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1、关于蛋白质分离技术全第1页，讲稿共146张，创作于星期三一、一、引言引言蛋白质（酶）存在于一切生物体中，是蛋白质（酶）存在于一切生物体中，是非常重要的生物大分子。蛋白质是生物非常重要的生物大分子。蛋白质是生物功能的执行者，担负着生物催化、物质功能的执行者，担负着生物催化、物质运输、运动、防御、调控及记忆、识别运输、运动、防御、调控及记忆、识别等多种生理功能。等多种生理功能。第2页，讲稿共146张，创作于星期三（一）分离纯化的意义（一）分离纯化的意义从生物材料中分离制备蛋白质、核酸，研究其结构与功能，对于从生物材料中分离制备蛋白质、核酸，研究其结构与功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本
2、质有重大意义。了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义。工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量的工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。浆等。医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。基因工程的需要基因工程的需要第3页，讲稿共146张，创作于星期三（二）分离纯化的要求（二）分离纯化的要求1 1、纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研、纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研究一级结构、空
3、间结构，一级结构与功能的关系的蛋白质究一级结构、空间结构，一级结构与功能的关系的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂，都要求均制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂，都要求均一；工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂，达到一定纯一；工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂，达到一定纯度即可，不要求均一。度即可，不要求均一。2 2、活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物活性。、活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物活性。3 3、收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不少损、收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不少损失。而且提纯步骤越多，损失越大。失。而且提纯步
4、骤越多，损失越大。第4页，讲稿共146张，创作于星期三（三）分离纯化的一般程序（三）分离纯化的一般程序生物大分子的分离纯化一般可分为生物大分子的分离纯化一般可分为以下几个阶段：以下几个阶段：材料的选择和预处理材料的选择和预处理破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器的分离）器的分离）分离纯化：包括粗分级分离和细分级分分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离离其中前两个阶段为生物大分子分离纯化其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前处理。的前处理。选择材料选择材料破碎细胞破碎细胞提取提取分离纯化分离纯化分析及鉴定分析及鉴定第5页，讲稿共146张，创作于星期三二、二、蛋白质
5、（酶）蛋白质（酶）分离纯化的前处理分离纯化的前处理（一）材料的选择与预处理（一）材料的选择与预处理选择材料主要根据实验目的而定。工业生产上注意选择含量高、来源选择材料主要根据实验目的而定。工业生产上注意选择含量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本低的动植物组织或微生物做原料。丰富、易获得、制备工艺简单、成本低的动植物组织或微生物做原料。科研选材则无需考虑上述问题，只要能达到实验目的即可。科研选材则无需考虑上述问题，只要能达到实验目的即可。实验材料选定后，常常需要进行预处理，如动物材料需要除去一些与实验材料选定后，常常需要进行预处理，如动物材料需要除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪组织；植物
