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1、关于荧光检测原理第1页，讲稿共49张，创作于星期三荧光荧光PCRPCR？荧光标记扩增产物荧光标记扩增产物动态监测荧光信号变化动态监测荧光信号变化第2页，讲稿共49张，创作于星期三荧荧 光光 染染 料料光能光能光能光能热能热能热能热能转移给临近的分子转移给临近的分子转移给临近的分子转移给临近的分子第3页，讲稿共49张，创作于星期三 荧光标记信号的产生荧光标记信号的产生 荧光标记基团在某波长的激发光刺激下，荧光标记基团在某波长的激发光刺激下，产生一个更长波长的发射光产生一个更长波长的发射光产生一个更长波长的发射光产生一个更长波长的发射光第4页，讲稿共49张，创作于星期三荧光荧光信号信号 荧光染料直
2、接结合扩增产物荧光染料直接结合扩增产物荧光染料直接结合扩增产物荧光染料直接结合扩增产物SYBR green ISYBR green ISYBR green ISYBR green I特异性结合双链，释放荧光信号特异性结合双链，释放荧光信号特异性结合双链，释放荧光信号特异性结合双链，释放荧光信号 荧光标记引物荧光标记引物荧光标记引物荧光标记引物 特异性荧光探针特异性荧光探针特异性荧光探针特异性荧光探针TaqmanTaqmanTaqmanTaqman双荧光标记探针双荧光标记探针双荧光标记探针双荧光标记探针molecular Beaconmolecular Beaconmolecular Beaco
3、nmolecular Beacon荧光标记探针荧光标记探针荧光标记探针荧光标记探针荧光标记杂交双探针荧光标记杂交双探针荧光标记杂交双探针荧光标记杂交双探针第5页，讲稿共49张，创作于星期三SYBRGREENISYBRGREENI第6页，讲稿共49张，创作于星期三 FRET？当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高重叠，且两个基团距离足够近
4、时，能量可以从短波长（高重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移这个过程称为荧光共振能量转移这个过程称为荧光共振能量转移这个过程称为荧光共振能量转移(FRET),(FRET),(FRET),(FRET),实际相当于将短波长实际相当于将短波长实际相当于将短波长实际相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽。荧光基团释放的荧光屏蔽。荧光基团释放的荧光屏蔽。荧光基团释放的
5、荧光屏蔽。第7页，讲稿共49张，创作于星期三TaqmanTaqman？特异性荧光特异性荧光双标记探针双标记探针Taq酶酶 5353外外切酶活性切酶活性第8页，讲稿共49张，创作于星期三Molecular beacon？第9页，讲稿共49张，创作于星期三荧光标记杂交双探针荧光标记杂交双探针变性变性变性变性退火退火退火退火延伸延伸延伸延伸第10页，讲稿共49张，创作于星期三C CT T T T值值值值样本扩增曲线与阈值线交叉点的循环数样本扩增曲线与阈值线交叉点的循环数样本扩增曲线与阈值线交叉点的循环数样本扩增曲线与阈值线交叉点的循环数第11页，讲稿共49张，创作于星期三对数期分析与终点分析的比较对
6、数期分析与终点分析的比较对数期分析与终点分析的比较对数期分析与终点分析的比较第12页，讲稿共49张，创作于星期三荧光荧光PCRPCR重现性重现性重现性重现性第13页，讲稿共49张，创作于星期三标准曲线标准曲线定量定量第14页，讲稿共49张，创作于星期三荧光PCR特点l灵敏度高灵敏度高l特异性强特异性强l全封闭全封闭PCRPCR过程，无需后处理过程，无需后处理l采用采用dUTPdUTPUNGUNG酶的防污染系统，有效降低污染机会酶的防污染系统，有效降低污染机会l即时反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量即时反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量l定量范围宽，可达到定量范围宽，可达到1010个
