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1、微生物次级代谢与调节二1第一页，讲稿共四十九页哦本节内容：n微生物次级代谢与其生命活动的关系微生物次级代谢与其生命活动的关系n细胞生长期和抗生素生产期的相互关系细胞生长期和抗生素生产期的相互关系n次级代谢的调节次级代谢的调节n人工克服微生物次级代谢调控作用的限制人工克服微生物次级代谢调控作用的限制2第二页，讲稿共四十九页哦一 微生物次级代谢与其生命活动的关系1 次级代谢在微生物中所起的作用：n富集营养物质：大肠杆菌在缺铁环境中产生肠道杆菌素，与铁形成络合物，富集铁，供菌体利用。n清除不平衡生长时积累的中间物。n生物竞争。n储存营养、生长调节剂。3第三页，讲稿共四十九页哦2 次级代谢与生长，分化
2、的关系。n细菌次级代谢与分化的关系：芽孢杆菌在生长后期开始形成芽孢和次级代谢物，这些次级代谢物可抑制生长，促进孢子生成。n放线菌次级代谢与分化的关系：抗生素的合成与孢子的形成是受共同控制机制调节的两种过程。灰色链霉菌产孢子能力丧失则链霉素生产能力丧失。n真菌次级代谢与分化的关系：次级代谢物对自然生态的作用、对代谢的调节、对分化的调节。次级代谢是在生长受限的分化期产生。如：顶头孢霉菌节孢子所占百分比与头孢菌素有线性关系。4第四页，讲稿共四十九页哦二二 细胞生长期和抗生素生产期的相互关系细胞生长期和抗生素生产期的相互关系n微生物的生长曲线可分为微生物的生长曲线可分为4个期：延滞期、对数期、稳定个期
3、：延滞期、对数期、稳定期和衰老期。期和衰老期。n抗生素发酵可分为抗生素发酵可分为2个代谢期：生长期（营养期）和生产个代谢期：生长期（营养期）和生产期（抗生素分泌期）。期（抗生素分泌期）。n不少抗菌素只能在生产期产生：链霉素、青霉素、金不少抗菌素只能在生产期产生：链霉素、青霉素、金霉素、红霉素等。也有的生产期和生长期平行：氯霉霉素、红霉素等。也有的生产期和生长期平行：氯霉素素5第五页，讲稿共四十九页哦 在生长期，微生物按一定比例吸收和利用主要营养物质而快速在生长期，微生物按一定比例吸收和利用主要营养物质而快速生长。生长。生长期结束时，一种主要营养物质（如生长期结束时，一种主要营养物质（如P，N或
4、或S）可能消耗）可能消耗殆尽或降低到一定程度，成为限制因素，使菌体的生长速度殆尽或降低到一定程度，成为限制因素，使菌体的生长速度减慢或保持平衡状态，转入生产期。减慢或保持平衡状态，转入生产期。生长期中负责抗生素合成的酶处于被阻遏的状态，如链霉素生长期中负责抗生素合成的酶处于被阻遏的状态，如链霉素生物合成中的转脒基酶，青霉素生物合成中的酰基转移酶和生物合成中的转脒基酶，青霉素生物合成中的酰基转移酶和苯乙酸活化酶。苯乙酸活化酶。一旦菌体生长接近生长末期，解除对相关酶的阻遏。一旦菌体生长接近生长末期，解除对相关酶的阻遏。6第六页，讲稿共四十九页哦n为什么抗生素发酵明显分为两个阶段？n为什么生长期负责
5、抗生素合成的酶受到阻遏？n由生长期过渡到生产期的因素是什么？从微生物的遗传控制来看，可根据操纵子学说和代谢调节机制来探讨。7第七页，讲稿共四十九页哦抗生素合成酶在生长期中被阻遏的可能机制：抗生素合成酶在生长期中被阻遏的可能机制：（1）阻遏蛋白有两个位点，分别与操纵基因和诱导物结）阻遏蛋白有两个位点，分别与操纵基因和诱导物结合。诱导物结合后，阻遏蛋白就发生变构，不能与操合。诱导物结合后，阻遏蛋白就发生变构，不能与操纵基因结合，结构酶解除阻遏，能够合成。纵基因结合，结构酶解除阻遏，能够合成。n 生长期中诱导物尚未积累，抗生素合成酶处于被阻遏生长期中诱导物尚未积累，抗生素合成酶处于被阻遏状态。状态。
