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1、微生物学转录与基因表达调控第一页，讲稿共六十页哦 RNA的生物合成包括两个方面：一是指以DNA为模板合成的RNA，称为转录转录(transcripion)；另一方面是指在某些RNA病毒和高等动物的特定组织中，以RNA为模板进行的RNA的自我复制自我复制。以DNA为模板，按碱基互补配对的方式合成RNA的过程叫转录。体内的RNA，包括mRNA、tRNA、rRNA和SnRNA，均是以DNA为模板，在RNA聚合酶催化下合成的。第二页，讲稿共六十页哦 转录 复制 相 同 都以DNA为模板,合成方向都是53 之 核苷酸之间都以磷酸二酯键相连 处 合成反应都需要依赖DNA的聚合酶 模板 DNA的一条链(模板
2、链)DNA的两条链 不 原料 NTP dNTP 同 配对 A-U,T-A,G-C A-T,G-C 之 聚合酶 RNA聚合酶 DNA聚合酶 处 产物 mRNA,tRNA,rRNA等 子代DNA双链 引物 不需要 需要第三页，讲稿共六十页哦第一节 DNA指导的RNA的合成一、转录的模板 转录以DNA为模板，但不是两条DNA都能作模板。能转录出mRNA，然后指引蛋白质合成的DNA，称为结构基因。其余DNA，可能转录成rRNA或tRNA，也可能是作为基因的调节部位。DNA的两条链中，只有一条可作为转录的模板，能作模板的一条称为模板链(template strand)，又称为负链；相对的一条称为编码链(
3、coding strand)或正链，所以除了以U代替T外，编码链同转录出的RNA的序列是一致的。第四页，讲稿共六十页哦 编码链 5GCATGGAATC3模板链 3CGTACCTTAG5 转录 mRNA 5GCAUGGAAUC3第五页，讲稿共六十页哦 模板链并不固定为DNA中的某一条。当模板链位于同一DNA双链的不同单链时，转录方向就相反，因为转录的方向总是53。所以转录又称为不对称转录。第六页，讲稿共六十页哦 二、RNA聚合酶 RNA聚合酶的全称是依赖DNA的RNA聚合酶(DNA-directed RNA polymerase)，在有Mg2+、4种核苷三磷酸(dNTP)和DNA模板存在时，它能
4、从新催化核苷酸聚合成与模板DNA互补的RNA长链。第七页，讲稿共六十页哦 说明：1.转录过程与DNA的复制相似，是前一个核苷酸核糖的3-OH同核苷三磷酸的-P发生亲核反应，脱下PPi，生成35-磷酸二酯键；2.转录出的第一个核苷酸通常是ATP或GTP，而且PPi会一直保留至转录完成后；3.虽然RNA聚合酶可以从头合成RNA，无需引物，但是是从DNA上称为启动子的特定部位开始的；4.转录部位的模板DNA是解螺旋的，长度有11个核苷酸，转录出的RNA和DNA模板形成一段8个核苷酸长度的RNA-DNA杂和体；第八页，讲稿共六十页哦第九页，讲稿共六十页哦 原核生物的RNA聚合酶 大肠杆菌RNA聚合酶是
5、由核心酶(core enzyme)和因子组成的全酶，核心酶又是由5个亚基组成的2蛋白质。第十页，讲稿共六十页哦E.coliRNA聚合酶的结构示意图聚合酶的结构示意图第十一页，讲稿共六十页哦 亚基 功 能 酶的组装、启动子的识别、结合活性因子 与底物结合及磷酸二酯键的形成 与模板结合 决定起始位点的专一性E.coli RNA聚合酶各亚基的功能聚合酶各亚基的功能第十二页，讲稿共六十页哦 真核生物的RNA聚合酶 种类分布合成的RNA类型A(对-鹅膏蕈碱不敏感)核仁rRNA(5.8S、18S、28S)B(对低浓度-鹅膏蕈碱敏感)核质hnRNA(mRNA的前体)和SnRNAC(对高浓度-鹅膏蕈碱敏感)核
