接接种种的的试试验验菌菌产产生生的的抑抑菌菌圈圈的的大大小小，借借以测定样品内抗生素药物的浓度。以测定样品内抗生素药物的
3、浓度。（一）（一）光谱分析法光谱分析法光光谱谱分分析析法法包包括括比比色色测测定定、紫紫外外分分光光光光度度法法和和荧荧光光分分光光光光度度法法。光光谱谱法法在在体体内内药药物物分分析析中中是是应应用用较较早早的的方方法法之之一一，根根据据陆陆明明廉廉对对我我国国19751984年年间间血血药药浓浓度度测测定定方方法法的的统统计计，应应用用光光谱谱法法占占应应用用血血药药分分析析方方法法总总数数的的三三分分之之一一。虽虽然然近近十十多多年年来来色色谱谱法法的的飞飞速速发发展展，使使光光谱谱法法退退出出了了体体内内药药物物分分析析应应用用方方法法的的主主角角地地位位，但但因因其其操操作作简简便便
4、、快快速速，在在体体内内药药物物分分析析中中仍仍占占有有一定的地位。一定的地位。由由于于光光谱谱法法不不具具备备分分离离功功能能，选选择择性性较较差差，因因此此对对样样品品的的预预处处理理要要求求较较高高。选选用用专专属属的的方方法法或或试试剂剂与与之之反反应应，测测定定衍衍生生物物的的荧荧光光或或对对光光吸吸收强度，也可借助数学的方法消除干扰。收强度，也可借助数学的方法消除干扰。1、比色法、比色法比比色色法法灵灵敏敏度度不不高高，通通常常只只能能测测定定出出1ug/ml浓浓度度以以上上的的样样品品。但但该该法法具具有有快快速速，简简便便，对对仪仪器器要要求求不不高高等等特特点点。只只要要采采
5、用用具具有有选选择择性性的的显显色色剂剂和和反反应应条条件件，可可不不经经分分离离提提取取等等步步骤骤，直直接用于血药浓度监测。接用于血药浓度监测。2、紫外分光光度法、紫外分光光度法分分光光光光度度法法的的灵灵敏敏度度较较比比色色法法高高，适适用用于于测测定定具具有有紫紫外外吸吸收收的的药药物物，方方法法简简单单，仪仪器器要要求求也也不不高高。但但用用于于测测定定含含药药浓浓度度低低的的样样品品时时，也也受受到到一一定定的的限限制制。如如测测定定体体液液中中药药物物浓浓度度时时，亦亦可可能能受受体体液液中中内内源源性性杂杂质质的的干干扰扰和和影影响响。因因此此，本本法法在在体体内内药药物物分分
6、析析中中也也受受到到灵灵敏敏度度和和专专一一性性的的限限制制。但但采采用用一一些些光光谱谱分分析析技技术术，如如用用差差示示分分光光光光度度法法，导导数数分分光光光光度度法法，双双波波长长和和三三波波长长分分光光光光度度法法等等，可可适适当当提提高高方方法法的的灵灵敏敏度度和和选选择择性性，也也可可消消除除杂杂质质的的干干扰扰，因因此此，该该法法目前仍用于一些生物样品中的药物检测。目前仍用于一些生物样品中的药物检测。3、荧光分光光度法、荧光分光光度法荧荧 光光 分分 光光 光光 度度 法法 的的 灵灵 敏敏 度度 比比 紫紫 外外-可可见见分分光光光光度度法法的的灵灵敏敏度度高高，最最高高可可
7、达达到到10-12g/mL，虽虽然然有有荧荧光光的的物物质质数数量量不不多多，但但体体内内许许多多重重要要的的生生化化物物质质、药药物物及及其其代代谢谢物物或或致致癌癌物物都都有有荧荧光光现现象象。由由于于荧荧光光衍衍生生物物试试剂剂的的使使用用，进进一一步步扩扩大大了了荧荧光光分分光光光光度度法法的的应应用用，因因此此该该法法在在体体内内药药物物分分析析和和药药物物动动力力学学研研究究中中得得到到广泛的应用。广泛的应用。（二）免疫分析法（二）免疫分析法 免免疫疫分分析析主主要要指指放放射射免免疫疫、酶酶免免疫疫、荧荧光光免免疫疫分分 析析 等等。该该 法法 的的 原原 理理 是是 利利 用用
8、 抗抗 原原-抗抗体体特特异异反反应应来来测测定定体体内内药药物物的的含含量量。该该法法具具有有灵灵敏敏度度高高、专专一一性性强强、操操作作简简便便、快快速速等等优优点点，是是临临床床治治疗疗药药浓浓监监测测和和生生化化检检验验的的常常用用方方法，但需要一定的试剂盒和仪器。法，但需要一定的试剂盒和仪器。(三三)色谱分析法色谱分析法色色谱谱方方法法包包括括HPLC、GC和和TLC等等方方法法。色色谱谱法法在在我我国国体体内内药药物物分分析析中中的的应应用用始始于于20世世纪纪80年年代代，由由于于色色谱谱法法具具有有分分离离分分析析功功能能，具具有有高高的的专专属属性性和和灵灵敏敏度度，并并能能
