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1、Twist在肾癌中的表达及意义 专专 业：泌尿外科业：泌尿外科 姓姓 名：穆家贵名：穆家贵 导导 师：倪少滨教授师：倪少滨教授 一、立题依据一、立题依据 二、实验目的二、实验目的 三、实验资料与方法三、实验资料与方法 四、数据整理与统计分析四、数据整理与统计分析 五、预期结果以及可行性分析与研究计划五、预期结果以及可行性分析与研究计划六、参考文献参考文献立题依据立题依据肿瘤是一类细胞周期失控性疾病，增殖失控和凋亡抑制是肿瘤细胞的基本特征。近几年来研究表明，过度抑制凋亡很可能导致肿瘤的形成，抑癌基因的突变和抗凋亡基因的过度表达往往是肿瘤形成的先兆【1，2。恶性肿瘤已成为人类第2位的死亡原因，全世
2、界每年约有1010余万人患恶瘤，我国每年约新发病例200万，死亡约150余万人，其中60%以上癌症。肿瘤的防治已列为全世界日益关注的课题，探寻癌症的发生机制，有效的防治及治疗策略尤其重要。作为恶性肿瘤之一的肾癌在我国近20年尤其在大城市发病率明显上升，肾癌的发病机制还不明确，现有的治疗方法虽然有一定的效果，但长期效果无法估计。Twist基因首先在果蝇中被发现，因其突变后引起果蝇胚胎扭曲样变化而得名。随后相继在水母、文昌鱼、斑马鱼、蟾蛛、小鼠、大鼠以及人类中被确认，它们均能编码碱性的螺旋一环一螺旋(bHLH)DNA结合的转录因子。人Twist基因位于染色体7p21.2，含有2个外显子和1个内含子
3、，由606个碱基构成，编码由202个氨基酸组成的Twist蛋白，通过形成二聚体发挥转录因子的作用。Twist蛋白分子量为26kD，等电点为9.591，其梭基末端含有碱性的DNA结合序列和二聚化作用基序，梭基末端具有疏水性而氨基末端具有亲水性。Twist属于碱性的螺旋一环一螺旋(Basiehelixloophelix，bHLH)蛋白家族中高度保守的转录因子，主要表达于胎盘、胚胎中胚层和成人的某些中胚层来源的未分化组织，在胚胎发育中发挥重要作用，诱导细胞移动及组织塑性，而出生后在成熟组织降至低水平。Twist蛋白被认为是癌基因蛋白，影响肿瘤细胞的调亡3。一系列研究发现Twist基因在乳腺癌、肝癌、
4、大肠癌和横纹肌肉瘤等恶性肿瘤中有异常表达3，4，5,，其具有癌基因的特性，能通过多种途径抑制细胞凋亡，是肿瘤转移的必要基因，在肿瘤的形成、发展和转移过程中发挥了重要的作用。然而，国内国外对于Twist在肾癌发生及发展中的作用尚无深入的研究，其分子调控机制也不清楚。二、实验目的二、实验目的通过本实验，探讨Twist在肾癌中的表达情况以及临床病理因素的分析，为肾癌的治疗提供一定理论依据，为肾癌进一步的研究奠定基础。实验资料与方法实验资料与方法组织标本的收集组织标本的收集:(1)所有病例都是随机选择所有病例都是随机选择2010年年9月至月至2011年年12月间在哈尔滨月间在哈尔滨医科大学第一附属医院
5、泌尿外科进行手术切除的患者。医科大学第一附属医院泌尿外科进行手术切除的患者。(2)所有标本都是在手术切除后获得的新鲜标本，标本大小为所有标本都是在手术切除后获得的新鲜标本，标本大小为1.5cmX1.Ocm X 1.Ocm，原发肿瘤组织均取材于肿瘤的纵剖面避免，原发肿瘤组织均取材于肿瘤的纵剖面避免与肿块周围的肾组织混在一起，癌旁正常肾组织取材，远离病变部位与肿块周围的肾组织混在一起，癌旁正常肾组织取材，远离病变部位5cm以上，标本获取后经灭菌用水清洗、无菌纱布沾干水分后立即放以上，标本获取后经灭菌用水清洗、无菌纱布沾干水分后立即放置到液氮容器内暂时保存，之后转移到置到液氮容器内暂时保存，之后转移