6、种子需要除壳；微生物需要将实验无关的结缔组织、脂肪组织；植物种子需要除壳；微生物需要将菌体与发酵液分开。另外，必须尽可能保持材料的新鲜，尽快加工处菌体与发酵液分开。另外，必须尽可能保持材料的新鲜，尽快加工处理。若不立即进行实验或加工，应冷冻保存。理。若不立即进行实验或加工，应冷冻保存。第6页，讲稿共146张，创作于星期三（二）细胞的破碎（二）细胞的破碎分离提取某一生物大分子，首先要求生物大分子从原来分离提取某一生物大分子，首先要求生物大分子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢生物活性。因此应选择适当的方法将组天然状
7、态，不丢生物活性。因此应选择适当的方法将组织和细胞破碎。但若材料是体液（如血）或生物体分泌织和细胞破碎。但若材料是体液（如血）或生物体分泌到体外的分泌物，则不必进行组织细胞的破碎。到体外的分泌物，则不必进行组织细胞的破碎。组织细胞的破碎方法很多，不同的实验规模，不同的实组织细胞的破碎方法很多，不同的实验规模，不同的实验材料和实验要求，使用的破碎方法和条件也不同。验材料和实验要求，使用的破碎方法和条件也不同。第7页，讲稿共146张，创作于星期三1.机械法：机械法：1)研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆。加入少量石英砂研磨或
8、匀浆。2)组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用后再用10000r/min20000r/min的内刀式组织捣碎的内刀式组织捣碎机机(即高速分散器即高速分散器)将组织的细胞打碎。将组织的细胞打碎。第8页，讲稿共146张，创作于星期三2.物理法：物理法：1)反反复复冻冻融融法法：将将待待破破碎碎的的细细胞胞冷冷至至15到到20，然然后后放放于于室室温温(或或40)迅迅速速融融化化，如如此此反反复复冻冻融融多多次次，由由于于细细胞胞内内形形成成冰冰粒粒使使剩剩余胞液的盐
9、浓度增高而引起细胞溶胀破碎。余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。2)超超声声波波处处理理法法：此此法法是是借借助助超超声声波波的的振振动动力力破破碎碎细细胞胞壁壁和和细细胞胞器器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。3)压压榨榨法法：这这是是一一种种温温和和的的、彻彻底底破破碎碎细细胞胞的的方方法法。在在1000105Pa2000105Pa的的高高压压下下使使细细胞胞悬悬液液通通过过一一个个小小孔孔突突然然释释放放至至常常压压，细胞将彻底破碎。细胞将彻底破碎。4)冷冷热热交交替替法法：从从细细菌菌或或病病毒毒中中提提取取蛋蛋白白质质和和核核酸酸时时
10、可可用用此此法法。在在90左左右右维维持持数数分分钟钟，立立即即放放入入冰冰浴浴中中使使之之冷冷却却，如如此此反反复复多多次次，绝绝大部分细胞可以被破碎。大部分细胞可以被破碎。第9页，讲稿共146张，创作于星期三3.化学与生物化学方法：化学与生物化学方法：1)自自溶溶法法：将将新新鲜鲜的的生生物物材材料料存存放放于于一一定定的的pH和和适适当当的的温温度度下下，细细胞胞结结构构在在自自身身所所具具有有的的各各种种水水解解酶酶（如如蛋蛋白白酶酶和和酯酯酶酶等等）的的作作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。2)溶溶胀胀法法：细细胞胞膜膜为为天天然然的的半半透透膜
11、膜，在在低低渗渗溶溶液液和和低低浓浓度度的的稀稀盐盐溶溶液液中中，由由于于存存在在渗渗透透压压差差，溶溶剂剂分分子子大大量量进进入入细细胞胞，将将细细胞胞膜膜胀破释放出细胞内含物。胀破释放出细胞内含物。3)酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于酶等，于37，pH8，处理，处理15分钟，可以专一性地将细胞壁分解。分钟，可以专一性地将细胞壁分解。4)有有机机溶溶剂剂处处理理法法：利利用用氯氯仿仿、甲甲苯苯、丙丙酮酮等等脂脂溶溶性性溶溶剂剂或或SDS（十十二二烷烷基基硫硫酸酸钠钠）等等表表面面活活性性剂剂处处理理细细胞胞，
12、可可将将细细胞胞膜膜溶溶解解，从从而而使使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。第10页，讲稿共146张，创作于星期三（三）细胞器的分离（三）细胞器的分离细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细胞还细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细胞还有叶绿体。有叶绿体。如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了防止如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染，还需先将细胞其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染，还需先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某一物质。器分离出来，然后在某一细