6、质tRNA和5SrRNA真核生物RNA聚合酶的种类和性质第十三页，讲稿共六十页哦三、酶与模板的辨认结合 原核生物的RNA聚合酶靠亚基的识别作用及其他亚基的相互配合，以全酶的形式结合到DNA的启动区上。RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列称为启动子(Promoters)。分析若干原核生物启动区的核苷酸序列后，发现在两个部位，即-10bp区和-35bp区有保守性。第十四页，讲稿共六十页哦E.coli 的几个启动子的序列的几个启动子的序列第十五页，讲稿共六十页哦 即在-35区，有保守序列5-TTGACA-3,它提供了RNA聚合酶的识别信号，所以与起始的辨认有关。-10区有保守序列5-TA
7、TAAT-3,又称为Pribnow box，它与DNA双链的解开有关。保守序列的结构是不对称的，它决定了转录的方向，所以转录也是不对称的。除了-10区和-35区外，在更上游的区域还有被称为UP element 的强启动子，位于-40和-60之间，是RNA聚合酶的-亚基识别的。在-60和-150之间，还有一个Fis site 的区域，是转录起始因子Fis 的结合位点，又称为增强子。第十六页，讲稿共六十页哦 真核生物结构基因的启动子也有三个保守区，分别是：-25bp-30bp的7bp序列，称为TATA框，或Hogness框，此序列几乎全含A-T对，所以与DNA双链的解开和转录的起始位点有关，如果失
8、去该框，转录可以从多个位点上开始；-75bp的9bp的不变序列GGT/CCAATCT，称为CAAT框，它与RNA聚合酶的结合有关；更上游的GGGCGG序列，又称为GC框，它是某些转录因子的结合位点。第十七页，讲稿共六十页哦四、转录的起始(原核生物中)转录过程从RNA聚合酶辨认启动子、结合DNA模板开始。RNA聚合酶以全酶的形式辨认DNA上的启动子，并结合在启动子的-35区域上。第十八页，讲稿共六十页哦 在解链酶和拓扑异构酶等的帮助下，DNA双链在-10区解开，形成转录空泡；第十九页，讲稿共六十页哦 在转录的起始位点上，两个核苷三磷酸靠与模板相配对而直接被RNA聚合酶催化形成磷酸二酯键，第一个核
9、苷三磷酸总是GTP或ATP，它们与第二个核苷三磷酸形成磷酸二酯键，但仍然保持三磷酸的状态（pppA或pppG），作为RNA5端的起始，形成RNA聚合酶全酶-DNA-pppPupN-OH这一转录起始复合物。亚基从转录起始复合物上脱下来，核心酶则继续结合于DNA分子上并沿DNA链向前移动。第二十页，讲稿共六十页哦 五、转录的延长 -亚基脱落后，全酶的构象发生改变，与模板的结合变得更疏松，有利于RNA聚合酶在DNA上向前移动。在移动过程中：RNA聚合酶覆盖着解开的DNA双链和DNA-RNA杂化双链的一部分，形成聚合酶核心酶-DNA-RNA复合物；第二十一页，讲稿共六十页哦 RNA大部分伸出在转录空泡
10、之外，仅保留较短的新合成的RNA链与模板链互补结合，一旦聚合酶经过之后，DNA又重新复合成双螺旋。第二十二页，讲稿共六十页哦 同一DNA分子上，可以有若干个RNA聚合酶同时转录，生成相应的RNA链。第二十三页，讲稿共六十页哦 六、转录的终止 转录的终止是指RNA聚合酶在模板的某一位置(终止子)停顿，RNA链从转录复合物上脱落下来的过程。终止的方式有两种：依赖因子的终止方式：这种方式的DNA模板上，在靠近终止位点处有一段回文序列，转录的RNA可以形成发夹结构。因子附着在新生的RNA链上，向RNA聚合酶移动。当RNA聚合酶在终止位点做短暂停留时，因子就追上聚合酶，ATP的水解酶活性变成解链酶活性，