6、到-80深低温冰箱中保存，每深低温冰箱中保存，每一个标本的组织学诊断均为病理证实。一个标本的组织学诊断均为病理证实。2.3免疫组化染色免疫组化染色(1)分别对标本进行免疫组化染色，分别记录肾癌组织中以及癌旁正分别对标本进行免疫组化染色，分别记录肾癌组织中以及癌旁正常组织中常组织中Twist表达情况。表达情况。(2)结合临床病理因素分析肾癌中结合临床病理因素分析肾癌中Twist表达与患者的年龄，性别，表达与患者的年龄，性别，肿瘤的分期，肿瘤的分化程度，淋巴结转移的关系肿瘤的分期，肿瘤的分化程度，淋巴结转移的关系实验资料与方法实验资料与方法实验分组及观察指标实验分组及观察指标1.实验组:收集哈尔滨
7、医科大学第一附属医院泌尿外科2010年9月-2011年12月间手术切除的肾癌组织标本58例对照组:哈尔滨医科大学第一附属医院院泌尿外科2010年9月-2011年 12月间手术切除的肾癌标本旁相应的癌旁正常组织2.染色结果的判读染色结果的判读Twist着色位于细胞胞浆中，少部分表达于胞核上22。以肾癌组中细胞胞浆内出现棕黄色颗粒染色视为阳性，按照Lim等报道的法先于100倍低倍镜下选择阳性细胞最密集的5个视野，再用高倍镜观察每个视野100个细胞，最后取5个视野中阳性细胞的平均百分数字作为每张切片的结果。按照国外标准进行评分:阳性细胞数小于25%为(一)，阳性细胞数在25%到50%之间时为弱阳性(
8、+)，阳性细胞数在50%到75%之间时为阳性(+)，阳性细胞数在75%以上为强阳性(+);(+)(+)(+)均定为阳性;以PBS代替一抗作阴性对照。三、统计学方法三、统计学方法本实验采用本实验采用spss13.0统计软件包进行数据统计软件包进行数据分析处理，根据不同的数据类型分别采用分析处理，根据不同的数据类型分别采用Mann-whitneyUTest、卡方检验、水准、卡方检验、水准a均为均为0.05。预期结果预期结果1Twist在肾癌中表达增高，并与肿瘤pTNM分期和远处转移正相关，说明Twist可能对肾癌的发生、发展和远处转移起促进作用。可行性分析:（1）哈尔滨医科大学第一附属医院病理科实
9、验室提供了良好的实验条件和技术支持。（2）本人通过大量的文献查阅，基本掌握了相关的实验技术和方法。（3）据文献报道，Twist在很多上皮肿瘤过表达，与肿瘤的发生、发展、侵袭有关。研究计划2010年7月-2010年9月 查阅文献，设计实验方案2010年9月-2010年12月 准备实验材料，按照实验步骤进行实验2010年12月-2011年1月 整理实验数据，分析实验结果，撰写论文参考文献1Kountouras J，Zavos C，ChatzoPoulos D:Apootosis in hepatocellular careinoma【J.Hepatogastorenteorlogy，2003，50
10、:242一249.2Kouniouras J，Zavos C，ChatzoPoulos D:Apoptotic and antiangiogenic strategiesIn liver and gastrointestinal malignancies【J】.Sursoneol，2005，90(4):249一259.3Maestro R，Dei TosAP，HamamoriY，et al.Twlst is a Potential oncogene thatInhibits apoptosis J.Genes&DeveloPment,1999，13:2207一2217.4Jing yang，S
11、enduraiA，Mani，et al.Twist，a Master Regulatorof Morphogenesis，Plays an Essential Role inTumor MetastasisJ.Cell，2004，117:927一939.5Martin TA，Goya1A，Watkins G，et al.Expression of the transcription factors Snail，slug，and Twist and their clinical significance in human breast cancer【J】.Annsurg Oncol，2005，12:488一496.感谢各位老师指导！