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1、试验五 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗过氧化物酶同工酶生物 111 班杨明轩1102040128一、争辩背景及目的过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，具有消退过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系，在种子萌动以前,它们的过氧化物酶同工 酶很少,待幼芽长到 0.5 - 1 厘米以后,它们的过氧化物酶才得到充分的表达。这说明植物过氧化物酶同工酶的多寡和有无,与植物不同发育时期,与植物的不同组织、器官的分化形成及特定的生理状态等均有亲热关系。而同工酶是指能催化同一种化学反响，但其酶蛋白本身的分子构造组成却有所不同的一组酶。大多数基因性同
2、工酶由于对底物亲和力不同和受不同因素的调整，常表现不同的生理功能。它们存在于生物的同一种属或同一个体的不同发育阶段，或同一发育阶段的不同组织，在细胞发育和代谢调解中起重要作用。在动、植物中，一种酶的同工酶在各组织、器官中的分布和含量不同，形成各组织特异的同工酶谱，表达各组织的特异功能，这一特点可用于争辩物种进化、遗传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等。品种资源工作者借助同工酶分析品种的地理分布与亲缘关系来指导品种资源的收集与鉴定工作。育种工作者常用同工酶来作为鉴定植物的种间杂交, 特别是远缘杂交的生化指标。在医学方面，同工酶是争辩癌瘤发生的重要手段。要对同工酶开放争辩，首先要实现对它的分别，
3、因此要选择适宜的分别技术。基于“差异转化”的思路，层析和电泳是两种最为常见的大分子分别方法。但由于二者技术细节上的差异，层析更常用于大分子的分别纯化，而电泳则主要用于大分子的分别检测。因此在本次试验中，我们承受不连续的聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗中的过氧化物酶同工酶。同时本试验利用电泳现象对过氧化物同工酶进展分别纯化和分析鉴定，通过电泳技术的实际操作体会电泳技术的原理和特点，比较分析电泳技术和其它分别技术如层析技术的不同，进一步学习应用更为广泛和纯化水平更高的分别技术。二、试验原理1、电泳现象。带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象成为电泳。电泳现场常受到带电粒子的 实际
4、电荷，大小及外形，解离度等因素的影响，因其环境的不同，又表现为受电解质或缓冲液浓度、离 子强度、pH、粘度、温度以及电场强度等因素的综合作用。但在支持介质中，电泳的结果往往取决于介质的选择，即电泳受介质性质的影响，例如介质的化学惰性、化学稳定性，均一性以及电渗性质等。2、凝胶电泳的载体选择凝胶电泳的介质选择至关重要，而电泳的结果也往往取决于该介质的性质。本试验承受不连续的聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳。聚丙酰胺凝胶电泳是区带电泳的一种。而区带电泳是胶体在惰性支持介质中进展电泳，不同组分形成带状区间。支持介质的存在削减了界面特别现象的干扰和样品的集中，适用于生物分子的分别和鉴定。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯
5、酰胺单体Acr和交联剂 N,N-甲叉双丙烯酰胺Bis1在催化剂条件下聚合而成。在小分子量电泳试验中，常承受化学聚合法制备凝胶，所用的引发剂为过硫酸铵Ap，催化剂为四甲基乙二胺TEMED。聚丙烯酰胺的根本构造，为丙烯酰胺单位构成的长链， 链与链之间通过甲叉桥连接起来，形成纵横穿插的三维构造，使凝胶具有分子筛的性质。聚丙烯酰胺凝胶可以通过转变浓度和交联度来把握不同大小的凝胶孔径，取得更好的区分效果。其中，聚丙烯氨酰胺凝胶的机械性能好、有弹性、透亮、化学上稳定、对 pH 和温度变化不敏感、没有吸附和电渗作用，且试验所需样品量小，区分率高，因此是最为常用的支持介质。而承受垂直板电泳，是由于电泳胶板的外