9、同同时时分分离离分分析析结结构构相相似似的的药药物物和和代代谢谢物物等等优优点点，使使得得其其近近20年年来来发发展展迅迅速速，尤尤其其是是HPLC法法，己己在在体体内内药药物物分分析析领领域域中中确确立立了了主主导导地地位位，常常用用作作体体内内药药物物分分析析中中评评价价其其他他方方法法的的参参比比方方法法。近近年年手手性性色色谱谱技技术术、毛毛细细管管电电泳泳技技术术、色色谱谱与与光光谱谱联联用用技技术术、色色谱谱与与免免疫疫联联用用技技术术等等的的建建立立与与发发展展，更更为为色色谱谱技技术术在在体体内内药药物物分分析析中中的的应应用用增增添添了了无无量量的的前景。前景。1、HPLC法
10、法HPLC法法在在体体内内药药物物分分析析中中的的应应用用已已大大大大超超过过其其他他分分析析方方法法，成成为为体体内内药药物物分分析析中中应应用用最最广广泛泛的的技技术术之之一一。与与GC法法相相比比，它它具具有有以以下下优优点：点：(1)适适用用范范围围广广，可可在在室室温温下下进进行行检检测测。对对于于挥挥发发性性低低的的，热热稳稳定定性性差差的的，分分子子量量大大的的以以及及离子型化合物等均可测定。离子型化合物等均可测定。(2)样样品品预预处处理理简简单单，可可不不经经萃萃取取和和衍衍生生化化处处理理直直接接测测定定极极性性大大的的水水溶溶性性药药物物，特特别别适适合合生生物样品的测定
11、；物样品的测定；(3)分分离离效效率率高高，流流动动相相选选择择范范围围广广，仪仪器器自自动化程度高。动化程度高。(4)检检测测器器多多是是针针对对整整分分子子的的光光谱谱特特征征进进行行检检测测的的，专专一一性性较较高高。检检测测方方法法多多采采用用非非破破坏坏性性的。流出组分可回收，可用于样品的制备。的。流出组分可回收，可用于样品的制备。2、GC法法GC法法是是最最先先兴兴起起的的具具有有分分离离和和分分析析两两种种功功能能的的测测定定技技术术，在在药药物物分分析析和和体体内内药药物物分分析析中中曾曾得得到到较较广广泛泛的的应应用用。由由于于HPLC法法的的发发展展，尤尤其其是是RP-HP
12、LC(反反相相-高高效效液液相相色色谱谱法法）的的广广泛泛应应用用，使使GC法法的的应应用用相相对对减减少少。其其原原因因是是GC法法本本身身具具有有一一些些缺缺点点，应应用用时时常常受受被被测测组组分分的的挥挥发发性性和和热热稳稳定定性性等等方方面面的的限限制制。用用GC测测定定药药物物时时一一般般需需要要在在120以以上上柱柱温温条条件件下下进进行行，因因此此不不适适合合用用于于遇遇热热不不稳稳定定和和极极性性大大或或挥挥发发性性差差的的药药物物，不不适适合合用用于于生生物物样样品品的的测测定定。因因而而影影响响该该法法在在体体内内药药物物分分析析中中的的广广泛泛应用。应用。（四）毛细管电
13、泳法（四）毛细管电泳法毛毛细细管管电电泳泳法法(CE)，又又称称高高效效毛毛细细管管电电泳泳法法(HPCE)，是是20世世纪纪末末发发展展起起来来的的一一种种高高效效、快快速速的的分分析析技技术术。HPCE是是以以高高电电压压电电场场为为驱驱动动力力，以以毛毛细细管管为为分分离离通通道道，依依据据样样品品各各组组分分之之间间淌淌度度和和分分配配系系数数的的不不同同而而实实现现分分离离的的一一类类液相分离技术。液相分离技术。近近年年来来HPCE发发展展十十分分迅迅速速，已已在在化化学学、生生命命科学和药学等领域得到广泛的应用。科学和药学等领域得到广泛的应用。由由于于该该法法具具有有高高效效、快快
14、速速、灵灵敏敏、进进样样少少、信信息息量量大大、运运行行成成本本低低、易易于于自自动动化化等等优优点点。因因此此使使其其在在体体内内药药物物分分析析及及其其代代谢谢的的检检测测中中得得到到广泛的应用。广泛的应用。根根据据HPCE法法的的分分离离模模式式的的不不同同。HPCE又又分分为为：毛毛细细管管区区带带电电泳泳、胶胶束束电电动动毛毛细细管管色色谱谱、毛毛细细管管凝凝胶胶电电泳泳、毛毛细细管管等等电电聚聚焦焦、毛毛细细管管等等速速电电泳泳和和毛毛细细管管电电色色谱谱法法。上上述述这这些些方方法法近近几几年来在体内药物分析中均得到不同程度应用。年来在体内药物分析中均得到不同程度应用。选选用用何
