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1、关于蛋白质分子设计第1页，讲稿共122张，创作于星期三引言引言在人体的进化过程中蛋白质执行了在人体及体外在人体的进化过程中蛋白质执行了在人体及体外的许多的许多重要任务重要任务：酶是催化化学反应的蛋白质或者核酸分子；抗体酶是催化化学反应的蛋白质或者核酸分子；抗体起到防护的作用起到防护的作用;从生态角度，蛋白质也是非常从生态角度，蛋白质也是非常理想的物质理想的物质:生物合成不需要消耗很多能量生物合成不需要消耗很多能量专一性很强专一性很强不产生副作用并且能很快降解不产生副作用并且能很快降解 第2页，讲稿共122张，创作于星期三蛋白质没有像化学试剂那样被普遍应用，其原因蛋白质没有像化学试剂那样被普遍应
2、用，其原因:(1)(1)蛋白质分子量非常大蛋白质分子量非常大(10 000-1 000 000)(10 000-1 000 000)，不能通，不能通过化学方法生产过化学方法生产;(2)(2)蛋白质的功能是在生理条件下挥发的，在其它条件蛋白质的功能是在生理条件下挥发的，在其它条件下下(如在有机溶剂中如在有机溶剂中)是不稳定的是不稳定的;(3)(3)专一性致使其应用范围受到影响。专一性致使其应用范围受到影响。蛋白质应用受限的原因蛋白质应用受限的原因第3页，讲稿共122张，创作于星期三蛋白质设计目前存在的问题蛋白质设计目前存在的问题1 1、与天然的蛋白质比较，缺乏结构的独特性及明与天然的蛋白质比较，
3、缺乏结构的独特性及明 显的功能优越性显的功能优越性2 2、三级结构的确定性较差、三级结构的确定性较差第4页，讲稿共122张，创作于星期三计算机模拟计算机模拟突变蛋白质产品突变蛋白质产品功能分析功能分析基因构建基因构建Pr 设计循环第一节 蛋白质分子设计原理第5页，讲稿共122张，创作于星期三蛋白质分子设计的流程蛋白质分子设计的流程天然蛋白质天然蛋白质蛋白质结构预测蛋白质结构预测蛋白质晶体学蛋白质晶体学蛋白质三维结构蛋白质三维结构结结构与功能的关系构与功能的关系蛋白质突变体设计及结构预测蛋白质突变体设计及结构预测几何优化及蛋白质动力学研究几何优化及蛋白质动力学研究结果分析与原先的结构比较结果分析
4、与原先的结构比较蛋白质合成定位突变蛋白质合成定位突变分离、纯化及表征分离、纯化及表征新蛋白质新蛋白质数据数据的输的输入入第6页，讲稿共122张，创作于星期三Pr突变体设计的突变体设计的3个步骤个步骤利用计算机模拟技术确定突变位点及替换的aa利用能量优化及动力学方法预测修饰后的蛋白质结构预测的结构与原始的Pr结构比较，利用Pr结构-功能或结构稳定相关知识及理论计算机预测新Pr可能具有的性质第7页，讲稿共122张，创作于星期三v在上述的设计工作完成后，要进行合成或突变实在上述的设计工作完成后，要进行合成或突变实验并经分离、纯化及表征后得到所要求的新验并经分离、纯化及表征后得到所要求的新PrPr；v
5、PrPr设计的成功与否，必须要有设计的成功与否，必须要有理论与实验的理论与实验的紧密相结合紧密相结合第8页，讲稿共122张，创作于星期三v在上述的设计工作完成后，要进行合成或突在上述的设计工作完成后，要进行合成或突变实验并经分离、纯化及表征后得到所要求的变实验并经分离、纯化及表征后得到所要求的新新PrPr；vPrPr设计的成功与否，必须要有设计的成功与否，必须要有理论与实验的紧理论与实验的紧密相结合密相结合第9页，讲稿共122张，创作于星期三一、蛋白质分子设计的分类一、蛋白质分子设计的分类设计的目的主要有两个：设计的目的主要有两个：一是一是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案和指为有目的的蛋白