6、表积大，不与缓冲液直接接触，易于冷却控温，且能够在同一胶板、同一操作下同时比较多个样品，便于进展各种鉴定。本次电泳的凝胶系统为不连续系统，即凝胶板分为上层的浓缩胶和下层的分别胶，且缓冲液离子组成和各层凝胶的 pH 不同。在不连续系统中的电荷效应、分子筛效应和浓缩效应的共同作用下，待测物质能够很好的分别开来，系统的区分率较连续系统大大提高。因此，试验承受不连续的聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳来实现小麦中过氧化物酶同工酶的分别。3、凝胶系统聚丙烯酰胺凝胶电泳是不连续的凝胶系统，其不连续性表现在上下凝胶层的不同组成导致的凝胶浓度和交联度差异，不同凝胶缓冲液导致的凝胶层pH 值不同，以及由于pH 不同导致的
7、在电场中形成了不连续的电位梯度。在这个不连续的凝胶系统里，存在着三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应以及浓缩效应，物质的分别主要是在这三种效应的作用下实现的。电荷效应：各种酶蛋白按其所带有的电荷种类以及数量，在电场作用下以肯定的速度向肯定电极。分子筛效应：分子量小、形态为球形的分子在电泳中受到的阻力较小，移动速度快，反之则移动较慢。这与凝胶过滤系统中的分子筛效应是不同的。浓缩效应：待分别样品中的各组分在凝胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品快速以高浓度浓缩， 缘由如下：两层凝胶的孔径不同，在分别胶与浓缩胶的界面会形成压缩层，使淡薄的样品快速高度浓缩； 利用在凝胶介质中 Cl-，Gly 以及酶蛋
8、白分子三者在不同 pH 缓冲液中的解离效果不同，进而在前导离子和跟随离子之间形成一个低离子浓度区，即低电导区，从而形成了较高的电位梯度，加速形成酶蛋白区带。 而进入分别胶后，由于酶蛋白不再处于低电导区，因此能够在均一的电位梯度和 pH 条件下泳道，仅依据电荷效应和分子筛效应被分别。4、条带染色本试验由于分别纯化过氧化物酶同工酶为生物大分子，难以用肉眼直接进展谱带的分析和处理，因此需要对电泳谱带进展显色处理。此反响中产生氧自由基，能够与联大茴香胺发生颜色反响，产生褐色的化合物，使条带可见，用于分析过氧化物酶同工酶的分别纯化效果。三、仪器与试剂试验材料：小麦幼苗； 试验试剂：试剂名称2%琼脂分别胶
9、缓冲液pH8.9 Tris-HCl 缓冲液浓缩胶缓冲液pH6.7 Tris-HCl 缓冲配制方法2g 琼脂，100ml pH8.3 电极缓冲液浸泡，用前加热溶化取 1M HCl 48ml, Tris 36.8g,用去离子水溶解后定容至 100ml取 1M HCl 48ml, Tris 5.98g,用去离子水溶解后液分别胶丙胶储液Acr-Bis 储液浓缩胶丙胶储液Acr-Bis 储液 过硫酸铵溶液Ap电极缓冲液pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液40%蔗糖溶液pH4.7 乙酸缓冲液样品提取液pH8.0 Tris-HCl 缓冲液 0.5%溴酚蓝溶液联大茴香胺染色液定容至 100mlAcr 28.0g
10、, Bis 0.735g, 去离子水溶解后定容至100ml，滤去不溶物Acr 18g, Bis 0.8g,去离子水溶解后定容至100ml1g 过硫酸铵溶于100ml 去离子水中当天配置 Tris 6g, 甘氨酸 28.8g，去离子水溶解后定容至1000ml，使用时稀释 10 倍蔗糖 40g 溶于 100ml 去离子水中乙酸钠 70.52g 溶于 500ml 蒸馏水, 加 36ml 冰醋酸，蒸馏水定容至 1000mlTris 12.1g，加去离子水 1000ml，用 HCl 调整 pH至 8.00.5g 溴酚蓝溶于 100ml 去离子水中联大茴香胺 250mg 溶于 140ml 95%乙醇中，加