15、何种种方方法法进进行行体体内内药药物物分分析析为为好好呢呢？一一般般要要根根据据药药物物的的理理化化性性质质、结结构构持持征征、药药物物浓浓度度大大小小、干干扰扰成成分分的的多多少少、预预处处理理方方法法、实实验验目目的以及实验室条件等因素综合起来进行考虑。的以及实验室条件等因素综合起来进行考虑。分析方法的设定依据(一一)做好文献总结、整理工作做好文献总结、整理工作对对已已有有报报道道的的药药物物进进行行测测定定，应应系系统统总总结结前前人人的的文文献献，从从中中找找出出哪哪些些问问题题已已解解决决，还还存存在在哪哪些些问问题题等等。对对尚尚无无文文献献报报道道的的，也也可可根根据据药药物物的
16、性质情况，参考相似类型药物的文献资料。的性质情况，参考相似类型药物的文献资料。(二二)充分了解待测药物的特性与体内状况充分了解待测药物的特性与体内状况药药物物的的理理化化性性质质和和体体内内过过程程是是建建立立方方法法的的主主要要依依据据。药药物物的的理理化化性性质质包包括括酸酸碱碱性性(pKa)、亲亲脂脂性性、溶溶解解度度、极极性性、光光谱谱特特征征、稳稳定定性性等等，这这些些性性质质与与分分析析方方法法的的选选择择、实实验验条条件件的的改改善善密密切切相相关关。与与常常规规分分析析方方法法不不同同，体体内内药药物物分分析析的的对对象象是是来来自自生生物物体体内内的的样样品品，因因此此对对药
17、药物物在在体体内内的的状状况况必必须须了了解解，如如药药动动学学参参数数、体体内内代代谢谢情情况况等等。这这涉涉及及样样品品取取样样频频率率与与间间隔隔，分分析方法的选择等。析方法的选择等。(三三)明确测定的目的、要求明确测定的目的、要求应应了了解解拟拟建建立立的的方方法法是是用用于于测测定定药药代代动动力力学学参参数数，还还是是用用于于临临床床药药浓浓监监测测。前前者者要要求求具具有有一一定定的的灵灵敏敏度度和和准准确确度度，不不强强调调简简便便、快快速速，设设计计方方法法时时应应考考虑虑到到不不同同时时间间获获得得的的样样品品中中药药物物浓浓度度变变化化较较大大这这一一因因素素。而而用用于
18、于临临床床药药浓浓监监测测，则则要要求求方方法法简简便便、快快速速。另另外外，是是否否要要求求同同时时测测定定母母体体药药物物和和代代谢谢物物，若若需需同同时时测测定定两两者者，则应选择具有分离能力或专属的测定方法。，则应选择具有分离能力或专属的测定方法。（四）结合实验室条件（四）结合实验室条件根根据据实实验验室室现现有有的的和和可可能能获获得得的的设设备备条条件件加加以以考虑，选择可行的方法。考虑，选择可行的方法。方法建立的一般实验步骤 方方法法初初步步拟拟定定后后，还还需需进进行行一一系系列列实实验验工工作作，以以选选择择最最佳佳实实验验条条件件及及验验证证所所拟拟定定的的方方法法是是否否
19、适合实样检测。通常包括下列步骤：适合实样检测。通常包括下列步骤：（一）以纯品进行测定（一）以纯品进行测定取取药药物物或或其其代代谢谢物物纯纯品品适适量量，按按拟拟定定方方法法测测定定，求求得得浓浓度度与与测测定定响响应应值值之之间间的的关关系系，进进行行线线性性范范围围、最最适适测测定定浓浓度度、检检测测灵灵敏敏度度、测测定定最最适适条条件件(如如pH值值、温温度度、反反应应时时间间等等）等等的的选选择。择。(二二)空白样品测定空白样品测定取取空空白白生生物物样样品品，按按拟拟定定的的方方法法进进行行处处理理，测测定定空空白白值值(或或色色谱谱图图)。空空白白值值高高低低或或色色谱谱图图状状况
20、况将将影影响响到到方方法法的的灵灵敏敏度度和和专专属属性性，应应力力求求将将空空白白值值降降低低。在在色色谱谱分分析析中中应应力力求求减减少少体体内内样样品品中中内内源源性性杂杂质质峰峰，对对无无法法消消除除的的内内源源性性杂杂质质峰峰应应设设法法使使其其从从待待测测物物的的色色谱谱区区域域内内移移开开。能能否否取取得得良良好好的的样样品品空空白白实实验验结结果果，是是决决定定测测定定方法实际可行性的重要环节，必须设法解决。方法实际可行性的重要环节，必须设法解决。(三三)以水代替空白样品，添加标准后测定以水代替空白样品，添加标准后测定以以水水代代替替空空白白生生物物样样品品，添添加加标标准准后