6、质工程改造提供设计方案和指导性信息导性信息，如以此提高蛋白质的热、酸稳定性，增，如以此提高蛋白质的热、酸稳定性，增加活性，降低副作用，提高专一性等；加活性，降低副作用，提高专一性等；二是二是探索蛋白质的折叠机理探索蛋白质的折叠机理，如简单蛋白质骨架的，如简单蛋白质骨架的从头设计是研究蛋白质内相互作用力的类型及本质的从头设计是研究蛋白质内相互作用力的类型及本质的很好途径，也为解决蛋白质折叠问题寻找定性和定量很好途径，也为解决蛋白质折叠问题寻找定性和定量的规律。的规律。第10页，讲稿共122张，创作于星期三（一）蛋白质分子设计的层次（一）蛋白质分子设计的层次分为两个层次：分为两个层次：一是一是在蛋
7、白质三维结构已知基础上的分在蛋白质三维结构已知基础上的分子设计子设计；二是二是在三维结构未知的情况下，借助一在三维结构未知的情况下，借助一级结构序列信息及生物化学性质进行分级结构序列信息及生物化学性质进行分子设计工作。子设计工作。第11页，讲稿共122张，创作于星期三（二）蛋白质分子设计的分类（二）蛋白质分子设计的分类1定点突变或化学修饰法定点突变或化学修饰法2拼接组装设计法拼接组装设计法3从头设计全新蛋白质从头设计全新蛋白质第12页，讲稿共122张，创作于星期三二、蛋白质分子设计的原则二、蛋白质分子设计的原则1活性设计活性设计2对专一性的设计对专一性的设计3Scaffold设计设计(框架框架
8、)4疏水基团与亲水基团需合理分布疏水基团与亲水基团需合理分布5最优的氨基酸侧链几何排列最优的氨基酸侧链几何排列第13页，讲稿共122张，创作于星期三蛋白质分子设计原理蛋白质分子设计原理内内核核假假设设。蛋蛋白白质质的的独独特特的的折折叠叠形形式式是是由由蛋蛋白白质质内内核核中残基的相互作用决定。（内部十分保守的区域）中残基的相互作用决定。（内部十分保守的区域）PrPr内内部部都都是是密密堆堆积积（很很少少有有空空穴穴大大到到水水分分子子可可以以结结合合一一个个水分子或惰性气体），没有重叠水分子或惰性气体），没有重叠所所有有内内部部的的氢氢键键都都是是最最大大满满足足的的（主主链链和和侧侧链链）
9、。蛋蛋白白质质的氢键形成涉及一个交换反应，溶剂键被蛋白质键所取代的氢键形成涉及一个交换反应，溶剂键被蛋白质键所取代疏疏水水及及亲亲水水基基团团需需要要合合理理的的分分布布在在溶溶剂剂可可及及表表面面及及不不可可及及表面。分布代表疏水效应的主要驱动力表面。分布代表疏水效应的主要驱动力第14页，讲稿共122张，创作于星期三蛋白质分子设计原理蛋白质分子设计原理金金属属PrPr中中配配位位残残基基的的替替换换要要满满足足金金属属配配位位几几何何。要要求求围围绕绕金金属属中中心心放放置置合合适适数数目目的的蛋蛋白白质质侧侧链链或或溶溶剂剂分分子子，并并符合正确的键长、键角以及整体的几何。符合正确的键长、
10、键角以及整体的几何。对对于于金金属属PrPr，围围绕绕金金属属中中心心的的第第二二壳壳层层中中的的相相互互作作用用是是重重要要的的。氢氢键键的的第第二二壳壳层层通通常常涉涉及及与与蛋蛋白白质质主主链链的的相相互互作作用。用。最最优优的的aaaa侧侧链链几几何何排排列列。PrPr侧侧链链构构象象由由空空间间两两个个立立体体因因素所决定素所决定(一是立体势垒，二是一是立体势垒，二是aaaa的位置的位置)结构及功能的专一性。结构及功能的专一性。这是这是PrPr设计最困难的问题设计最困难的问题第15页，讲稿共122张，创作于星期三序列设计序列设计设计设计螺旋螺旋时，应选择象时，应选择象Leu、Glu等
11、易于等易于形成形成螺旋的残基；螺旋的残基；设计设计全全结构结构时，应选择时，应选择Val、Ile等易于等易于形成形成折叠片的残基；折叠片的残基；而在设计而在设计转角转角时常选择时常选择Pro-Asn残基对。残基对。第16页，讲稿共122张，创作于星期三溶菌酶结构溶菌酶结构例如例如:鸡卵清蛋白溶菌酶活性分鸡卵清蛋白溶菌酶活性分子的设计子的设计Cutte成功设计了一个具有明显的成功设计了一个具有明显的核酸酶活性的核酸酶活性的34肽，该肽可水解下列肽，该肽可水解下列底物，但活性依次降低：底物，但活性依次降低：polyC、polyA、polyU、polyG。其主要活性源于二聚体；而天其主要活性源于二聚