13、胞器中分离某一物质。细胞器的分离一般采用差速离心法，即将破碎后的细胞在适当的细胞器的分离一般采用差速离心法，即将破碎后的细胞在适当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠檬酸、聚乙二介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠檬酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同，经过不同速度的离心后，醇等。各种细胞组分按质量大小的不同，经过不同速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经多次分步离心后，即可获得所需组沉降于离心管的不同部位，经多次分步离心后，即可获得所需组分。分。第11页，讲稿共146张，创作于星期三（四）提取（四）提取组织细胞破碎过程中，大量的胞内酶及细胞内含物组织细胞破碎过程中
14、，大量的胞内酶及细胞内含物被释放出来，必须立即将其置于一定条件下和溶剂被释放出来，必须立即将其置于一定条件下和溶剂中，让制备物充分溶解，并尽可能保持原来的天然中，让制备物充分溶解，并尽可能保持原来的天然状态，避免因长久放置造成制备物的分解破坏，这状态，避免因长久放置造成制备物的分解破坏，这就是提取。就是提取。第12页，讲稿共146张，创作于星期三1.影响提取的因素影响提取的因素目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小；目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小；由固相扩散到液相的难易；由固相扩散到液相的难易；溶剂的溶剂的pHpH值和提取时间等。值和提取时间等。通常：通常：极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易
15、溶于非极性溶剂；极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂；碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂；碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂；温度升高，溶解度加大；温度升高，溶解度加大；远离等电点的远离等电点的pHpH值，溶解度增加。值，溶解度增加。提提取取时时所所选选择择的的条条件件应应有有利利于于目目的的产产物物溶溶解解度度的的增增加加和和保保持持其其生物活性。生物活性。第13页，讲稿共146张，创作于星期三2.水溶液提取水溶液提取蛋蛋白白质质和和酶酶的的提提取取一一般般以以水水溶溶液液为为主主。用用水水溶溶液液提提取取生生物物大大分分子子应应注注意意的的几几个个主主
16、要要影影响响因素是：因素是：1)盐浓度（即离子强度）：盐浓度（即离子强度）：离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响，绝大多数蛋白质和酶，在离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响，绝大多数蛋白质和酶，在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度，如在纯水中加入少量中性盐，蛋低离子强度的溶液中都有较大的溶解度，如在纯水中加入少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加，称为白质的溶解度比在纯水时大大增加，称为“盐溶盐溶”现象。盐溶现象的产生主现象。盐溶现象的产生主要是少量离子的活动，减少了偶极分子之间极性基团的静电吸引力，增加要是少量离子的活动，减少了偶极分子之间极性基团的静电吸引力，增加了溶质和溶剂
17、分子间相互作用力的结果。了溶质和溶剂分子间相互作用力的结果。为了提高提取效率，有时需要降低或提高溶剂的极性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使为了提高提取效率，有时需要降低或提高溶剂的极性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其极性降低，增加离子强度（如加入其极性降低，增加离子强度（如加入KCl、NaCl、NH4Cl或或(NH4)2SO4）可以增加溶）可以增加溶液的极性。液的极性。第14页，讲稿共146张，创作于星期三2)pH值：值：蛋白质、酶的溶解度和稳定性与蛋白质、酶的溶解度和稳定性与pH值有关。过值有关。过酸、过碱均应尽量避免，一般控制在酸、过碱均应尽量避免，一般控制在pH=68范围内，提范围内，提取