21、后按按拟拟定定的的方方法法进进行行测测定定，以以了了解解提提取取回回收收率率及及最最低低检检测测浓浓度度的的大大致致情情况况，从从而而对对萃萃取取溶溶剂剂、pH值值、挥发浓缩等条件进行选择。挥发浓缩等条件进行选择。(四四)空白样品中添加标准后测定空白样品中添加标准后测定于于空空白白生生物物样样品品中中添添加加一一定定量量标标准准品品后后按按拟拟定定方方法法进进行行测测定定，求求得得样样品品回回收收率率数数据据，建建立立标标准准曲曲线线。若若采采用用色色谱谱法法测测定定，多多数数情情况况下下需需要要用用内内标标法法定定量量，则则应应首首先先选选择择合合适适的的内内标标，然然后进行回收率的测定。后
22、进行回收率的测定。(五五)体内实际样品测定体内实际样品测定经经过过上上述述(一一)至至(四四)步步骤骤后后进进行行实实际际样样品品的的测测定定。但但要要指指出出的的是是，以以上上步步骤骤只只是是生生物物样样品品实实样样检检测测前前的的准准备备工工作作，不不能能完完全全确确定定是是否否适适用用于于实实样样测测定定。因因药药物物在在体体内内变变化化是是复复杂杂的的，如如不不注注意意药药物物代代谢谢和和蛋蛋白白结结合合情情况况，则则应应用用体体外外建建立立的的方方法法，进进行行体体内内实实样样测测定定时时往往往往会会失失败败，甚甚至至导导致致错错误误的的结结论论，所所以以在在设设计计方方法法时时强强
23、调调对对药药物物体体内内过过程程要要有有一一定定程程度度的的了了解解，从从而而选选择择避避免免干干扰扰和和适适合合样样品品实实际际情情况况的的方方法法。有有时时也也可可采采用用专专属属性性强强，已已证证明明用用于于体体内内实实样样测测定定的的步步骤骤和和方方法法作作为为对对照照测定，以此来检验所建立的方法的实际可行性。测定，以此来检验所建立的方法的实际可行性。方法的评价 对于所建立的体内药物分析方法的可行性与可对于所建立的体内药物分析方法的可行性与可靠性，需要应用若干标准来进行方法学的考察靠性，需要应用若干标准来进行方法学的考察与评价。这是研究和建立一个新的分析方法时与评价。这是研究和建立一个
24、新的分析方法时必须着重抓住的几个环节。必须着重抓住的几个环节。评价一个体内药物分析方法的优劣主要有以下评价一个体内药物分析方法的优劣主要有以下几个指标：精密度、准确度、灵敏度、专属性几个指标：精密度、准确度、灵敏度、专属性或选择性、可测浓度范围、测定所需时间以及或选择性、可测浓度范围、测定所需时间以及对生物样品的适应性等，现择要讨论如下：对生物样品的适应性等，现择要讨论如下：（一）准确度（一）准确度准准确确度度(accuracy)是是方方法法评评价价的的最最基基本本要要点点之之一一，它它是是表表示示测测定定结结果果与与真真值值的的符符合合程程度度。常常用用回回收收率率(recovery)数数值
25、值反反映映测测定定的的准准确确程程度度，也也可可通通过过与与其其他他已已建建立立的的方方法法进进行行比比较较的的办办法来加以反映。法来加以反映。将将已已知知量量的的药药物物纯纯品品加加到到空空白白样样品品(如如血血样样)中中去去，经经过过一一系系列列的的处处理理、测测定定，所所得得药药物物量量与与加入量之比值的百分率即为回收率。加入量之比值的百分率即为回收率。回回收收率率当当然然越越接接近近100越越好好，但但因因样样品品组组分分复复杂杂，含含量量低低，处处理理步步骤骤多多时时就就很很难难达达到到高高的的回回收收率率。对对于于一一个个方方法法来来说说，更更为为重重要要的的是是每每次次测测定定所
26、所得得回回收收率率要要保保持持恒恒定定，虽虽然然有有时时回回收收率率较较低低，但但只只要要重重现现性性好好，通通过过校校正正后后仍仍可可采采用用。根根据据回回收收率率测测定定方方法法不不同同可可分分为为绝绝对对回回收收率和方法回收率。率和方法回收率。1绝对回收率绝对回收率绝绝对对回回收收率率也也称称萃萃取取回回收收率率、提提取取回回收收率率，它它反反映映了了一一个个方方法法的的萃萃取取效效率率，与与体体内内样样品品检检测测灵灵敏敏度度有有关关，是是评评价价体体内内药药物物分分析析方方法法的的重重要要指标之一。指标之一。现现以以色色谱谱法法为为例例，说说明明绝绝对对回回收收率率的的求求算算过过程