12、体；而天然核酸酶仅消化然核酸酶仅消化polyC、polyU、polyA。第17页，讲稿共122张，创作于星期三设计步骤设计步骤蛋白质分子设计步骤图蛋白质分子设计步骤图修正设计修正设计获得目标蛋白质获得目标蛋白质序列合成序列合成检测检测结构信息分析结构信息分析建立结构模型建立结构模型设计目标设计目标蛋白质数据库蛋白质数据库第18页，讲稿共122张，创作于星期三第二节第二节 基于天然蛋白质结构的分子设计基于天然蛋白质结构的分子设计基于天然蛋白质结构的分子设计有两类基于天然蛋白质结构的分子设计有两类：一是一是进行蛋白质修饰或基因定位突变，即进行蛋白质修饰或基因定位突变，即“小改小改”；二是二是进行蛋
13、白质分子裁剪拼接，即进行蛋白质分子裁剪拼接，即“中改中改”。第19页，讲稿共122张，创作于星期三一、定位突变基于天然蛋白质结构的蛋白质分子基于天然蛋白质结构的蛋白质分子“小改小改”是指对已知结构的蛋白质进行是指对已知结构的蛋白质进行少数几个残基的修饰、替换或删除等，少数几个残基的修饰、替换或删除等，这是目前蛋白质工程中最广泛使用的方这是目前蛋白质工程中最广泛使用的方法，主要可分为法，主要可分为蛋白质修饰蛋白质修饰和和基因定位基因定位突变突变两类。两类。第20页，讲稿共122张，创作于星期三（一）定位突变的设计目标及解决方法（一）定位突变的设计目标及解决方法定位突变常见的设计定位突变常见的设计
14、目标目标是提高蛋白质的是提高蛋白质的热、酸稳定性、增加活性、降低副作用、提高专热、酸稳定性、增加活性、降低副作用、提高专一性，以及通过蛋白质工程手段进行结构一性，以及通过蛋白质工程手段进行结构-功能关功能关系的研究等。系的研究等。第21页，讲稿共122张，创作于星期三Hartley等于等于1986年完成了一个设计目标及解决年完成了一个设计目标及解决的办法的办法：热稳定性热稳定性对氧化的稳定性对氧化的稳定性对重金属的稳定性对重金属的稳定性pH稳定性稳定性提高酶学性质提高酶学性质引入二硫桥，增加内氢键数目，改引入二硫桥，增加内氢键数目，改善内疏水堆积善内疏水堆积把把CysCys转换为转换为AlaA
15、la或或SerSer，把，把TrpTrp转换转换为为PhePhe或或TyrTyr替代表面羧基，把替代表面羧基，把MetMet转换为转换为GlnGln、ValVal、IleIle或或LeuLeu替换表面荷电基团，替换表面荷电基团，HisHis、CysCys以及以及TyrTyr的置换的置换专一性的改变，增加逆转数，专一性的改变，增加逆转数，改变改变酸碱度酸碱度 第22页，讲稿共122张，创作于星期三（二）定位突变的种类（二）定位突变的种类要进行基因定位突变，改变要进行基因定位突变，改变DNA核苷酸序列，核苷酸序列，方法有很多种，如基因的化学合成、基因直接修方法有很多种，如基因的化学合成、基因直接修
16、饰法、盒式突变技术等。饰法、盒式突变技术等。根据基因突变的方式，分为以下根据基因突变的方式，分为以下三类三类：插入插入一个或多个氨基酸残基；一个或多个氨基酸残基；删除删除一个或多个氨基酸残基；一个或多个氨基酸残基；替换替换或取代一个或多个氨基酸残基。或取代一个或多个氨基酸残基。要达到基因定位突变的目的，多采用体外重要达到基因定位突变的目的，多采用体外重组组DNA技术或技术或PCR方法。方法。第23页，讲稿共122张，创作于星期三（三）定位突变的程序（三）定位突变的程序1建立所研究蛋白质的结构模型可以通过可以通过X射线晶体学、二维核磁共射线晶体学、二维核磁共振等测定结构，也可以根据类似物的结振等
17、测定结构，也可以根据类似物的结构或其他结构预测方法建立起结构模型。构或其他结构预测方法建立起结构模型。第24页，讲稿共122张，创作于星期三2找出对所要求的性质有重要影响找出对所要求的性质有重要影响的位置的位置在改造中如何恰当地选择在改造中如何恰当地选择突变残基突变残基是一是一个关键问题，这不仅需要分析残基的个关键问题，这不仅需要分析残基的性质，同时还需要借助于已有的三维性质，同时还需要借助于已有的三维结构或分子模型。结构或分子模型。第25页，讲稿共122张，创作于星期三3预测突变体的结构预测突变体的结构根据所选定的氨基酸残基位点及突根据所选定的氨基酸残基位点及突变后的氨基酸种类，利用相关软件