18、溶剂的取溶剂的pH应在蛋白质和酶的稳定范围内，通常选择偏离应在蛋白质和酶的稳定范围内，通常选择偏离等电点的两侧。等电点的两侧。3)温度：温度：为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和酶，为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和酶，提取时一般在提取时一般在05的低温操作。的低温操作。4)防止蛋白酶的降解作用：防止蛋白酶的降解作用：加入抑制剂或调节提取液的加入抑制剂或调节提取液的pH、离子强度或极性等方法使相应的水解酶失去活性，、离子强度或极性等方法使相应的水解酶失去活性，防止它们对欲提纯的蛋白质、酶的降解作用。防止它们对欲提纯的蛋白质、酶的降解作用。第15页，讲稿共146张，创作于星期三5)搅搅
19、拌拌与与氧氧化化：搅搅拌拌能能促促使使被被提提取取物物的的溶溶解解，一一般般采采用用温温和和搅搅拌拌为为宜宜，速速度度太太快快容容易易产产生生大大量量泡泡沫沫，增增大大了了与与空空气气的的接接触触面面，会会引引起起酶酶等等物物质质的的变变性性失失活活。因因为为一一般般蛋蛋白白质质都都含含有有相相当当数数量量的的巯巯基基，有有些些巯巯基基常常常常是是活活性性部部位位的的必必需需基基团团，若若提提取取液液中中有有氧氧化化剂剂或或与与空空气气中中的的氧氧气气接接触触过过多多都都会会使使巯巯基基氧氧化化为为分分子子内内或或分分子子间间的的二二硫硫键键，导导致致酶酶活活性性的的丧丧失失。在在提提取取液液
20、中中加加入入少少量量巯巯基基乙乙醇醇或或二二硫苏糖醇以防止巯基氧化。硫苏糖醇以防止巯基氧化。第16页，讲稿共146张，创作于星期三3.有机溶剂提取有机溶剂提取一一些些和和脂脂类类结结合合比比较较牢牢固固或或分分子子中中非非极极性性侧侧链链较较多多的的蛋蛋白白质质和和酶酶难难溶溶于于水水、稀稀盐盐、稀稀酸酸、或或稀稀碱碱中中，常常用用不不同同比比例例的的有有机溶剂提取。机溶剂提取。常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等，常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等，这些溶剂可以与水互溶或部分互溶，同时具有亲水性和这些溶剂可以与水互溶或部分互溶，同时具有亲水性和亲脂性。亲脂性。有些蛋白质和酶
21、既溶于稀酸、稀碱，又能溶于含有一定有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶于含有一定比例的有机溶剂的水溶液中，在这种情况下，采用稀的有比例的有机溶剂的水溶液中，在这种情况下，采用稀的有机溶液提取常常可以防止水解酶的破坏，并兼有除去杂质机溶液提取常常可以防止水解酶的破坏，并兼有除去杂质提高纯化效果的作用。提高纯化效果的作用。例如，胰岛素。例如，胰岛素。第17页，讲稿共146张，创作于星期三4.膜蛋白的提取膜蛋白的种类繁多，多数膜蛋白分子数目较少，但却赋予细胞膜非常重膜蛋白的种类繁多，多数膜蛋白分子数目较少，但却赋予细胞膜非常重要的生物学功能。要的生物学功能。根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方
22、式，膜蛋白可分为两大根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式，膜蛋白可分为两大类型：外周膜蛋白和内在膜蛋白。类型：外周膜蛋白和内在膜蛋白。(1)外周膜蛋白为水溶性蛋白，靠离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋白质外周膜蛋白为水溶性蛋白，靠离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋白质分子或脂分子结合，因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜分子或脂分子结合，因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜上分离下来，膜结构并不被破坏。上分离下来，膜结构并不被破坏。(2)内在膜蛋白与膜结合非常紧密，一般讲只有用去垢剂内在膜蛋白与膜结合非常紧密，一般讲只有用去垢剂(detergent)使使膜溶解后才可分
23、离出来。膜溶解后才可分离出来。第18页，讲稿共146张，创作于星期三膜蛋白膜蛋白即内在蛋白溶解性不好，提取膜蛋白的即内在蛋白溶解性不好，提取膜蛋白的基本基本方法就是用方法就是用不同的离心速度不同的离心速度去掉胞质蛋白等，最去掉胞质蛋白等，最后用后用去污剂去污剂把蛋白从膜中释放出来。把蛋白从膜中释放出来。膜蛋白分离纯化的重要步骤是选择适当的增溶用膜蛋白分离纯化的重要步骤是选择适当的增溶用表面活性剂，一般常用的有胆酸盐，表面活性剂，一般常用的有胆酸盐，Triton-100，Tween-80,SDS等表面活性剂。等表面活性剂。第19页，讲稿共146张，创作于星期三分离膜蛋白的方法（原则性）1）先分离