27、程。例例如如取取一一定定量量被被测测药药物物标标准准品品，加加到到空空白白血血样样中中，按按规规定定方方法法处处理理，使使最最后后溶溶液液中中药药物物标标准准品品浓浓度度为为1ug/mL，测测定定色色谱谱峰峰面面积积，记记为为A测测，另另取取1ug/mL的的药药物物标标准准品品的的纯纯溶溶剂剂溶溶液液宜宜接接 进进 样样，测测 得得 色色 谱谱 峰峰 面面 积积 记记 为为 A真真，用外标法计算。，用外标法计算。绝绝对对回回收收率率应应考考察察高高、中中、低低3个个浓浓度度，低低浓浓度度选选择择在在定定量量限限(LOQ)附附近近，高高浓浓度度在在标标准准曲曲线线的的上上限限附附近近，中中间间选
28、选一一个个浓浓度度。对对于于回回收收率率的的大大小小与与变变异异不不宜宜苛苛求求，一一般般添添加加量量在在10-610-9级级，绝绝对对回回收收率率若若能能达达到到5080，应应认认为为是令人满意的。是令人满意的。在在色色谱谱分分析析中中常常采采用用内内标标法法测测定定含含量量，将将药药物物标标准准品品和和内内标标准准物物质质加加到到空空白白血血样样中中，按按规规定定方方法法处处理理，测测得得药药物物和和内内标标峰峰面面积积，求求出出它它们们的的比比值值R测测A药药/A内内。另另取取相相同同浓浓度度的的药药物物标标准准品品和和内内标标准准物物质质的的纯纯溶溶剂剂溶溶液液进进样样，得得药药物物标
29、标准准品品和和内内标标峰峰面面积积，计计 算算 两两 者者 的的 比比 值值 R真真 A药药/A内内。再根据下式求出回收率：。再根据下式求出回收率：在在内内标标法法中中，应应注注意意药药物物与与内内标标准准物物质质各各自自用用外外标标法法测测得得的的绝绝对对回回收收率率应应相相近近，两两者者相相差差应应小于小于10，否则回收率偏离，否则回收率偏离100太远。太远。2方法回收率方法回收率取取一一系系列列浓浓度度的的药药物物标标准准品品加加到到空空白白体体液液中中，按按设设定定方方法法测测定定，根根据据标标准准品品浓浓度度及及响响应应的的测测定定信信号号值值绘绘制制标标准准曲曲线线，先先按按最最小
30、小二二乘乘法法求求出出回回归归方方程程。然然后后取取高高、中中、低低浓浓度度的的药药物物标标准准品品添添加加到到空空白白体体液液中中，每每个个浓浓度度至至少少平平行行测测定定5份份，按按标标准准曲曲线线制制备备方方法法同同法法测测定定，所所得得信信号号值值代代入入回回归归方方程程，求求得得测测定定值值。最最后后与与加加入入量量比比较较，得得方方法法回回收收率率。除除定定量量限限外外，各各浓浓度度点点测测得得的的平平均均值值偏偏离离实实际际加加入入量量应应小小于于15，定量限这一点应小于定量限这一点应小于20。在在测测定定回回收收率率时时，不不管管采采用用何何种种方方法法，都都要要注注意以下几个
31、问题：意以下几个问题：添加的药物量必须与实际测定量相近；添加的药物量必须与实际测定量相近；添加物质必须与实际存在的状态相似；添加物质必须与实际存在的状态相似；必须同时做空白试验。必须同时做空白试验。上述上述、两点的原因：两点的原因：一一是是如如果果添添加加量量大大，实实际际测测定定量量小小，那那么么有有可可能能测测定定量量在在回回收收率率的的误误差差范范围围内内，这这样样就就不不可可靠；靠；二二是是如如果果添添加加量量大大，蛋蛋白白质质实实际际结结合合能能力力小小，这这样样存存在在在在空空白白血血样样中中的的添添加加药药物物部部分分没没有有结结合合，与与实实际际存存在在的的情情况况不不符符，测
32、测得得回回收收率率容容易易偏高。偏高。因因此此在在报报道道一一个个方方法法的的回回收收率率时时，必必须须说说明明添添加量。加量。方方法法的的准准确确度度有有时时也也可可用用一一个个已已证证明明有有相相当当专专属属性性和和可可靠靠性性的的方方法法与与新新建建立立的的方方法法同同时时进进行行测测定定，然然后后比比较较两两法法测测得得结结果果的的相相关关程程度度。用用相相关关系系数数r来来表表示示，一一般般要要求求r0.95，直直线线的的斜率接近斜率接近1，表明两法吻合。，表明两法吻合。(二二)精密度精密度精精密密度度(precision)是是表表示示一一组组测测量量值值彼彼此此符符合合的的程程度度