6、n生长末期，菌体代谢的变化使诱导物积累或外源加入诱导物，生长末期，菌体代谢的变化使诱导物积累或外源加入诱导物，解除阻遏，从而合成抗生素。解除阻遏，从而合成抗生素。8第八页，讲稿共四十九页哦（2）在生长期中，产生了易利用碳源的分解物，这些产物对生产期的基因产生分解代谢产物阻遏。例如：葡萄糖的分解代谢产物能阻遏合成放线菌素D的关键酶-吩噁嗪酮合成酶。当葡萄糖耗尽时，该酶才合成。9第九页，讲稿共四十九页哦（3）初级代谢终产物对次级代谢产生反馈阻遏作用，当这种终产物耗尽时，生产期的结构基因的受阻遏状态才被解除。（4）抗生素合成途径受高能化合物的阻遏作用。当ATP量减少后，阻遏作用被解除10第十页，讲稿
7、共四十九页哦（5）生长期RNA聚合酶只能启动生长期基因的转录作用，不能附着在操纵生产期的启动基因上，结果次级代谢 产物的合成酶基因受阻遏。菌体停止生长后，酶的结构发生改变，允许RNA聚合酶启动生产期基因的转录作用。11第十一页，讲稿共四十九页哦 从抗生素工业生产的角度看，为了搞清楚抗生素生物合成的控制机制，需要回答以下几个基本问题：n参与抗生素生物合成的酶什么时候出现？其合成如何控制？参与抗生素生物合成的酶什么时候出现？其合成如何控制？n供给抗生素生物合成的前体物质是从哪些初级代谢活动中得到供给抗生素生物合成的前体物质是从哪些初级代谢活动中得到？n上述两种系统如何协调以保证抗生素合成高效进行？
8、上述两种系统如何协调以保证抗生素合成高效进行？三三 次级代谢生物合成的调节与控制次级代谢生物合成的调节与控制12第十二页，讲稿共四十九页哦n酶的诱导及解除阻遏；酶的诱导及解除阻遏；n抗生素生物合成启动的控制；抗生素生物合成启动的控制；n碳源分解代谢产物调节；碳源分解代谢产物调节；n氮源分解代谢产物调节；氮源分解代谢产物调节；n磷酸盐的调节；磷酸盐的调节；n反馈调节；反馈调节；n细胞膜透性的调节；细胞膜透性的调节；n抗生素生物合成的终止。抗生素生物合成的终止。13第十三页，讲稿共四十九页哦1 参与抗生素合成的酶的诱导及解除阻遏：参与抗生素合成的酶的诱导及解除阻遏：n很多参与抗生素合成的酶由诱导作
9、用产生：诱导酶需要诱导物存在才能形成，如：甘露糖链诱导酶需要诱导物存在才能形成，如：甘露糖链霉素酶的形成需要霉素酶的形成需要-甲基甘露糖苷、甘露聚糖等诱导；甲基甘露糖苷、甘露聚糖等诱导；6-氨基氨基-葡萄糖葡萄糖-2-去氧链酶胺是卡那霉素生物合成中卡去氧链酶胺是卡那霉素生物合成中卡那霉素乙酰转移酶的诱导物。那霉素乙酰转移酶的诱导物。具有诱导作用的物质只有在菌体生长末期加入才有诱具有诱导作用的物质只有在菌体生长末期加入才有诱导作用，在菌的旺盛生长期加入不起作用，说明酶的诱导导作用，在菌的旺盛生长期加入不起作用，说明酶的诱导与生长速率有关。与生长速率有关。14第十四页，讲稿共四十九页哦为什么酶的诱