11、使RNA-DNA杂化短链变性，转录产物从转录复合物中释放出来。第二十四页，讲稿共六十页哦依依 赖赖 因因 子子 的的 转转 录录 终终 止止 方方 式式第二十五页，讲稿共六十页哦 不依赖因子的终止方式：在DNA模板链上，有如下的结构协助转录的终止：靠近终止位点处有富含A-T或G-C的特殊序列；有回文结构；在模板链的终止位点末端有若干连续的AAAAA；转录出的RNA产物在终止子区域能形成径环结构，且3端有连续的UUUUUU。RNA形成径环结构，可以改变RNA聚合酶的构象，导致酶不再往下游移动，转录停顿，还可以使本来不稳定的DNA-RNA杂化结构更不稳定；并且由于rU:dA是所有碱基配对中最不稳定
12、的，所以寡聚U则可以促使RNA新链从模板上脱下来。第二十六页，讲稿共六十页哦第二十七页，讲稿共六十页哦 第二十八页，讲稿共六十页哦 足足迹迹法法可可以以确确定定与与特特定定蛋蛋白白质质结结合合的的DNA的的位位点点和和序序列列。第二十九页，讲稿共六十页哦第三十页，讲稿共六十页哦 RNA聚合酶在启动子上的结合聚合酶在启动子上的结合第三十一页，讲稿共六十页哦 六、转录后的加工 转录生成的RNA称为初级转录产物(primary transcript)，在原核生物和真核生物中都要经过一定程度的加工、修饰，才能成为成熟的RNA，表现其功能，这个过程称为RNA的成熟，或称为转录后加工(Processing
13、)。原核生物和真核生物中tRNA的加工 第三十二页，讲稿共六十页哦 tRNA的加工包括：RNaseP切出成熟的5端；RNaseF从3切断前体分子，再由外切酶RNaseD切出成熟的3端。在核苷酰转移酶催化下，由CTP和ATP提供胞苷酸和腺苷酸，在tRNA-3加上CCA-OH。核苷的修饰 在tRNA甲基化酶的催化下，在特定位置(包括特定的序列)上将碱基甲基化，甲基供体是SAM。在tRNA 假尿苷合成酶催化下，将特定位置上的U由N1-C1变为C5-C1。原核生物和真核生物中tRNA的加工 第三十三页，讲稿共六十页哦splicing第三十四页，讲稿共六十页哦 (二）原核生物和真核生物中rRNA的加工
14、原核生物的每个rRNA基因转录单位由16SrRNA、23SrRNA、5SrRNA和tRNA组成，最初的转录产物是30S，大约有6,500个核苷酸。之后各组分在相应的核酸酶作用下，分别成熟。甲基化主要在碱基上进行。真核细胞的rRNA基因属于高度重复序列DNA，重复序列之间被不能转录的间隔区分隔。不同种类生物的重复单位长度及重复数均不同，但转录出的rRNA的大小却是相同的。甲基化主要在核糖的2-OH上。第三十五页，讲稿共六十页哦原核生物原核生物rRNA的加工过程的加工过程第三十六页，讲稿共六十页哦真核生物真核生物rRNA的转录后加工的转录后加工第三十七页，讲稿共六十页哦 原核生物mRNA的加工 原
15、核生物中的mRNA的转录和翻译没有区间的限制，转录和翻译可以同时进行，所以大多数mRNA不需要加工。而且原核mRNA不稳定，通常只能存在几分钟，随即被从5端开始降解。(三)mRNA的加工第三十八页，讲稿共六十页哦 原核生物的原核生物的mRNA在被转录的同时就可以在被转录的同时就可以做翻译的模板。做翻译的模板。第三十九页，讲稿共六十页哦 2.真核生物mRNA转录后加工 5端的修饰：mRNA 5端的帽子结构是在转录产物的基础上，先于剪接过程而形成的。反应过程是：5 pppG/A-磷酸酶 5 ppG/A-+Pi +pppG 5 G5ppp5G/A-+PPi 甲基化酶 5 m7 G5ppp5G/A-S
16、AM第四十页，讲稿共六十页哦NH2O 型型 和和 型型 帽帽 子子 结结 构构第四十一页，讲稿共六十页哦NH2型帽子结构型帽子结构第四十二页，讲稿共六十页哦 The cap provides:protection of the mRNA;enhancement of the mRNAs translatability;transport of the mRNA out of the nucleus;proper splicing of the pre-mRNA.第四十三页，讲稿共六十页哦 3端的修饰 即在3端加上多聚酰苷酸 polyA tail。转录结束后，先由核酸外切酶切去3过剩的核苷酸，再