33、。有有多多种种表表示示方方法法，在在体体内内药药物物分分析析中中常用的表示方法有：常用的表示方法有：精精密密度度测测定定通通常常采采用用高高、中中、低低三三种种浓浓度度进进行行测测定定。低低浓浓度度选选择择在在定定量量限限(LOQ)附附近近，高高浓浓度度在在标标准准曲曲线线的的上上限限附附近近，中中间间选选一一个个浓浓度度。每每个个浓浓度度平平行行测测定定57次次，计计算算测测定定结结果果的的标标准准差差。除除定定量量限限外外，各各浓浓度度点点的的RSD不不应应大大于于15，最低定量限这一点不应大于，最低定量限这一点不应大于20。精精密密度度可可进进一一步步分分为为日日内内或或批批内内精精密密
34、度度和和日日间间或或批批间间精精密密度度。前前者者表表示示一一次次测测定定的的重重复复性性，后者表示不同时间测定结果的重复性。后者表示不同时间测定结果的重复性。日日内内(或或批批内内)精精密密度度是是考考察察分分析析方方法法在在短短期期内内测测定定方方法法的的变变异异情情况况，凡凡是是在在同同一一天天内内将将样样品品多多次次测测定定所所计计算算出出的的精精密密度度称称为为日日内内精精密密度度；凡凡在在同同一一批批内内样样品品多多次次测测定定所所计计算算出出的的精精密密度度称称为为批批内内精精密密度度。所所谓谓“批批内内”是是指指测测定定时时使使用用同同批批试试剂剂、同同一一条条标标准准曲曲线线
35、等等主主要要相相同同条条件件下完成的分析测定。下完成的分析测定。日日间间(或或批批间间)精精密密度度是是考考察察分分析析方方法法在在不不同同时时间间测测定定结结果果的的变变异异情情况况。由由于于体体内内药药物物分分析析面面临临样样品品数数量量多多，测测定定持持续续时时间间长长，往往往往在在同同一一天天或或同同一一批批内内不不能能完完成成，因因此此样样品品测测定定时时使使用用的的仪仪器器性性能能、试试剂剂、标标准准曲曲线线及及环环境境条条件件等等都都可可能能发发生生微微小小的的变变化化，从从而而导导致致分分析析结结果果的的变变异异增增大大。因因此此，考考察察分分析析方方法法的的精精密密度度时时，
36、还还应应考考察察日日间间或或批批间间精精密密度度。测测定定时时可可使使用用日日内内(或或批批内内)精精密密度度测测定定时时，所所使使用用的的高高、中中、低低三三种种浓浓度度样样品品，在在同同一一周周内内不不同同日日(或或不不同同批批)分分别别测测定定35次次，然然后后计算出计算出RSD。（三）灵敏度（三）灵敏度灵灵敏敏度度(sensitivity)是是指指一一种种方方法法可可以以检检测测出出有有关化合物的最小量，常用以下几种表示方法。关化合物的最小量，常用以下几种表示方法。1检测限检测限(limit of detection，LOD)检检测测限限表表示示在在生生物物介介质质中中药药物物的的最最
37、低低可可测测度度(或绝对量或绝对量)。通通常常以以被被测测信信号号和和背背景景噪噪音音比比S/N为为23倍倍时时的的被被测测物物的的绝绝对对量量来来表表示示，LOD3N/S（N噪音，噪音，S被测物信号被测物信号/单位重量单位重量)。例例如如，在在色色谱谱分分析析中中，测测得得N1mm，取取2ug/mL的的样样品品液液20uL进进样样，测测得得峰峰高高为为30mm。按上式计算：按上式计算：即以即以S/N3时，测得得样品的品的LOD为4ng。也也可可通通过多多次次空空白白试验，求求得得背背景景响响应的的标准准差差，再再乘乘以以2或或3，作作为LOD的的估估计值，然然后后配制相配制相应检测限限浓度度
38、样品，反复品，反复测试来确定。来确定。2定量限定量限(limit of qnantification，LOQ)定定量量限限是是指指生生物物介介质质中中药药物物可可定定量量测测定定的的最最低低量量，表表示示方方式式和和测测定定方方法法与与检检测测限限相相同同，它它与与检检测测限限的的不不同同在在于于定定量量限限规规定定的的最最低低测测得得浓浓度度应该符合一定精密度和准确度的要求。应该符合一定精密度和准确度的要求。通通常常以以标标准准曲曲线线的的最最低低浓浓度度点点作作为为定定量量限限。也也可可以以S/N10或或空空白白背背景景响响应应的的标标准准差差乘乘以以10作为估计值，再通过试验确定。作为估