11、20ml 蒸馏水，使用前加 3% H O4-5 ml22四甲基乙二胺TEMED原液试验仪器：DYY-III2 稳压稳流电泳仪一套北京市六一仪器厂、烧杯 50ml3，微量进样器上海安亭微量进样器厂、大培育皿一套、微量可调手动移液器Dragon。四、试验方法1、贮液配制教师完成依据试验指导 39 页表格配制贮液。在配置贮液的时候需要留意：（1） 配好的丙胶贮液用棕色瓶盛装置冰箱内保存，可存放12 个月。（2） 过硫酸铵应当天配置。（3） 染色液应当天配置。（4） 电极缓冲液用时稀释 10 倍。2、凝胶的制备（1） 将贮液由冰箱取出，待与室温平衡后再配制工作液。（2） 安装电泳槽。安装时，留意旋紧螺
12、丝时要均衡用力，以免夹碎玻璃片。（3） 用 2%琼脂封底，以防漏胶。（4） 按下表所示配制分别胶名称用量ml分别胶缓冲液1.3分别丙胶贮液2.7去离子水6.0TEMED0.040过硫酸铵0.40在小烧杯中混匀后，马上灌胶至据短玻璃片顶端2cm 左右。马上用滴管在胶的上层留神轻缓地掩盖23mm 的水层。再次消灭界面后，再静置一会儿，将水倒出，用滤纸条从一侧略微吸浸，留意不要碰毁胶面，预备灌注浓缩胶。（5） 按下表配制浓缩胶名称用量ml浓缩胶缓冲液浓缩丙胶贮液去离子水过硫酸铵0.51.02.2TEMED0.0150.20混匀后马上灌胶，操作同上，至胶面与短玻璃片顶端平齐，马上插入样品槽模板梳子。聚
13、合完成后，在电泳槽内倒入电极缓冲液，使短玻璃片一侧电极缓冲液没过玻璃片顶端，长玻璃片一侧电极缓冲液没过电极丝，然后留神拔出梳子，预备点样。3、样品的制备教师完成，已加好溴酚蓝称取小麦幼苗叶片 1g，放入研钵内，加 pH8.0 样品提取液 2ml，于冰浴中研成匀浆，然后以 4ml 提取液分几次洗入离心管，在高速离心机上以8000rpm 离心 10min，倒出上清液，以等量 40%蔗糖混合， 即为样品液 1。同上操作，再制备一份小麦幼苗根部的样品液2。4、点样向样品液中滴加 12 滴溴酚蓝作为前沿指示剂，然后用微量进样器梯度上样。每种样品分别上样 5l、15l、30l、50l。5、电泳接好电源线。
14、翻开电源开关，调整电流，初始时把握在 10mA 左右，当前沿进入分别胶后，可调整电流到 25mA 左右，待前沿指示剂染料下行至据胶板末端 0.51cm 处，即可停顿电泳。整个电泳依据稳流电流大小差异，大约需要 34 小时。6、剥胶、染色及记录结果电泳完毕之后，将垂直板从电泳槽上取下，留神地将两块玻璃板分开，并留神地将凝胶置于大培育皿中，进展染色。向大培育皿中倒入大约50ml pH4.7 乙酸缓冲液，将胶板漂浮，室温浸泡10min。倒掉乙酸缓冲液，参加联大茴香胺染色液，将胶板漂浮，室温下浸泡至胶板彻底变白，在此期间会消灭过氧化物同工酶的谱带，待染色条带充分显色后观看记录酶谱并分析结果。五、数据整
15、理试验得到的电泳条带照片如以下图 1：Line1 Line5 Line2Line3Line6 Line4根Line1 Line7 Line2Line3Line4叶图 1 电泳条带照片4六、结果描述与争辩及分析一结果描述与分析从横向上看，line1、line2、line3、line4 所代表的酶是根和叶中所共有的，且都是根中的含量高；说明其在植物生长的不同阶段都起着重要作用，且这两种酶对根的生长发育与功能执行有更大的作用。 Line5、line6 代表的酶是根中独有的，叶中没有；说明这两种同工酶只在根中发挥作用，那么可以推想其与根独有的功能如离子的吸取等有关。而line7 所代表的酶只存在于叶中