24、膜，然后提取；如选用冷热交替法、反先分离膜，然后提取；如选用冷热交替法、反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶法和复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶法和酶处理法使得细胞破碎，然后通过剃度离心得到酶处理法使得细胞破碎，然后通过剃度离心得到含有膜蛋白的粗组分。含有膜蛋白的粗组分。2）用特殊的去污剂选择性的分离。在多数情况下，）用特殊的去污剂选择性的分离。在多数情况下，都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来。都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来。第20页，讲稿共146张，创作于星期三第21页，讲稿共146张，创作于星期三三、分离与纯化三、分离与纯化从细胞中提取得到的生物大分子往往
25、是不纯净从细胞中提取得到的生物大分子往往是不纯净的，含有大量杂质，必须进一步分离纯化，这的，含有大量杂质，必须进一步分离纯化，这一阶段可分为粗分级分离和细分级分离两步进一阶段可分为粗分级分离和细分级分离两步进行。行。蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子之间特异性的差异，如分子大小，溶解度，电子之间特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的。荷等建立起来的。第22页，讲稿共146张，创作于星期三常用的蛋白质分离纯化技术常用的蛋白质分离纯化技术溶解度溶解度盐析、等电点沉淀、盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀分子大小分子大小透析、超过
26、滤透析、超过滤密度梯度离心、凝胶过密度梯度离心、凝胶过滤滤带电特性带电特性电泳、离子交换层析电泳、离子交换层析吸附特性吸附特性吸附层析吸附层析对配体分子的亲对配体分子的亲和性和性依据性质依据性质方方法法用于粗分用于粗分用于细分用于细分亲和层析、金属亲和层析、金属螯合层析螯合层析分配层析分配层析第23页，讲稿共146张，创作于星期三（一）粗分级分离（一）粗分级分离主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开。分开。优点：简便、处理量大、既能除去大量杂质，优点：简便、处理量大、既
27、能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质。又能浓缩蛋白质。缺点：分辨率低，产品杂质多。缺点：分辨率低，产品杂质多。第24页，讲稿共146张，创作于星期三1.1.盐析（盐析（中性盐沉淀中性盐沉淀）在在溶溶液液中中加加入入中中性性盐盐使使生生物物大大分分子子沉沉淀淀析析出出的的过过程程称称为为“盐盐析析”。除除了了蛋蛋白白质质和和酶酶以以外外，多多肽肽、多多糖糖和和核核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。盐盐析析法法应应用用最最广广的的还还是是在在蛋蛋白白质质领领域域，已已有有八八十十多多年年的的历史，其突出的优点是：历史，其突出的优点是：成本低，不需要特别昂贵的设备。成本低，不
28、需要特别昂贵的设备。操作简单、安全。操作简单、安全。对许多生物活性物质具有稳定作用。对许多生物活性物质具有稳定作用。第25页，讲稿共146张，创作于星期三盐析的基本原理盐析的基本原理蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素：水化蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素：水化膜和电荷。膜和电荷。中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水化加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水化膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水溶胶，蛋白质分子即聚集而形成沉淀。了亲水溶胶，蛋白质分子即聚集而
29、形成沉淀。第26页，讲稿共146张，创作于星期三溶溶解解度度盐浓度盐浓度Salting-outSalting-in第27页，讲稿共146张，创作于星期三+等点电时的蛋白质等点电时的蛋白质等点电时的蛋白质等点电时的蛋白质（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）带负电荷蛋白质（亲带负电荷蛋白质（亲带负电荷蛋白质（亲带负电荷蛋白质（亲水胶体）水胶体）水胶体）水胶体）脱水脱水脱水脱水脱水脱水带负电荷蛋白质（疏带负电荷蛋白质（疏水胶体）水胶体）不稳定蛋白颗粒不稳定蛋白颗粒不稳定蛋白颗粒不稳定蛋白颗粒阴离子阴离子阳离子阳离子碱碱酸酸酸酸蛋白质聚集沉淀蛋白质聚集沉淀带正电荷蛋白质带正电荷蛋白质带正电
30、荷蛋白质带正电荷蛋白质（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）（亲水胶体）碱碱+水化膜水化膜带正电荷蛋白质带正电荷蛋白质（疏水胶体）（疏水胶体）水化膜水化膜第28页，讲稿共146张，创作于星期三中性盐的选择中性盐的选择常常用用的的中中性性盐盐中中最最重重要要的的是是(NH4)2SO4，因因为为它它与其他常用盐类相比有十分突出的优点：与其他常用盐类相比有十分突出的优点：1)溶溶解解度度大大：尤尤其其是是在在低低温温时时仍仍有有相相当当高高的的溶溶解解度度，这这是是其其他他盐盐类类所所不不具具备备的的。由由于于酶酶和和各各种种蛋蛋白白质质通通常常是是在在低低温温下下稳稳定定，因因而而盐盐析析操操作作也