18、进行变后的氨基酸种类，利用相关软件进行突变体的结构预测，将预测的结构与原突变体的结构预测，将预测的结构与原始的蛋白质结构比较始的蛋白质结构比较第26页，讲稿共122张，创作于星期三4构建突变体，获得突变体蛋白构建突变体，获得突变体蛋白依据所设计好的突变，利用化学合依据所设计好的突变，利用化学合成或成或PCR等方法构建突变体。进行基因等方法构建突变体。进行基因测序验证突变体后，将突变体进行表达，测序验证突变体后，将突变体进行表达，纯化蛋白质，获得所设计的新蛋白质。纯化蛋白质，获得所设计的新蛋白质。第27页，讲稿共122张，创作于星期三5突变体蛋白质的检验突变体蛋白质的检验测定新蛋白质的序列、三维
19、结构、稳定测定新蛋白质的序列、三维结构、稳定性、催化活性等，性、催化活性等，并与对应的天然蛋白质进行比较，检验并与对应的天然蛋白质进行比较，检验突变设计的效果，突变设计的效果，同时进一步修正设计方案。同时进一步修正设计方案。第28页，讲稿共122张，创作于星期三蛋白质中功能蛋白质中功能残基的鉴定残基的鉴定根据结构信息根据结构信息确定残基的突变确定残基的突变突变方法鉴定突变突变方法鉴定突变功能残基功能残基利用蛋白质同源性利用蛋白质同源性鉴定功能残基鉴定功能残基（四）蛋白质中功能残基的鉴定第29页，讲稿共122张，创作于星期三1根据结构信息确定残基的突变根据结构信息确定残基的突变最有效最直接的方法
20、最有效最直接的方法AlanFersht和和GregWinter等测定了酪氨酰等测定了酪氨酰-tRNA合成酶突变体的三维结构，通过分析该酶的合成酶突变体的三维结构，通过分析该酶的Cys35被结构相似的丝氨酸所取代后的结构，发被结构相似的丝氨酸所取代后的结构，发现现Cys35可能与酪氨酰腺苷酸中间体中的可能与酪氨酰腺苷酸中间体中的3羟基形羟基形成氢键，突变效应降低了酶的活性，证实了成氢键，突变效应降低了酶的活性，证实了Cys35在结合腺苷酸部分的作用。在结合腺苷酸部分的作用。第30页，讲稿共122张，创作于星期三2突变方法鉴定突变功能残基突变方法鉴定突变功能残基通过引进另外一种突变来检测通过引进另
21、外一种突变来检测随机突变技术随机突变技术删除分析及连接片段扫描突变删除分析及连接片段扫描突变第31页，讲稿共122张，创作于星期三3利用蛋白质同源性鉴定突变功能残基利用蛋白质同源性鉴定突变功能残基高度保守的残基与同源蛋白的共同功能以及维持高度保守的残基与同源蛋白的共同功能以及维持结构有关结构有关。非保守残基是分析的靶位点，特别是对于专一性非保守残基是分析的靶位点，特别是对于专一性研究。研究。探测突变蛋白质的结构整体性质，以鉴定突变残基。探测突变蛋白质的结构整体性质，以鉴定突变残基。第32页，讲稿共122张，创作于星期三（五）定位突变的应用（五）定位突变的应用RNaseT1的结构改造是分于设计中
22、的一的结构改造是分于设计中的一个成功实例个成功实例T1核糖核酸酶含有核糖核酸酶含有104个个aa残基，天然酶残基，天然酶有两对二硫键（有两对二硫键（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大学的，日本大阪大学的Niskikawa等人等人在在Tyr24和和Asn84位引入第三个二硫键，位引入第三个二硫键，热稳定性增加。热稳定性增加。第33页，讲稿共122张，创作于星期三T4噬菌体溶菌酶噬菌体溶菌酶图2-3 T4溶菌酶的三维结构（Gassner,et al.1996）红色强调的为螺旋结构域核心中被蛋氨酸置换的10个残基T4溶菌酶的三维结构溶菌酶的三维结构红色红色强调的为强调的为螺旋中