17、由多聚酰苷酸聚合酶催化，接上约20-250个腺苷酸组成的polyA。在多聚酰苷酸化位置的上游约1130个核苷酸处有一保守序列AATAAA，之后是一段富含GU的结构，这些被认为是多聚酰苷酸化的识别信号。第四十四页，讲稿共六十页哦 在在mRNA前体上加上多聚腺苷酸的过程前体上加上多聚腺苷酸的过程第四十五页，讲稿共六十页哦 polyA的功能：帮助mRNA从细胞核转移至细胞质；维持 mRNA作为翻译模板的活性，随着polyA的降解，翻译的活性下降。只有极少数真核基因的转录产物无polyA，如组蛋白基因。第四十六页，讲稿共六十页哦 mRNA的剪接 核酸杂交实验证明，mRNA的前体hnRNA能同DNA模板
18、链完全配对，而mRNA同DNA和hnRNA杂交时，都只有部分区域配对，中间有呈泡状突出的区段。第四十七页，讲稿共六十页哦鸡卵清白蛋白基因中的外显子(extron)和内含子(intron)第四十八页，讲稿共六十页哦第四十九页，讲稿共六十页哦 内含子的种类及拼接机制：第一类内含子：存在于细胞核、线粒体和叶绿体中rRNA的前体中；拼接过程中的第一次转酯反应拼接过程中的第一次转酯反应第五十页，讲稿共六十页哦第第 一一 类类 内内 含含 子子 的的 拼拼 接接 过过 程程 (亲核试剂是外界的G)第五十一页，讲稿共六十页哦 第二类内含子：存在于线粒体和叶绿体的mRNA的前体中；(亲核试剂是内含子内部特定位
19、点上的A-2-OH)这两类内含子的拼接过程均无需蛋白质的参与，所以属于“自我拼接(self splicing)”。第五十二页，讲稿共六十页哦 这两类内含子的拼接过程均无需蛋白质的参与，RNA分子本身具有酶的活性，发挥催化拼接的作用，这种由RNA发挥作用的酶称为核酶(ribozyme)，反应的过程属于自我拼接(self splicing)。现已知道，某些病毒、噬菌体RNA，以及RNaseP中的M1RNA、1，4-葡萄糖分支酶中的RNA均有催化功能。rRNA的自我拼接 核酶的发现表明，不仅是蛋白质，RNA也可以是酶，而且核酶大多在古老生物中发现，被认为是生物物种内存在的活化石，对研究生命的起源和进
20、化有重要意义。此外，由于核酶结构的阐明，可以人工合成小片段RNA来破坏病原微生物的RNA或某些不利于人类的基因。第五十三页，讲稿共六十页哦 第五十四页，讲稿共六十页哦 第五十五页，讲稿共六十页哦 第三类内含子：这是最大多数的内含子，存在于细胞核mRNA的前体中，是一类需要snRNA参与的拼接过程。snRNA(核内小RNA)是一类大量存在于真核生物细胞核的一类小RNA，含有106-190个核苷酸，结构具有高度保守性，常与蛋白质结合成“核内小核糖核蛋白体(snRNPs)。其中的U系列都与mRNA的拼接有关。第五十六页，讲稿共六十页哦U系列系列snRNA与内含子的配对情况与内含子的配对情况第五十七页
21、，讲稿共六十页哦U系列系列snRNA参与参与mRNA前体的拼接前体的拼接第五十八页，讲稿共六十页哦 第四类内含子：存在于tRNA中，拼接过程需要ATP,在被核酸内切酶切去内含子后，外显子的3形成2,3 环磷酸。第五十九页，讲稿共六十页哦第二节 RNA生物合成的抑制剂 按照作用性质的不同，RNA生物合成的抑制剂可分为三类：嘌呤和嘧啶的结构类似物 DNA模板功能抑制剂 烷化剂：如氮芥、磺酸酯、氮丙啶等，能使 DNA的碱基(G-N7、A -N1、N3、N7，C -N1）烷基化。烷基化后的碱基易脱落，从而干扰DNA的复制或引起错误碱基的掺入。双功能烷化剂还可以使DNA的两条链发生交链，抑制其模板功能。第六十页，讲稿共六十页哦