31、也要要求求在在低低温温下下（04）进进行行。由由下下表表可可以以看看到到，硫硫铵铵在在0时时的的溶溶解解度度，远远远远高高于于其其它盐类：它盐类：第29页，讲稿共146张，创作于星期三几种盐在不同温度下的溶解度（克几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）毫升水）02080100（NH4)2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.8101硫铵在硫铵在0时的溶解度，远远高于其它盐类时的溶解度，远远高于其它盐类第30页，讲稿共146张，创作于星期三2)分分离离效效果果好好：有有的的提提取取液液加加入入适适量量硫硫酸酸铵铵盐盐
32、析析，一一步步就就可可以以除除去去75的的杂杂蛋蛋白白，纯纯度度提提高高了四倍。了四倍。3)不不易易引引起起变变性性，有有稳稳定定酶酶与与蛋蛋白白质质结结构构的的作作用用。有有的的酶酶或或蛋蛋白白质质用用23mol/L浓浓度度的的(NH4)2SO4保存可达数年之久。保存可达数年之久。4)价格便宜，废液不污染环境。价格便宜，废液不污染环境。第31页，讲稿共146张，创作于星期三（3 3）分段盐析）分段盐析不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所
33、需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质溶液中的盐浓度，要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质溶液中的盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。可以使不同的蛋白质分别沉淀。血清血清球蛋球蛋白白清蛋清蛋白白(NHNH4 4)2 2SOSO4 450%50%饱和度饱和度饱和饱和析出析出析出析出饱和度：在给定条件下以可能达到的最大浓度的百分饱和度：在给定条件下以可能达到的最大浓度的百分数表示的盐浓度。数表示的盐浓度。第32页，讲稿共146张，创作于星期三第33页，讲稿共146张，创作于星期三（4）盐析的影响因素）盐析的影响因素1)蛋白质的浓度：高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度沉淀，若蛋白质浓度过高，蛋白质的浓度
34、：高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度沉淀，若蛋白质浓度过高，易产生各种蛋白质的共沉淀作用。低浓度的蛋白质，共沉淀作用小，但回收率降低。易产生各种蛋白质的共沉淀作用。低浓度的蛋白质，共沉淀作用小，但回收率降低。较适中的蛋白质浓度是较适中的蛋白质浓度是2.53.0，相当于，相当于25mg/mL30mg/mL。2)pH值值对对盐盐析析的的影影响响：在在等等电电点点处处溶溶解解度度小小，pH值值常常选选在在该该蛋蛋白白质质的的等等电电点点附附近。近。3)温温度度的的影影响响：对对于于蛋蛋白白质质、酶酶和和多多肽肽等等生生物物大大分分子子，在在高高离离子子强强度度溶溶液液中中，温温度度升升高高，它它们们
35、的的溶溶解解度度反反而而减减小小。在在低低离离子子强强度度溶溶液液或或纯纯水水中中蛋蛋白白质质的的溶溶解解度度大大多多数数还还是是随随温温度度升升高高而而增增加加的的。一一般般情情况况下下，可可在在室室温温下下进进行行。但但对对于于某某些对温度敏感的酶，要求在些对温度敏感的酶，要求在04下操作，以避免活力丧失。下操作，以避免活力丧失。第34页，讲稿共146张，创作于星期三2.有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法基本原理基本原理有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。其原理主要是：生
36、沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。其原理主要是：降低水溶液的介电常数，向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，降低水溶液的介电常数，向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，导致蛋减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。白质溶解度降低而沉淀。由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时，从蛋白质分子周由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时，从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水