23、被置换的残基螺旋中被置换的残基1.突变引入二硫突变引入二硫键键2.去除去除Gly或引或引入入Pro3.Ser38Asp和和Asn144Asp第34页，讲稿共122张，创作于星期三例：甲基对硫磷水解酶例：甲基对硫磷水解酶（Methylparathionhydrolase,MPH）结构和功能的研究结构和功能的研究 有机磷农药的长期广泛使用已经使很多水体及土壤有机磷农药的长期广泛使用已经使很多水体及土壤被严重污染被严重污染,而且直接影响到人们的身体健康。而且直接影响到人们的身体健康。有机磷水解酶有机磷水解酶(OrganophosphorusHydrolase,OPH)的改造：的改造：提高对特定底物的
24、催化效率提高对特定底物的催化效率;扩大底物范围扩大底物范围;增加酶的稳定性增加酶的稳定性 Dong Y J,2005Dong Y J,2005 第35页，讲稿共122张，创作于星期三目的和意义目的和意义 通过对通过对MPHMPH的结晶和三维结构的测定，研究的结晶和三维结构的测定，研究MPHMPH活活性中心的结构，并通过定点突变及活性测定来验证，性中心的结构，并通过定点突变及活性测定来验证，确定确定MPHMPH的结构和功能的关系的结构和功能的关系,为为MPHMPH的改性和利用提供的改性和利用提供科学的依据和良好的材料。科学的依据和良好的材料。OPHOPH是目前在各方面研究最为透彻的有机磷农药降解
25、是目前在各方面研究最为透彻的有机磷农药降解酶，同时也是应用最为广泛的农药降解酶，为此对甲基对酶，同时也是应用最为广泛的农药降解酶，为此对甲基对硫磷水解酶的深入研究将有利于甲基对硫磷水解酶的广泛硫磷水解酶的深入研究将有利于甲基对硫磷水解酶的广泛应用。应用。第36页，讲稿共122张，创作于星期三载体污染序列的分析载体污染序列的分析在进行序列分析时，首先需确定序列是否含有载体序列的污染，如果含有在进行序列分析时，首先需确定序列是否含有载体序列的污染，如果含有载体序列，需截去后再进行其他分析。载体序列，需截去后再进行其他分析。http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/V
26、ecScreen.html在线分析。在线分析。MatchtoVector:StrongModerateWeakSegmentofsuspectorigin:SegmentsmatchingvectorStrongmatch:1-113,3838-4071bp。真正的目标序列：真正的目标序列：1143,837bp。第37页，讲稿共122张，创作于星期三1ThenucleotidesequenceincludingmpdfromPseudomonassp.WBC-32Plesiomonassp.M6的甲基对硫磷水解酶基因的甲基对硫磷水解酶基因 匹配区为匹配区为1341866，Identities=
27、Identities=1720bp1733bp(99)CDS:331aa(398-1393bp)3Pseudomonasputida的甲基对硫磷降解蛋白基因的甲基对硫磷降解蛋白基因 匹配区为匹配区为1681393，IdentitiesIdentities=10251026(99)CDS:341aa(368-1393bp)两个基因的两个基因的CDSCDS不一致，分别匹配于不一致，分别匹配于MPHMPH的的398398，368-1393bp368-1393bp同源序列搜索（同源序列搜索（Blastn:114-3837 bp Blastn:114-3837 bp）123第38页，讲稿共122张，创作
28、于星期三甲基对硫磷水解酶基因的分析甲基对硫磷水解酶基因的分析结论：结论：MPHMPH基因的基因的CDS:3981393CDS:3981393（331aa)331aa)以以13931393位的位的TGATGA结束的可能的结束的可能的ORFORF有八个有八个,MW:34.4kD ATG:368,MW:34.4kD ATG:368，398 bp398 bp典型的启动子序列结构典型的启动子序列结构:TTGCAA-17:TTGCAA-17个氨基酸个氨基酸-TATACT(320-365bp)-TATACT(320-365bp)典型的核糖体结合位点典型的核糖体结合位点:AGGA(381 bp):AGGA(3