10、导与生长速率有关？为什么酶的诱导与生长速率有关？n微生物生长速率的降低证明微生物的生长受到了外界环境微生物生长速率的降低证明微生物的生长受到了外界环境条件（多为营养条件）限制，初级代谢活动不能平衡进条件（多为营养条件）限制，初级代谢活动不能平衡进行，造成中间产物的积累，诱导了次级代谢合成酶的合行，造成中间产物的积累，诱导了次级代谢合成酶的合成。成。n生长速率降低，可能使已合成的生物大分子转化作用加强，生长速率降低，可能使已合成的生物大分子转化作用加强，造成具有诱导作用的低分子物质的浓度升高而产生作用。造成具有诱导作用的低分子物质的浓度升高而产生作用。15第十五页，讲稿共四十九页哦2 抗生素生物
11、合成启动的控制（1）抗生素生物合成酶的阻遏：研究表明，抗生素合成酶出现较晚，这种基因表达的控制可通过干扰DNA转录和RNA翻译的方式进行，但不清楚阻遏控制是在哪一级别上进行。对于杀念珠菌素和杆菌肽，合成酶的阻遏发生在转录水平上。16第十六页，讲稿共四十九页哦R：阻遏基因阻遏基因P：启动基因启动基因O：操纵基因操纵基因S：结构基因结构基因E：酶酶17第十七页，讲稿共四十九页哦n（2）抗生素合成出现的较晚 其原因可能是某种因素对细胞中已合成的酶有抑制作用。例如：头霉素产生的-内酰胺抗生素（青霉素N和头孢菌素C）主要是在菌丝体生长完成后才合成，但研究表明生长期的菌丝体已含有活性很高的-内酰胺合成酶。
12、18第十八页，讲稿共四十九页哦n（3）初级代谢的末端代谢产物反馈抑制作用 生长期结束时，胞内的初级代谢中间物或末端产物对次级代谢产物合成酶产生诱导作用，从而启动次级代谢，避免了初级代谢产物的积累，解除了积累物的反馈抑制作用。如：培养基中赖氨酸过量会抑制柠檬酸合成酶，进而关闭了-氨基己二酸的合成途径，使青霉素合成受到抑制。19第十九页，讲稿共四十九页哦加入的前体物质不能促进次级代谢进行的原因：n前体物质不能被吸收或者不能到达次级代谢产物合成的部位。n添加物对细胞本身的合成产生反馈抑制作用，而且不是次级代谢合成所需的直接前体。n添加的前体不是次级代谢产物合成中起限制作用的物质。n其他机制：分解代谢
13、物阻遏，激活因子的合成。20第二十页，讲稿共四十九页哦次级代谢物启动的假想机制次级代谢物启动的假想机制 图图4-37n比生长速率（比生长速率（）下降）下降n限制性养分的耗竭限制性养分的耗竭n几种调节因子的联合作用（几种调节因子的联合作用（cAMP,碳源，碳源，氮源，或磷源的同化速率氮源，或磷源的同化速率)n严谨响应严谨响应(strigent response)n微生物信号因子微生物信号因子21第二十一页，讲稿共四十九页哦3 碳源分解代谢产物调节碳源分解代谢产物调节n碳分解代谢产物调节分为分解产物阻遏和分解产物抑制两种。n分解产物的调节机制至今尚不完全清楚（在E.coli中与cAMP有关），可能
14、与具有调节作用的底物的代谢速率有关。22第二十二页，讲稿共四十九页哦n在抗生素的生物合成中这两种调节方式都是存在的。n葡萄糖对放线菌素、嘌呤霉素的合成产生分解产物阻遏作用；n葡萄糖对青霉素、新霉素合成的影响可能是由于葡萄糖的分解产物抑制作用。23第二十三页，讲稿共四十九页哦抗生素抗生素产生菌产生菌抗生素抗生素产生菌产生菌放线菌素杆菌肽头孢菌素氯霉素链霉菌地衣型芽孢杆菌丁头霉菌委内瑞拉链霉菌卡那霉素丝裂霉素链霉素青霉素卡那霉素链霉菌头状链霉菌灰色链霉菌产黄青霉受葡萄糖抑制的抗生素生产受葡萄糖抑制的抗生素生产24第二十四页，讲稿共四十九页哦n如何防止碳源对抗生素生产的阻遏和抑制作用？25第二十五页