37、膜，因而发生沉淀作用。第35页，讲稿共146张，创作于星期三（2）有机溶剂沉淀法的优点）有机溶剂沉淀法的优点分分辨辨能能力力比比盐盐析析法法高高，即即一一种种蛋蛋白白质质或或其其他他溶溶质质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。沉沉淀淀不不用用脱脱盐盐，过过滤滤比比较较容容易易（如如有有必必要要，可可用用透透析析袋袋脱脱有有机机溶溶剂剂）。因因而而在在生生化化制制备备中中有有广广泛的应用。泛的应用。其其缺缺点点是是对对某某些些具具有有生生物物活活性性的的大大分分子子容容易易引引起起变性失活，操作需在低温下进行。变性失活，操作需在低温下进行。第36页，讲
38、稿共146张，创作于星期三（3）有机溶剂的选择和浓度的计算）有机溶剂的选择和浓度的计算用用于于生生化化制制备备的的有有机机溶溶剂剂的的选选择择首首先先是是要要能能与与水水互互溶溶。沉沉淀淀蛋蛋白白质质和和酶酶常常用用的的是是乙乙醇醇、甲甲醇醇和和丙丙酮。酮。为了获得沉淀而不着重于进行分离，可用溶液为了获得沉淀而不着重于进行分离，可用溶液体积的倍数：如加入一倍、二倍、三倍原溶液体体积的倍数：如加入一倍、二倍、三倍原溶液体积的有机溶剂，来进行有机溶剂沉淀。积的有机溶剂，来进行有机溶剂沉淀。第37页，讲稿共146张，创作于星期三（4）有机溶剂沉淀的影响因素）有机溶剂沉淀的影响因素1)温温度度：多多数
39、数生生物物大大分分子子如如蛋蛋白白质质、酶酶和和核核酸酸在在有有机机溶溶剂剂中中对对温温度度特特别别敏敏感感，温温度度稍稍高高就就会会引引起起变变性性，且且有有机机溶溶剂剂与与水水混混合合时时产产生生放放热热反反应应，因因此此必必须须预预冷冷，操操作作要要在在冰冰盐盐浴浴中中进进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓。行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓。一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高。一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高。2)样样品品浓浓度度：低低浓浓度度样样品品回回收收率率低低，要要使使用用比比例例更更大大的的有有机机溶溶剂剂进进行行沉沉淀淀。高高浓浓度
40、度样样品品，可可以以节节省省有有机机溶溶剂剂，减减少少变变性的危险，但杂蛋白的共沉淀作用大。性的危险，但杂蛋白的共沉淀作用大。通常使用通常使用5mg/mL20mg/mL的蛋白质初浓度为宜。的蛋白质初浓度为宜。第38页，讲稿共146张，创作于星期三3)pH值值：选选择择在在样样品品稳稳定定的的pH值值范范围围内内，通通常常是是选选在在等等电点附近，从而提高此沉淀法的分辨能力。电点附近，从而提高此沉淀法的分辨能力。4)离离子子强强度度：盐盐浓浓度度太太大大或或太太小小都都有有不不利利影影响响，通通常常盐盐浓浓度度以以不不超超过过5为为宜宜，使使用用乙乙醇醇的的量量也也以以不不超超过过原原蛋蛋白白质
41、质水水溶溶液液的的倍倍体体积积为为宜宜，少少量量的的中中性性盐盐对对蛋蛋白白质质变变性性有有良良好好的的保保护护作作用用，但但盐盐浓浓度度过过高高会会增增加加蛋蛋白白质质在在水水中中的的溶溶解解度度，降降低低了了沉沉淀淀效效果果，通通常常是是在在低低浓浓度度缓缓冲冲液液中沉淀蛋白质。中沉淀蛋白质。沉沉淀淀所所得得的的固固体体样样品品，如如果果不不是是立立即即溶溶解解进进行行下下一一步步的的分分离离，则则应应尽尽可可能能抽抽干干沉沉淀淀，减减少少其其中中有有机机溶溶剂剂的的含含量量，如如若若必必要要可可以以装装透透析析袋袋透透析析脱脱有有机机溶溶剂剂，以以免免影影响响样品的生物活性。样品的生物活
42、性。第39页，讲稿共146张，创作于星期三3.等电点沉淀法等电点沉淀法利用具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性时溶利用具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法。氨基酸、解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质，可以利用此法进行蛋白质、酶和核酸都是两性电解质，可以利用此法进行初步的沉淀分离。初步的沉淀分离。由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独
43、使用此法分辨率较低，此法常与盐析法、出，因此，单独使用此法分辨率较低，此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。淀能力和分离效果。第40页，讲稿共146张，创作于星期三pH和离子强度对和离子强度对-乳球蛋白溶解度的影响乳球蛋白溶解度的影响第41页，讲稿共146张，创作于星期三4.选择性变性沉淀法选择性变性沉淀法这这一一方方法法是是利利用用生生物物大大分分子子与与非非目目的的生生物物大大分分子子在在物物理理化化学学性性质质等等方方面面的的差差异异，选选择择一一定定的的条条件件使使杂杂蛋蛋白白等等非非目目的的物