29、81 bp)第39页，讲稿共122张，创作于星期三MPHMPH与与OPHOPH的序列比对的序列比对二者同源性仅为二者同源性仅为13.6%13.6%，确定，确定MPHMPH是一个有别于是一个有别于OPHOPH的蛋白质。的蛋白质。二者在功能上的相似性不能用蛋白的一级序列的相似性加以解释，推测二者功二者在功能上的相似性不能用蛋白的一级序列的相似性加以解释，推测二者功能上的相似性与其一级序列构成的高级结构中活性中心结构的相似性有关。能上的相似性与其一级序列构成的高级结构中活性中心结构的相似性有关。第40页，讲稿共122张，创作于星期三MPHMPH信号肽的分析预测：神经网算法信号肽的分析预测：神经网算法
30、结论：信号肽（结论：信号肽（1-351-35氨基酸）。氨基酸）。C值表示切割点的可能性，S值表示具有信号肽的可能性第41页，讲稿共122张，创作于星期三MPHMPH信号肽的分析预测：马尔可夫算法信号肽的分析预测：马尔可夫算法信号肽的一般结构为：信号肽的一般结构为：正电荷的正电荷的n-regionn-region；疏水的疏水的h-regionh-region；中性极性的中性极性的c-regionc-region。MPHMPH具有典型的信号肽的三部分结构具有典型的信号肽的三部分结构结论：可能的信号肽为结论：可能的信号肽为1-351-35氨基酸。氨基酸。第42页，讲稿共122张，创作于星期三mlmA
31、UMPHMPH的凝胶过滤柱层析图的凝胶过滤柱层析图 第43页，讲稿共122张，创作于星期三MPHMPH的的SDS-PAGESDS-PAGE分析分析第44页，讲稿共122张，创作于星期三Buffer(ug/ml)MPH(ug/ml)Ni4.1484.370Mg14.34515.060Mn0.0750.497Fe1.1582.388Co0.0500.040Cu10.8129.296Zn0.201272.122MPHMPH中金属种类及含量的测定中金属种类及含量的测定MPHMPH的浓度：的浓度：0.217mg/ml,0.217mg/ml,结论：结论：MPHMPH中含锌离子中含锌离子第45页，讲稿共12
32、2张，创作于星期三硒代蛋氨酸硒代蛋氨酸MPHMPH的表达纯化的表达纯化 在在诱诱导导表表达达时时添添加加高高浓浓度度的的与与蛋蛋氨氨酸酸有有共共同同的的合合成成途途径径的的终终产产物物赖赖氨氨酸酸、苏苏氨氨酸酸、异异亮亮氨氨酸酸，以以及及与与赖赖氨氨酸酸具具有有相相互互协协同同作作用用的的苯苯丙丙氨氨酸酸、亮亮氨氨酸酸、缬缬氨氨酸酸来来抑抑制制正正常常菌菌株株中中蛋蛋氨氨酸酸的的合合成成，迫迫使使细细菌菌利利用用培培养养基基中中外外源源添添加加的的硒代蛋氨酸，合成硒代蛋氨酸硒代蛋氨酸，合成硒代蛋氨酸MPHMPH。由由于于硒硒代代蛋蛋氨氨酸酸不不稳稳定定而而易易发发生生氧氧化化，因因此此在在纯纯
33、化化时时需需要要加加快快速速度度，并并在在缓缓冲冲液液中中添添加加还还原原剂剂以以保保持持还还原原性性环环境境，如如5 5 mM mM-巯基乙醇。巯基乙醇。第46页，讲稿共122张，创作于星期三甲基对硫磷水解酶（甲基对硫磷水解酶（MPHMPH）P P1 1晶型的晶体晶型的晶体第47页，讲稿共122张，创作于星期三甲基对硫磷水解酶（甲基对硫磷水解酶（MPHMPH）P P4 43 32 21 12 2晶型的晶体晶型的晶体第48页，讲稿共122张，创作于星期三硒代蛋氨酸硒代蛋氨酸MPHMPH的晶体的晶体第49页，讲稿共122张，创作于星期三同源二聚体同源二聚体每个亚基含有一个由两个二价金属离子组成的