39、计值，再通过试验确定。在在进进行行药药物物制制剂剂人人体体生生物物利利用用度度和和生生物物等等效效性性试试验验时时要要求求LOQ至至少少能能满满足足测测定定35个个半半衰衰期期 时时 样样 品品 中中 的的 药药 物物 浓浓 度度，或或 Cmax的的1/101/20时的药物浓度。时的药物浓度。3最低检测浓度最低检测浓度最最低低检检测测浓浓度度则则多多指指可可进进行行定定量量测测定定的的某某一一药药物物的的最最低低浓浓度度，它它与与样样品品体体积积大大小小等等因因素素有有关关，可通过下式求得，可通过下式求得，以以上上表表示示灵灵敏敏度度的的方方法法均均是是指指仪仪器器的的灵灵敏敏度度，即进入仪器
40、的最低绝对量或最低浓度。即进入仪器的最低绝对量或最低浓度。如如果果我我们们要要知知道道体体内内样样品品的的浓浓度度检检测测限限，则则要要根据样品处理方法，考虑稀释度。根据样品处理方法，考虑稀释度。体体内内样样品品的的浓浓度度检检测测限限仪仪器器的的浓浓度度检检测测限限样品稀释度样品稀释度例例如如，取取血血样样1mL，经经处处理理后后进进样样前前的的血血样样最最终终体体积积为为0.1mL，已已知知最最低低检检测测浓浓度度为为10-6，则则血血样样中中被被测测物物的的最最低低浓浓度度为为0.110-6。若若 经经 处处 理理 后后，最最 终终 体体 积积 为为 10 mL，则则血血样样中中被被测测
41、物物的的最最低低浓浓度度为为1010-6。这这表表明明虽虽然然仪仪器器灵灵敏敏皮皮相相同同，但但因因样样品品预预处处理理方方法法不不同同，就就有有可可能能影影响响到到实实际际样样品品测测定定的的灵敏度。灵敏度。要提高检测灵敏度，可采用如下一些方法：要提高检测灵敏度，可采用如下一些方法：提高仪器本身的灵敏度；提高仪器本身的灵敏度；提高进样量；提高进样量；降低仪器噪音；降低仪器噪音；提高样品的浓缩程度或降低样品稀释度；提高样品的浓缩程度或降低样品稀释度；消消除除干干扰扰，降降低低空空白白值值，这这可可通通过过改改变变色色谱谱条条件件，改改进进预预处处理理方方法法来来减减少少于于扰扰杂杂质质的的影影
42、响响。（四）方法的专属性（四）方法的专属性方方法法的的专专属属性性(specificity)也也称称选选择择性性(selectivity)，是是指指样样品品中中含含有有其其他他共共存存物物质质时时，该该法法定定量量测测定定被被测测物物的的能能力力。即即测测定定的的讯讯号号应应是是属属于于被测物所特有的，否则就易受干扰。被测物所特有的，否则就易受干扰。考考察察一一个个方方法法是是否否专专属属，应应着着重重考考虑虑代代谢谢物物、内源性物质和同时服用药物的干扰。内源性物质和同时服用药物的干扰。专专属属性性的的测测定定通通常常取取6个个个个体体空空白白样样品品(要要求求对对这这6个个个个体体的的取取样
43、样时时间间、膳膳食食结结构构以以及及影影响响实实验验的的其其他他因因素素加加以以控控制制)，采采用用拟拟定定的的方方法法进进行行测测定定。所所得得结结果果与与接接近近于于定定量量限限的的被被测测物物浓浓度度的的纯纯溶溶剂剂溶溶液液所所得得结结果果进进行行比比较较。在在药药物物、代代谢谢物物、内内标标物物的的tR处处不不应应有有大大的的干干扰扰，任任何何有有大大的的干干扰扰的的空空白白应应舍舍去去。如如果果大大于于10的的空空白白样样品品显显示示大大的的干干扰扰，应应另另取取一一组组空空白白样样品品重重试试，如如果果仍仍有有10以以上上的的空空白白样样品品显显示示大大的的干干扰扰，则则应应改改变
44、变拟拟定定的的方法，以消除干扰。方法，以消除干扰。在在报报告告专专属属性性时时，若若采采用用色色谱谱法法测测定定，至至少少要要提提供供空空白白生生物物样样品品色色谱谱图图，空空白白生生物物样样品品外外加加标准品色谱图及用药后的样品色谱图。标准品色谱图及用药后的样品色谱图。(五五)线性范围线性范围线线性性范范围围(1inear range)是是指指利利用用该该法法取取得得精精密密度度、准准确确度度均均符符合合要要求求的的试试验验结结果果，而而且且成成线线性性的的供供试试物物浓浓度度的变化范围。的变化范围。通通常常是是将将药药物物标标准准品品加加入入空空白白体体液液中中，制制成成一一系系列列不不同