15、，讲稿共四十九页哦4 氮源分解代谢产物调节氮源分解代谢产物调节n（1）氮源与抗生素的合成有些抗生素的合成受氨和其他能被迅速利用的氮源的阻遏。有些抗生素的合成受氨和其他能被迅速利用的氮源的阻遏。例如：红霉素的合成在氮受限制的情况下可一直进行到发酵液中的氮源耗竭为止。如在生产中添加利用的氮源，红霉素的合成会立即停止。因此抗生素发酵宜选用较难消化的氮源。黄豆饼粉降解成氨基酸或氨的速度很慢，不至于抑制抗生素的合成，因此常作为抗生素工业发酵的氮源。26第二十六页，讲稿共四十九页哦n（2）抗生素分子中的氮原子的来源。n直接前体 氨基酸、嘌呤和嘧啶的代谢过程为抗生素的生物合氨基酸、嘌呤和嘧啶的代谢过程为抗生
16、素的生物合成提供含氮前体。成提供含氮前体。n氮转移反应氮转移反应 氨基糖苷类抗生素的生物合成包括多步氮转氨基糖苷类抗生素的生物合成包括多步氮转移反应，包括转氨基，转脒基，转氨甲酰基等。如这些抗生素移反应，包括转氨基，转脒基，转氨甲酰基等。如这些抗生素合成酶受氮源阻遏，须补加适当浓度的氨基或脒基供体（如合成酶受氮源阻遏，须补加适当浓度的氨基或脒基供体（如Gln，Ala，Glu，Arg等）等）27第二十七页，讲稿共四十九页哦丝裂霉素C的生物合成PEP+E-4-P由莽由莽草酸途径合成草酸途径合成PEP：磷酸烯醇式丙酮酸：磷酸烯醇式丙酮酸E-4-P：赤藓糖：赤藓糖-4-磷酸磷酸 与与D-葡萄糖葡萄糖胺
17、有关胺有关精氨酸瓜氨酸28第二十八页，讲稿共四十九页哦（3）初级氮代谢物及氨盐的调节 某些氨基酸除了直接参与生长和作为次级代谢产物的前体外，还有调节次级代谢物合成的功能。例如：色氨酸可诱导麦角生物碱生物合成酶二甲烯基丙基色氨酸合成酶的合成，增加该酶的活力；诺尔思链霉菌谷胺酰胺合成酶受到高浓度铵离子的阻遏。29第二十九页，讲稿共四十九页哦5 磷酸盐的调节 磷酸盐不仅是菌体生长的主要限制性营养成分，还是调节抗生素生物合成的重要参数。表现在：过量磷酸盐对四环类、氨基糖苷类和多烯大环内酯类等过量磷酸盐对四环类、氨基糖苷类和多烯大环内酯类等32种抗生素的生物合成产生抑制作用。种抗生素的生物合成产生抑制作
18、用。工业生产中常需控制在亚适量。当磷酸盐工业生产中常需控制在亚适量。当磷酸盐0.3300mmol/L时明显促进菌体生长；浓度为时明显促进菌体生长；浓度为10mmol/L或大于或大于10mmol/L时对许多抗生素的合成产生抑制。时对许多抗生素的合成产生抑制。30第三十页，讲稿共四十九页哦磷酸盐的调节作用归纳如下：1)无机磷促进初级代谢，抑制次级代谢 无机磷过量，葡萄糖代谢速率加快，胞内DNA，RNA和蛋白质的量增加，呼吸速率上升，次级代谢的合成受阻，或使其生物合成马上停止。2)无机磷对比生长速率、产物合成速率的影响生二素链霉菌的螺旋霉素生产能力受其生长速率的影响，而生长速率又取决于初磷浓度。螺旋
19、霉素的比生长速率随初磷浓度升高，与比生产速率成反比。31第三十一页，讲稿共四十九页哦3)无机磷与糖分解代谢途径的影响 无机磷浓度增加时磷酸戊糖途径的代谢活性降低，而酵解途径活性增加。HMP途径提供NADH2或前体不足，会影响次级代谢产物合成。4)磷限制次级代谢产物合成的诱导物的合成磷通过抑制麦角碱生物合成的诱导物色氨酸来抑制麦角碱的生物合成，其原因是高浓度的磷抑制HMP途径，使色氨酸生成减少。32第三十二页，讲稿共四十九页哦5)过量磷抑制次级代谢产物的前体的生成6)磷抑制或阻遏次级代谢产物合成所必需的磷酸酯酶 链霉素、新霉素、紫霉素等的合成途径中中间物均为磷酸化物，需要磷酸酯酶的参加，该酶受到