16、，说明该酶只在叶中发挥作用， 可以推想其功能与叶片特有的功能如光合作用等相关。从纵向上看，根中共含有6 种过氧化物酶同工酶，其含量由高到低依次为line4、line2、line1、line5 line3、line6 所代表的酶；这说明 line4 对根最为重要。且而叶中共含有 5 种过氧化物酶同工酶，其中 line3 代表的酶含量最高，line2、line4 所代表的酶含量相差不大但均比line7 多，line1 的酶含量极微小；这说明叶片中存在着较为简单的生化反响，需要多种酶来催化，而这些反响的重要性差异不大。总体来看，根中的酶含量要高于叶中的酶含量。分析认为，这是可能是由于鉴于小麦幼苗叶片
17、组织尚未完全发育，其叶片中代谢强度低于根部；而为了满足小麦幼苗对水分、能量及其他养分元素的摄入， 根部此时需要大量的酶进展酶促反响以满足幼苗生长的需求。结合叶片与根部存在的主要代谢活动，可以说明过氧化物酶同工酶在植物的呼吸作用、物质交换等过程中起到了重要作用，是植物体内重要的一种酶类。二争辩我们觉察最终得到的电泳条带有较为明显的弥散，尤以line3、line4 最为明显。究其缘由，一是受到天气、仪器等因素影响，电泳过程中胶板散热不良，造成局部酶降解，分子量发生变化，泳动到不同位 置。但只要酶活性中心完整，就能够与联大茴香胺染液显色，就显示出弥散的条带。二是电泳应承受稳 压更适宜，但过程中由于体
18、系电阻增大，电流下降，所需时间较长，不适用于学生试验。因此本次试验 承受的是稳流，但这会造成电泳过程中分子的移动速度不全都，条带弥散。三是由于这是我们第一次做 电泳试验，制胶的均一度不够好，表达在 line2、line3 四组平行梯度没有做到条带平行，影响了试验结果。七、结论与展望1、本次试验中，我们共在小麦根和叶中分别出7 种过氧化物酶同工酶，根部6 种，叶片5 种；其中2 种为根部独有，1 种为叶片独有，4 种为二者共有。结果说明，在根和叶中，都有多种酶在起作用，相互协作共同作用于植物的生长与发育。而且不同器官中，酶的含量不同，发挥着不同的作用。2、电泳技术制造的最初目的是应用于生物大分子
19、的精细分别，但在应用过程中，历经屡次改进，最终以其独特的优势成为了样品分析和鉴定的主要技术手段。在现代科学争辩中，电泳技术与层析技术相 辅相成，相互弥补，共同完成了大量的科研任务。可以预见，二者将在将来的科研中连续扮演重要角色， 并得到不断改进与进展。3、不同的组织和器官的过氧化物酶的同工酶的酶谱差异很大,而大多数组织有其专一的同工酶带。 说明在高等植物的生长发育过程中,同工酶的多种分子形式具有阶段特异性和组织特异性。测定该酶或其 同工酶的活性变化状况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。种子工作者利用同工酶来测定种子的生活力。由于种子生活力强弱表现在呼吸酶的变化上, 种子发芽率减退时, 其细
20、胞色素氧化酶及过氛化物酶同工酶带就显著削减。假设要进展进一步的分析鉴定，可将电泳条带上的酶蛋白剪切下来，经过洗脱， 进展分析。这也是使用电泳技术分别纯化的好处。5八、思考题1、电泳凝胶缓冲系统电极缓冲液、浓缩胶缓冲液、分别胶缓冲液在电泳技术中的作用？ 答：1电极缓冲液的作用具有导电作用，构成电泳回路的一局部；供给弱碱性的缓冲体系pH8.3；供给 Gly pI=5.97，在不同 pH 下具有相应的解离度；为蛋白样品供给与之相匹配的离子强度；从而使样品具有适宜的泳动速度；供给液体环境，帮助胶板散热。（2） 浓缩胶缓冲液的作用供给前导离子 Cl-；供给接近中性的缓冲环境pH6.7，甘氨酸解离度很小，
21、成为跟随离子，最终形成电位梯度，产生浓缩效应，从而到达将样品浓缩的目的。（3） 分别胶缓冲液的作用供给 pH8.9 的缓冲环境，使甘氨酸解离度剧增，消退不连续的高电位梯度，使分别过程仅靠电荷效应及分子筛效应进展。2、样品中参加 40%蔗糖溶液的作用是什么？答：增加样品溶液的密度，使样液能够沉到样品槽的底部；增加样品的粘度，使样品不简洁发生侧向的集中造成条带弥散甚至对周边条带造成干扰。3、两侧电泳槽中的电极缓冲液用过一次之后，是否可以回收再用？为什么？答：正负极槽中的电极缓冲液根本上是相互分别的，没有直接接触，然而由于 Tris-Gly 缓冲液的初始pH 为 8.3，电泳过程中电泳槽中发生了水在