44、物变变性性沉沉淀淀而而得到分离提纯。得到分离提纯。热变性热变性利利用用生生物物大大分分子子对对热热的的稳稳定定性性不不同同，加加热热升升高高温温度度使使非非目目的的生生物物大大分子变性沉淀而保留目的物在溶液中。分子变性沉淀而保留目的物在溶液中。表面活性剂和有机溶剂变性表面活性剂和有机溶剂变性使使那那些些对对表表面面活活性性剂剂和和有有机机溶溶剂剂敏敏感感性性强强的的杂杂蛋蛋白白变变性性沉沉淀淀。通通常在冰浴或冷室中进行。常在冰浴或冷室中进行。选择性酸碱变性选择性酸碱变性利利用用对对pH值值的的稳稳定定性性不不同同而而使使杂杂蛋蛋白白变变性性沉沉淀淀。通通常常是是在在分分离离纯化流程中附带进行的
45、分离纯化步骤。纯化流程中附带进行的分离纯化步骤。第42页，讲稿共146张，创作于星期三5.有机聚合物沉淀法有机聚合物沉淀法有有机机聚聚合合物物是是六六十十年年代代发发展展起起来来的的一一类类重重要要的的沉沉淀淀剂剂，最最早早应应用用于于提提纯纯免免疫疫球球蛋蛋白白和和沉沉淀淀一一些些细细菌菌和和病病毒毒。近近年年来来广广泛泛用用于于核核酸酸和和酶酶的纯化。其中应用最多的是的纯化。其中应用最多的是“聚聚乙乙二二醇醇”【HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH(n4)】(PolyethyleneGlycol简简写写为为PEG)，它它的的亲亲水水性性强强，溶溶干干水水和和许许多多有有机机溶溶剂剂，对
46、对热热稳稳定定，有有广广泛泛围围的的分分子子量量，在在生生物物大大分分子子制制备备中中，用用的的较较多的是分子量为多的是分子量为600020000的的PEG。本方法的优点是：本方法的优点是：操作条件温和，不易引起生物大分子变性。操作条件温和，不易引起生物大分子变性。沉沉淀淀效效能能高高，使使用用很很少少量量的的PEG即即可可以以沉沉淀淀相相当当多多的的生生物物大大分分子。子。沉淀后有机聚合物容易去除。沉淀后有机聚合物容易去除。第43页，讲稿共146张，创作于星期三6.透析透析自自ThomasGraham1861年年发发明明透透析析方方法法至至今今已已有有一一百百多多年年。透透析析已已成成为为生
47、生物物化化学学实实验验室室最最简简便便最最常常用用的的分分离离纯纯化化技技术术之之一一。在在生生物物大大分分子子的的制制备备过过程程中中，除除盐盐、除除少少量量有有机机溶溶剂剂、除除去去生生物物小小分分子子杂杂质质和和浓浓缩缩样样品品等等都都要用到透析的技术。要用到透析的技术。透析只需要使用专用的半透膜即可完成。透析只需要使用专用的半透膜即可完成。第44页，讲稿共146张，创作于星期三保留在透析袋内未透析保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为出的样品溶液称为“保保留液留液”，袋（膜）外的，袋（膜）外的溶液称为溶液称为“渗出液渗出液”或或“透析液透析液”。截留分子量。截留分子量MwCO通常为通常为
48、1万左右。万左右。用用1 BaCl2检检 查查(NH4)2SO4，用用 1AgNO3检检 查查NaCl、KCl等。等。第45页，讲稿共146张，创作于星期三7.超滤超滤超超过过滤滤即即超超滤滤，自自20年年代代问问世世后后，直直至至60年年代代以以来来发发展展迅迅速速，很很快快由由实实验验室室规规模模的的分分离离手手段段发发展展成成重重要要的的工工业业单单元操作技术。元操作技术。超超滤滤现现已已成成为为一一种种重重要要的的生生化化实实验验技技术术，广广泛泛用用于于含含有有各各种种小小分分子子溶溶质质的的各各种种生生物物大大分分子子（如如蛋蛋白白质质、酶酶、核核酸等）的浓缩、分离和纯化。酸等）的
49、浓缩、分离和纯化。超超滤滤是是一一种种加加压压膜膜分分离离技技术术，即即在在一一定定的的压压力力下下，使使小小分分子子溶溶质质和和溶溶剂剂穿穿过过一一定定孔孔径径的的特特制制的的薄薄膜膜，而而使使大大分分子子溶溶质质不不能能透透过过，留留在在膜膜的的一一边边，从从而而使使大分子物质得到了部分的纯化。大分子物质得到了部分的纯化。第46页，讲稿共146张，创作于星期三加压的蛋白加压的蛋白质溶液质溶液浓缩的蛋白浓缩的蛋白质溶液质溶液含小分子的含小分子的溶液溶液第47页，讲稿共146张，创作于星期三超滤根据所加的操作压力和所用膜的平均孔径的不同，超滤根据所加的操作压力和所用膜的平均孔径的不同，可分为可
50、分为微孔过滤、超滤和反渗透三种。微孔过滤、超滤和反渗透三种。微孔过滤所用的操作压通常小于微孔过滤所用的操作压通常小于4104Pa，膜的平均，膜的平均孔径为孔径为500埃埃14微米（微米（1微米微米104埃），埃），用于分离较用于分离较大的微粒、细菌和污染物等。大的微粒、细菌和污染物等。超滤所用操作压为超滤所用操作压为4104Pa7105Pa，膜的平均孔，膜的平均孔径为径为10100埃埃，用于分离大分子溶质。，用于分离大分子溶质。反渗透所用的操作压比超滤更大，常达到反渗透所用的操作压比超滤更大，常达到35105Pa140105Pa，膜的平均孔径最小，一般为，膜的平均孔径最小，一般为10埃埃以下，