34、中心。每个亚基含有一个由两个二价金属离子组成的中心。Ala Ala 36 36 为为MPHMPH的的N N末末端端第第一一个个氨氨基基酸酸（不不具具有有1-351-35个个氨氨基基酸酸序序列的结构）。列的结构）。甲基对硫磷水解酶（甲基对硫磷水解酶（MPHMPH）三维结构图）三维结构图第50页，讲稿共122张，创作于星期三aba:The binuclear metal center of the OPH;b:The binuclear metal center of the MPH;MPH与与OPH双核金属中心结构比较双核金属中心结构比较第51页，讲稿共122张，创作于星期三a:The supp
35、osed leaving group subsite of the MPH;b:The leaving group subsite of the OPH;abMPHMPH与与OPHOPH双核金属中心附近氨基酸比较双核金属中心附近氨基酸比较推测：推测：Trp 179Trp 179，Phe 196Phe 196，Phe 119Phe 119是是MPHMPH底物结合部位的氨底物结合部位的氨基酸基酸第52页，讲稿共122张，创作于星期三甲基对硫磷水解酶中三个芳香族甲基对硫磷水解酶中三个芳香族 氨基酸的功能研究氨基酸的功能研究 在在MPHMPH三三维维结结构构基基础础上上可可以以看看出出Trp Trp
36、179179，Phe Phe 196196，Phe Phe 119119的的芳芳香香侧侧链链伸伸向向MPHMPH双双核核金金属属中中心心的的上上方方，处处于于活活性性中中心心的的入入口口处处，推推测测为为底物结合部位的氨基酸。底物结合部位的氨基酸。通通过过定定点点突突变变将将以以上上三三个个不不同同位位点点突突变变成成含含有有芳芳香香环环的的类类似似氨氨基基酸酸及及不不具具芳芳香香环环侧侧链链很很小小的的丙丙氨氨酸酸，从从而而获获得得了了针针对对Trp Trp 179179，Phe Phe 196196和和Phe Phe 119119三三个个位位点点的的六六个个突突变变体体W179FW179F
37、、W179AW179A、F196WF196W、F196AF196A、F119WF119W和和F119AF119A，系系统统比比较较了了突突变变体体与与野野生生酶酶的的催催化化动动力力学学特特点点，以以确确定定三三种种氨氨基基酸在酸在MPHMPH的结构和功能中的作用。的结构和功能中的作用。第53页，讲稿共122张，创作于星期三mpdmpd基因表达载体的构建基因表达载体的构建第54页，讲稿共122张，创作于星期三W179FW179F，W179AW179A，F196WF196W和和F196AF196A突变体基因的扩增突变体基因的扩增第55页，讲稿共122张，创作于星期三MPHMPH及其突变体的表达菌
38、株诱导表达产物的及其突变体的表达菌株诱导表达产物的SDS-PAGESDS-PAGE分析分析第56页，讲稿共122张，创作于星期三E.coli E.coli BL21(DE3)/pET5a-BL21(DE3)/pET5a-mpdmpd表达产物的表达产物的SDS-PAGESDS-PAGE分析分析第57页，讲稿共122张，创作于星期三EnzymeSpecificactivity（U/mg）Km(uM)Kcat(s-1)Kcat/Km(s-1mM-1)MPH50.5100%37.4100%37.1100%993.3100%W179F34.568.4%48.4129.6%30.682.5%632.663
39、.7%W179A8.416.6%74.6199.6%7.921.3%106.110.7%F196W64.0126.8%50.0133.7%52.8142.3%1056.8106.4%F196A4.89.6%107.4287.2%5.013.5%46.84.7%F119W29.257.8%28.275.5%20.856.1%738.874.4%F119A32.063.3%41.1109.9%23.863.9%578.358.2MPHMPH及其突变体的比活力及动力学参数及其突变体的比活力及动力学参数第58页，讲稿共122张，创作于星期三实验小结实验小结 利用生物信息学手段对利用生物信息学手段对MP