7、数量级，无须稀释样品个数量级，无须稀释样品l可实现一管多检可实现一管多检l仪器自动分析，更快获得结果仪器自动分析，更快获得结果第15页，讲稿共49张，创作于星期三PCRPCRPCRPCR荧光荧光荧光荧光双检多检试剂双检多检试剂双检多检试剂双检多检试剂第16页，讲稿共49张，创作于星期三荧光双检多检检测试剂荧光双检多检检测试剂原理原理 针对同种样本，不同的引物分别扩增不同的靶针对同种样本，不同的引物分别扩增不同的靶DNADNA，并分别被不同的特异性探针所识别，通过探针的不，并分别被不同的特异性探针所识别，通过探针的不同荧光标记实现区分。同荧光标记实现区分。特点特点一次性处理样品一次性处理样品一次
8、性反应一次性反应一次性给出一次性给出2 2种或种或2 2种以上病原体检测结果种以上病原体检测结果两套或两套以上扩增体系相互无信号干扰两套或两套以上扩增体系相互无信号干扰第17页，讲稿共49张，创作于星期三竞争性荧光内标竞争性荧光内标竞争性荧光内标竞争性荧光内标(IC)(IC)定量定量定量定量PCRPCR技术技术技术技术第18页，讲稿共49张，创作于星期三竞争性荧光内标竞争性荧光内标竞争性荧光内标竞争性荧光内标(IC)(IC)什么是什么是什么是什么是IC?IC?IC?IC?Internal Internal controlcontrol简简称称ICIC，通通常常是是指指与与靶靶序序列列十十分分相
9、相似似的的一一段段DNADNA序序列列，两两者者在在相相同同的的条条件件下下可可被被同同一一对对引引物物扩扩增增，具具有有相相同同的的扩扩增增效效率率；区区别别在在于于两两者者的的探探针针结结合合区区，可可分分别别被被不不同同序序列列的的探探针针识识别别，通通过过探探针针的的不不同同荧荧光光标标记记实现区分。实现区分。ICICICIC的作用的作用的作用的作用 监监控控PCRPCR反反应应，避避免免样样本本抑抑制制物物、DNADNA（RNARNA）提提取取过过程程的的丢丢失失、误误操操作作等等造造成成的的假假阴阴性性结结果果；并并对对以以上上原原因因造造成成的的定定量误差进行修正。量误差进行修正
10、。第19页，讲稿共49张，创作于星期三内标工作原理图内标工作原理图内标工作原理图内标工作原理图第20页，讲稿共49张，创作于星期三荧光定量荧光定量PCR的临床应用的临床应用 早期诊断早期诊断早期诊断早期诊断 病情评估和预后判断病情评估和预后判断病情评估和预后判断病情评估和预后判断 抗病毒药物疗效的观察、指导抗病毒药物疗效的观察、指导抗病毒药物疗效的观察、指导抗病毒药物疗效的观察、指导 新药验证新药验证新药验证新药验证 输血源的筛选输血源的筛选输血源的筛选输血源的筛选 母婴传播的控制与观察母婴传播的控制与观察母婴传播的控制与观察母婴传播的控制与观察 遗传疾病的诊断遗传疾病的诊断遗传疾病的诊断遗传
11、疾病的诊断 肿瘤的诊断肿瘤的诊断肿瘤的诊断肿瘤的诊断第21页，讲稿共49张，创作于星期三疾病的早期诊断疾病的早期诊断免疫学诊断主要是抗原抗体反应，应用于临床通常在体内产免疫学诊断主要是抗原抗体反应，应用于临床通常在体内产生抗体以后，而许多病原体的免疫学检测存在较长的生抗体以后，而许多病原体的免疫学检测存在较长的“窗口窗口期期”，比如，比如HCVHCV的的“窗口期窗口期”平均长达平均长达7070天，不利于对疾病天，不利于对疾病的早期诊断；的早期诊断；PCRPCR方法直接检测病原体的方法直接检测病原体的DNA/RNADNA/RNA，能大大缩，能大大缩短短“窗口期窗口期”，其，其高灵敏度的检测高灵敏