45、同浓浓度度的的标标准准液液，按按规规定定方方法法处处理理、测测定定。根根据据药药物物标标准准品品浓浓度度和和响响应应的的信信号号值值绘绘制制标标准准曲曲线线，或或计计算算回回归归方方程程，求求出出r值值和和浓浓度度范围。范围。标标准准曲曲线线的的制制备备一一般般由由一一个个空空白白，一一个个零零标标准准(空空白白样样品品加加内内标标)和和58个个非非零零标标准准(系系列列浓浓度度标标样样)组组成成，要要求求覆覆盖盖实实际际的的样样品品浓浓度度范范围围，包包括括LOQ。空空白白和和零零标标准准不不用用作作标标准准曲曲线线的的计算，仅作为对干扰的考察。计算，仅作为对干扰的考察。线线性性程程度度可可
46、用用最最小小二二乘乘法法处处理理数数据据，求求得得相相关关系系数数r，一一般般r不不应应低低于于0.99，同同时时必必须须符符合合一一定定的的精精密密度度和和准准确确度度。要要求求LOQ处处偏偏离离标标准准浓度应小等于浓度应小等于20，其他各点应小等于，其他各点应小等于15。（六）稳定性（六）稳定性药药物物的的稳稳定定性性(stability)是是贮贮存存条条件件、药药物物的的化化学学性性质质、空空白白生生物物样样品品和和容容器器系系统统的的函函数数。在在特特定定的的容容器器和和生生物物样样品品中中待待测测物物的的稳稳定定性性不不能能外外推推至至其其他他系系统统。在在生生物物样样品品中中待待测
47、测物物的的稳稳定定 性性 包包 括括 长长 期期 贮贮 存存、短短 期期 贮贮 存存 和和 冷冷 冻冻-解解冻冻循循环环过过程程中中的的稳稳定定性性，也也包包括括标标准准贮贮备备液液中待测物的稳定性。中待测物的稳定性。1长期贮存稳定性长期贮存稳定性长长期期稳稳定定性性的的贮贮存存时时间间应应超超过过收收集集第第一一个个样样品品至最后一个样品分析所需的时间周期。至最后一个样品分析所需的时间周期。贮贮存存温温度度一一船船为为-20，如如果果需需要要也也可可在在-70贮贮存存。要要求求高高、低低浓浓度度至至少少分分别别测测定定3次次，与第一天测得的相应浓度的结果进行比较。，与第一天测得的相应浓度的结
48、果进行比较。2短期室温稳定性短期室温稳定性高高、低低浓浓度度各各3份份于于室室温温下下放放置置424h(根根据据实实际际操操作作在在室室温温中中需需维维持持的的时时间间而而定定)，在在不不同同时时间间点点取取样样，进进行行分分析析，与与0h测测得得结结果果进进行行比比较。较。3冷冻冷冻-解冻稳定性解冻稳定性取取 高高、低低 浓浓 度度 样样 品品 至至 少少 各各 3份份，于于-20贮贮存存24h，取取出出置置室室温温放放置置使使自自然然融融解解。当当融融解解完完全全后后，取取样样，进进行行分分析析。然然后后再再把把样样品品放放回回冷冷冻冻状状态态保保持持1224h，如如此此解解冻冻-冷冷冻冻
49、应应重重复复循循环环二二次次以以上上，然然后后比比较较各各次次分分析析结果。结果。4贮备液稳定性贮备液稳定性药药物物与与内内标标的的贮贮备备溶溶液液的的稳稳定定性性应应对对其其在在室室温温下下至至少少6h的的稳稳定定性性进进行行考考察察，然然后后将将其其冷冷藏藏或或冷冷冻冻714d或或恰恰当当周周期期后后进进行行测测定定，所所得得仪仪器器响应值与新鲜配制溶液所得响应值进行比较。响应值与新鲜配制溶液所得响应值进行比较。应用实例 例例1：用用HPLC法法测测定定生生物物样样品品中中淫淫羊羊藿藿苷苷的的浓度。浓度。1、实验方法、实验方法(1)色色 谱谱 条条 件件 色色 谱谱 柱柱：Zorbax O
50、DS(10um，4.6mm250 mm)；柱柱温温：35；流流动动相相：四四氢氢呋呋喃喃-水水-冰冰 醋醋 酸酸(20：75：5)；流流 速速：1.0 mL/min；紫紫外外检检测测波波长长：270nm；检检测测灵灵敏敏度：度：0.02UFS。(2)生物样品的处理生物样品的处理血血浆浆：取取样样品品0.1mL置置10 mL离离心心管管中中，加加入入乙乙酸酸乙乙酯酯3.5mL，振振荡荡3min，离离心心(2000 r/min，5min)，移移取取上上清清液液，于于50水水浴浴用用氮氮气气吹吹干干，残残渣渣加加内内标标液液100uL，振振荡荡溶溶解解后后进进样样20uL。粪粪和和尿尿：大大鼠鼠粪粪