20、磷酸的抑制或阻遏。33第三十三页，讲稿共四十九页哦n分解代谢产物对次级代谢产物合成的胞内控制因子34第三十四页，讲稿共四十九页哦6 反馈调节n抗生素的生物合成途径中，反馈调节起着重抗生素的生物合成途径中，反馈调节起着重要作用要作用抗生素本身的积累起反馈调节作用。抗生素本身的积累起反馈调节作用。如：青霉素，氯霉素如：青霉素，氯霉素抗生素的前体是初级代谢产物时，初级代谢抗生素的前体是初级代谢产物时，初级代谢产物的形成受到反馈调节，会影响抗生素的产物的形成受到反馈调节，会影响抗生素的形成。形成。如：青霉素前体物是缬氨酸，缬氨酸的合成受到的反馈调节就会如：青霉素前体物是缬氨酸，缬氨酸的合成受到的反馈调
21、节就会影响青霉素的合成影响青霉素的合成35第三十五页，讲稿共四十九页哦初级与次级代谢间存在分叉中间体，由交叉初级与次级代谢间存在分叉中间体，由交叉中间体产生的初级代谢终产物的反馈调节可中间体产生的初级代谢终产物的反馈调节可影响次级代谢产物的形成。影响次级代谢产物的形成。分叉中间体分叉中间体：代谢中间体既可以用来合成初级代谢产：代谢中间体既可以用来合成初级代谢产物，又可以用来合成次级代谢产物，把这部分中间物，又可以用来合成次级代谢产物，把这部分中间体叫作分叉中间体体叫作分叉中间体 丙二酰丙二酰CoA既可以在初级代谢中合成脂肪酸，也可以经缩合，既可以在初级代谢中合成脂肪酸，也可以经缩合，环化或闭环
22、生成四环素类或其他类抗生素。环化或闭环生成四环素类或其他类抗生素。分叉中间体主要有：莽草酸，乙酰分叉中间体主要有：莽草酸，乙酰CoA和和-氨基己二酸氨基己二酸 如青霉素合成中赖氨酸的反馈抑制。如青霉素合成中赖氨酸的反馈抑制。Lys抑制青霉素前体之一的抑制青霉素前体之一的a-氨基己二酸的合成途径的酶的活性或酶量。氨基己二酸的合成途径的酶的活性或酶量。36第三十六页，讲稿共四十九页哦7 细胞膜透性的调节n细胞膜透性的调节是代谢调节的一个重要方面细胞膜透性的调节是代谢调节的一个重要方面n在青霉素发酵中，产生菌细胞膜输入硫化物能力的大小是影响青霉素发酵单位高低的一个因素，因为菌体需要足够的硫源来合成青
23、霉素，如输入硫化物的能力增大，硫源供应充足，合成青霉素的量就增多。n诱变获得的青霉素高产菌中，有的就是因为提高了膜摄取无机硫酸盐的浓度。37第三十七页，讲稿共四十九页哦8 抗生素生物合成的终止n抗生素生产周期取决于产生菌的遗传特性和环境条件。在抗生素合成酶形成后抗生素生物合成的速率在一定时间里直线上升。但不同菌种维持时间不同，抗生素合成的终止有以下机制：38第三十八页，讲稿共四十九页哦（1）抗生素合成酶的不可逆衰退 多肽类抗生素合成酶的活力在抗生素生产开始后几小时就开始下降，其机制尚不清楚，短杆菌肽S合成酶失活的机制可能是：n酶被蛋白水解酶分解为大小不同的两个亚单位。n酶的失活与氧有关，氧使酶
24、的巯基氧化钝化。通入氮可除去氧防止酶失活，指数期供给大量氧而后期维持适当水平也有利于抗生素生成。39第三十九页，讲稿共四十九页哦（2）受自身合成的抗生素反馈调节 已证实氯霉素、环己酰亚胺、嘌呤霉素、制霉菌素、霉酚酸和青霉素等抑制自身的生物合成。一产生菌的抗生素抑制其生物合成的程度一般与该菌株的生产能力有关。40第四十页，讲稿共四十九页哦定向抗生素生物合成n定向抗生素生物合成有多种可行的办法。用于制备新的和分子结构发生变化的抗生素的主要方法有：n1)抗生素产生菌的突变作用；n2)简单使用非天然前体；n3)在生物合成的各步骤中使用抑制剂或诱导物；n4)用生物合成途径的某一或多步骤受阻的阻断型突变株