12、度的检测显然也有利于疾病的早期显然也有利于疾病的早期诊断诊断。第22页，讲稿共49张，创作于星期三病毒感染窗口期的病毒感染窗口期的病毒感染窗口期的病毒感染窗口期的NATNAT检测检测检测检测第23页，讲稿共49张，创作于星期三病情评估和预后判断病情评估和预后判断通过定量检测病毒滴度可以间接评估受侵器官或组织的炎症发生程度以及是否发生病变；长时间机体病毒高水平的患者尤其是慢性病患者往往预后不好。因此对病原体的定量PCR检测对病情和预后评估均有参考意义。第24页，讲稿共49张，创作于星期三对病毒感染的药物治疗中，免疫学指标的变化通常比较滞后出现，且受个体差异影响较大，从而对临床判断难以及时提供直接
13、证据；而荧光定量PCR检测可直接反映病原体滴度是否受药物治疗发生变化，从而为药物疗效观察提供直接依据，以供治疗方案参考。同时对不同治疗时间的用药剂量和用药时间提供依据。抗病毒药物疗效的观察、指导抗病毒药物疗效的观察、指导第25页，讲稿共49张，创作于星期三ALTAnti-HBsMonths after Start of Therapy0Normal AltBeforetherapy1234561224 DNAHBe AgHBs AgSustained Response to IFN TherapySustained Response to IFN Therapy*Hoofnagel paper
14、*Hoofnagel paperCHRONIC HEPATITIS B 第26页，讲稿共49张，创作于星期三CHRONIC HEPATITIS B ALTMonths after Start of Therapy0Normal Alt治疗前治疗前1234561224HBV DNAHBe AgHBs AgPoor Response to IFN TherapyPoor Response to IFN Therapy第27页，讲稿共49张，创作于星期三 不同剂量IFN-a 单次给药后HCV-1型病人 病毒滴度变化的定量监测（N=32）Lam et al-Hepatol 26:226,1997Bas
15、eline24 hours48 hoursgenomes/ml x1million0246810121410 MIU5 MIU3 MIU第28页，讲稿共49张，创作于星期三新药验证新药验证 任何一种抗病毒药物，以免疫标志物来评价其疗效均任何一种抗病毒药物，以免疫标志物来评价其疗效均任何一种抗病毒药物，以免疫标志物来评价其疗效均任何一种抗病毒药物，以免疫标志物来评价其疗效均不够敏感和及时，若以病毒复制的被抑制程度，即病毒基因不够敏感和及时，若以病毒复制的被抑制程度，即病毒基因不够敏感和及时，若以病毒复制的被抑制程度，即病毒基因不够敏感和及时，若以病毒复制的被抑制程度，即病毒基因水平的高低和动态变
16、化来评价疗效，则较为直接和理想。水平的高低和动态变化来评价疗效，则较为直接和理想。水平的高低和动态变化来评价疗效，则较为直接和理想。水平的高低和动态变化来评价疗效，则较为直接和理想。第29页，讲稿共49张，创作于星期三拉米夫定抑制血清拉米夫定抑制血清HBV DHA0-20-40-60-80-100治疗周数拉米夫定安慰剂血清HBV DNA;中位%变化0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52n=192n=404n=171n=359III期临床研究的综合数据第30页，讲稿共49张，创作于星期三遗传疾病的早期诊断遗传疾病的早期诊断荧光PCR可实现对点突变、缺失突变、
17、插入突变、多基因突变等的检测。对产前诊断具有其他方法不可比拟的优势，有利于优生优育，提高人口素质。第31页，讲稿共49张，创作于星期三突变检测原理突变检测原理 锚探针 突变探针突变探针Tm值较锚探针低5不完全配对完全配对第32页，讲稿共49张，创作于星期三突变检测原理突变检测原理不完全配对完全配对温度低中高第33页，讲稿共49张，创作于星期三Factor V 点突变检测第34页，讲稿共49张，创作于星期三ForwardPrimerReversePrimerDNACGCCGCLC Red 640 LC Red 705 扩增子扩增子Hybprobe Pair 1Hybprobe Pair 2双点突