22、碱性条件下的电解。下面就阴阳两极反响分别争辩（1） 对于正极槽中的电极缓冲液来说，由于浓缩胶及分别胶中的 Cl-始终作为前导离子向正极移动 ，最终进入到正极的电极缓冲液当中；同时阳极电极反响为，。这两者都会使电极缓冲液成分发生转变， 故不能够连续使用。（2） 对于负极槽中的电极缓冲液来说，首先一点是它接触到了样品液，必定会受到肯定程度的污染。其次阴极电极反响为 4OH-O22H2O4e-，结果为阴极一侧 pH 下降。同时其成分中 Gly 进入胶板导致溶液中 Gly 含量下降，故也不能够连续使用。4、利用电泳技术获得秀丽试验结果的关键因素主要是哪些？为什么？答：1制胶：制胶最重要的是保证胶板的均
23、匀，使大分子在胶板的不同位置受到的作用全都。首先在配制凝胶的时候，要先把缓冲液、凝胶贮液、去离子水、TEMED 混合均匀，最终再参加引发剂过硫酸铵，快速搅匀后灌胶。避开在灌胶之前或灌胶过程中就发生凝胶的聚合。其次，参加分别胶后，要马上掩盖 23mm 厚的水层，隔绝空气，防止O2 淬灭凝胶外表的自由基影响凝胶的均一性。但加水不行过多，避开造成凝胶顶部与下部在含水量上的差异。加水时肯定要轻柔，避开冲垮胶面。灌入浓缩胶之前要将水倒出，并用滤纸条洗净，避开两层凝胶之间有水层存在，在电泳过程中造成样品的集中。但要留意滤纸条吸水不行过度，造成凝胶脱水。最终，插入梳子时要避开带入气泡。（2） 上样：上样要快
24、速，样品注入后不能再吸出，避开集中。不同样品上样时，应当以体积小的样相邻，或者样品之间留出一个样品槽，避开样品集中相互影响。（3） 电泳：选择适宜的电流电压形成适宜的场强，进而把握样品迁移的速度，电压太大使样品迁移过快，条带不能很好的分别，太小是样品迁移过慢，时间过长，有可能使样品集中，影响分别效果。电泳完毕之后不能直接关闭电源，避开样品发生集中。停顿电泳之后，要马上对胶板进展处理，使条带固定，再进展其他操作。5、应用或争辩的需要和理论上的可行性以及实践中的可操作性是一项技术得以制造的三大前提条件， 而完成后的应用实效反过来又会对前期的设计予以进一步修正和指导甚至提出的问题，比较电泳技术 与层
25、析技术的异同点，说明为何基于进一步提高生物大分子纯化水平而被制造的电泳技术，最终却是更为广泛地应用于样品的分析鉴定而并非最初定位的分别纯化？这种转化给我们什么启发？答：1二者的根本原理是一样的。都是依据“差异转化“的思路，将不同物质分子之间的大小、电荷性质、亲和力量等理化性质的差异，在肯定条件下转化为运动速度的差异，并通过时间的累积形成运动距离的差异，从而将不同的物质分开。但电泳和层析实现差异转化的方式不同：层析过程中分子运动的动力是其自身的重力，而电泳过程的动力则是电场力。这就造成了电泳体系会发热，进而影响被分别物质的活性。（2） 基于差异转化的原理，要实现大分子更加精细的分级，就要延长运动
26、距离，对于电泳，就是增加胶板长度；而要实现足够大量样品的一次性分别，就要增加上样量，对于电泳就是要增加胶板厚度。 这就与电泳技术的动力电场力产生了冲突。电流具有热效应，电泳过程中胶板是要发热的。增长、 加厚胶板就不利于散热，造成胶板温度上升，大分子失活，达不到最初分别纯化的目的。但是，由于一 个胶板上可以同时处理几个不同样品，分别速度相对较快，且处理之后各个样品就分布在同一个平面支 持物上，便于进一步的检测与分析。因此，电泳技术最终更加广泛地应用于样品的分析和鉴定。（3） 一方面，技术的制造首先要以应用和争辩的需求为动力，以理论上的可行性为根底进展设计， 并进展实际应用。但在应用过程中，往往会觉察效果达不到最初的设计要求或者是在某些环节的设计上 不够完善。这样觉察问题之后，就要进展针对性的修正，以期尽可能满足设计的需要。另一方面，对于 一个技术方法，有其特长也尤其短处。我们要看到，即使再努力地弥补，短处还是短处，很难赶得上另 一种技术的特长。因此，对于短处，只需要弥补到肯定程度即可，更重要的是充分发挥特长。