25、，或加入非天然的前体进行诱变合成或突变生物合成；P20241第四十一页，讲稿共四十九页哦定向抗生素生物合成n5)在生物合成中用独特的基质和培养基；n6)利用嗜高渗等嗜极端环境条件的微生物作为抗生素生产菌株，也可以考虑采用厌氧微生物或发酵周期很长的微生物进行生产；42第四十二页，讲稿共四十九页哦定向抗生素生物合成n7)通过另一种微生物产生的酶或分离出的酶改造代谢产物；n8)混合培养发酵有时能提供结构更复杂的代谢产物；n9)基因操纵。43第四十三页，讲稿共四十九页哦四四 人工克服微生物次级代谢调控作用的限制人工克服微生物次级代谢调控作用的限制n改进发酵条件改进发酵条件：添加诱导物，控制磷的含量，控
26、制葡萄糖的浓度等。n诱变育种诱变育种：回复突变解除反馈调节，抗结构类似物突变株。n基因工程在提高生产性能上的应用：基因工程在提高生产性能上的应用：强化网络调强化网络调控机构；改变表达体系；扩增抗生素产生菌的抗性基因；提高编码控机构；改变表达体系；扩增抗生素产生菌的抗性基因；提高编码关键酶的基因剂量；提高转译水平的表达效率；增强重组菌的生长关键酶的基因剂量；提高转译水平的表达效率；增强重组菌的生长能力；调节性启动子。能力；调节性启动子。44第四十四页，讲稿共四十九页哦1 强化网络调控机构n途径特定调控基因:基因产物为途径特异的激活蛋白，如使其在对数生长期表达，可使抗生素合成提前。如放线紫红素调节
27、基因：act-ORF4。n多效调控基因：多种基因的协调作用。如：天蓝色链霉菌的基因：afsR、afsB和bldA之间的协调作用。n强化中间体的表达：波赛链霉菌转入dnrR1和dnrR2多拷贝质粒，可使柔红霉素中间体紫红霉酮大量增加。基因工程在提高生产性能上的应用：基因工程在提高生产性能上的应用：45第四十五页，讲稿共四十九页哦2 改变表达体系n引入全部结构基因的克隆：将结构基因克隆，导入生产菌表达。如：将酚霉素（肽类抗生素，含89个L-氨基酸）的结构基因PHM插入质粒中，转化大肠杆菌，可使产量提高。n引入通用调节基因：通用调节基因可以调控多种抗生素的生物合成。如变铅青链霉菌调节基因afsR2可
28、以诱导变铅青链霉菌和天蓝色链霉菌的两种结构不相干的抗生素放线紫红素和十一烷基灵杆菌素的生物合成。将afsR2引入S.avermitilis菌可促进阿凡曼菌素生产。46第四十六页，讲稿共四十九页哦3 扩增抗生素产生菌的抗性基因n提高菌种对其自身抗生素的耐受能力是高产的先决条件。如使卡那霉素链霉菌编码乙酰基转移酶的基因在卡那霉素链霉菌中表达可使卡那霉素产量比野生型提高4.5倍47第四十七页，讲稿共四十九页哦4 提高编码关键酶的基因剂量n通过定点诱变或增加基因剂量有可能提高关键酶的活性，从而提高产物的表达量。乙酰氧头孢菌素C合成酶是抗生素合成的限制步骤，克隆该酶的基因cefCF并转化到头孢霉中可使头孢菌素C产量提高25。48第四十八页，讲稿共四十九页哦5 提高转译水平的表达效率n重组头孢菌素C的脱乙酰基酶（CAH）基因翻译速率与Shine-Dalgarno（SD）序列和ATG启动子的间隔有关系，13个核苷酸距离翻译速率最快，构建这种质粒可使酶大量表达。49第四十九页，讲稿共四十九页哦