18、变的检测原理双点突变的检测原理第35页，讲稿共49张，创作于星期三双位点双色检测Without cccWith cccMut 1+Mut 2WT1+WT2Het 1+Het 2H20F2F3第36页，讲稿共49张，创作于星期三母婴传播的监控母婴传播的监控 荧光PCRPCR可对病原体的母婴传播进行有效的监控，可对病原体的母婴传播进行有效的监控，为确定宫内感染、围产期感染或哺乳期感染等提供依为确定宫内感染、围产期感染或哺乳期感染等提供依据，为母婴传播的阻断等提供参考。据，为母婴传播的阻断等提供参考。第37页，讲稿共49张，创作于星期三肿瘤的诊断肿瘤的诊断荧光PCR的作用：可对原癌基因的突变和易位等
19、作出检测。可对原癌基因的mRNA进行定量分析。有利于肿瘤的早期诊断，甚至癌前诊断。探索癌变发生机理的研究提供参考。区别肿瘤的良性和恶性以及炎症反应。第38页，讲稿共49张，创作于星期三荧光PCR在血液筛查中的应用第39页，讲稿共49张，创作于星期三NAT(Nucleic Acid Amplification Testing)NAT应用于血液筛查的意义应用于血液筛查的意义血液筛查现状血液筛查现状筛查方法：免疫学筛查方法：免疫学输血危险性来源：输血危险性来源：窗口期献血，病毒变异，非典型免疫应答和实验室检测的失误窗口期献血，病毒变异，非典型免疫应答和实验室检测的失误NAT可显著缩短窗口期，提高输血
20、安全性可显著缩短窗口期，提高输血安全性HBV：缩短6-15天HCV：缩短41-60天HIV：缩短10-15天第40页，讲稿共49张，创作于星期三急性感染时期急性感染时期急性感染时期急性感染时期HIVHIV的标志物的标志物的标志物的标志物第41页，讲稿共49张，创作于星期三急性感染时期急性感染时期急性感染时期急性感染时期HCVHCV的标志物的标志物的标志物的标志物第42页，讲稿共49张，创作于星期三急性感染时期急性感染时期急性感染时期急性感染时期HBVHBV的标志物的标志物的标志物的标志物第43页，讲稿共49张，创作于星期三病毒颗粒DNARNAFQ-PCRRT-FQ PCR裂解荧光信号检测核酸纯
21、化系统多通道荧光多通道荧光PCR自动检测系统自动检测系统荧光荧光荧光荧光PCRPCR检测流程检测流程检测流程检测流程自动加样第44页，讲稿共49张，创作于星期三多样本混合（多样本混合（Mini pool）规格：规格：16-96donations“Pool”是为了加快筛查的进度和降低成本，将多袋血浆进行混合后进行检测。是为了加快筛查的进度和降低成本，将多袋血浆进行混合后进行检测。“Pool”的规格取决于临界阳性和所用的规格取决于临界阳性和所用NAT试剂的检测限度试剂的检测限度。(据文献，PEI要求欧盟所有原料血浆必须进行HCV-RNA的NAT检测，单份血源的检测限度应达到5000 IU/ml，约
22、1.352.4104geq/ml;目前FDA要求单份血源的RNA（HIV/HCV）检测限度应达到5000 copies/ml)筛查方法：筛查方法：递减法递减法矩阵法矩阵法第45页，讲稿共49张，创作于星期三递减法第46页，讲稿共49张，创作于星期三矩阵法第47页，讲稿共49张，创作于星期三成本分析成本分析前提：前提：试剂盒灵敏度（试剂盒灵敏度（500 copies/ml)24 minipool（矩阵法筛选）（矩阵法筛选）阳性检出率阳性检出率=1/10000以以10000 donars 为例：为例：试剂用量试剂用量:473每份筛查成本每份筛查成本=473*每份试剂费用每份试剂费用/10000=0.0473*每份试剂费用每份试剂费用第48页，讲稿共49张，创作于星期三感谢大家观看第49页，讲稿共49张，创作于星期三