40、HMPH的结构基因的编码序列进行分的结构基因的编码序列进行分析，确定析，确定MPHMPH是一种结构未知的蛋白质，并在对其性质进行分是一种结构未知的蛋白质，并在对其性质进行分析预测的基础上，通过对析预测的基础上，通过对MPHMPH的纯化、结晶获得的纯化、结晶获得P P1 1晶型和晶型和P P4 43 32 21 12 2晶型晶型两种单晶以及硒标记两种单晶以及硒标记MPHMPH的晶体。通过合作利用的晶体。通过合作利用P P4 43 32 21 12 2晶型的晶体晶型的晶体解析了解析了MPHMPH的三维结构证实了的三维结构证实了MPHMPH与与OPHOPH功能上的相似性可能与两种功能上的相似性可能与
41、两种蛋白三维结构的相似性有关的推测。同时，在蛋白三维结构的相似性有关的推测。同时，在MPHMPH三维结构的基础上，三维结构的基础上，推测并通过定点突变及活性测定验证了推测并通过定点突变及活性测定验证了Trp 179Trp 179和和Phe 196Phe 196属于属于MPHMPH活性中心的底物结合部位关键氨基酸，活性中心的底物结合部位关键氨基酸，Phe 119Phe 119在与底物结在与底物结合中的作用不明显。合中的作用不明显。以上对于以上对于MPHMPH的结构和功能的关系的研究为的结构和功能的关系的研究为MPHMPH的改性和利用提供科学的依据。的改性和利用提供科学的依据。第59页，讲稿共12
42、2张，创作于星期三二、蛋白质分子拼接例如，有一种和癌症的发病有关的癌胚抗原例如，有一种和癌症的发病有关的癌胚抗原CEA（Carcinoembryonicantigen），是由七个大），是由七个大小和形状都非常相似的结构域拼接构成的，各结构域小和形状都非常相似的结构域拼接构成的，各结构域之间由柔韧性较大的之间由柔韧性较大的“铰链铰链”片段相连。研究发现，片段相连。研究发现，癌胚抗原的这种多结构域特征有利于它的细胞识别和癌胚抗原的这种多结构域特征有利于它的细胞识别和粘合作用。粘合作用。第60页，讲稿共122张，创作于星期三英国剑桥大学的英国剑桥大学的Winter等人利用分子剪裁技术成功地等人利用分
43、子剪裁技术成功地在抗体分子上作了实验在抗体分子上作了实验(人源化抗体人源化抗体)第61页，讲稿共122张，创作于星期三单链抗体scFv结构http:/ engnieer.htm)抗DON单链抗体改体研究DON:小麦镰刀菌毒素小麦镰刀菌毒素第62页，讲稿共122张，创作于星期三 单链抗体的linker改造GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGGSGGGGGGGSGGGVHVHVHVHVHVHVLVLVLVLVLVL第63页，讲稿共122张，创作于星期三单链抗体的改体模型单链抗体的改体模型VHVHVHVHVHVHLinker 12aa VVVVVVLinkerLinker 3
44、-12aa 3aaVVVVVHVHVHVH第64页，讲稿共122张，创作于星期三LinkerXhoSalISalEcoRIXho双双酶酶切切differentlength连接连接 技术路线EcoRI第65页，讲稿共122张，创作于星期三转转 化化筛选、检测筛选、检测 蛋白质的诱导生成蛋白质的诱导生成 表达载体构建表达载体构建 感受态细胞的制备感受态细胞的制备纯纯 化化亲和力初步测定亲和力初步测定第66页，讲稿共122张，创作于星期三 PCRPCR扩增重链、轻链策略扩增重链、轻链策略LinkerVHVLP3P4P5P6P7P8P1P2第67页，讲稿共122张，创作于星期三 PCR反应体系及反应条
45、件50 L反反应应体系如下：体系如下：10TaqPCRBuffer5LdNTP(2.5mM)3LForwardPrimer(20mM)1LReversePrimer(20mM)1LTemple1LrTaq0.3LAddddH2Otoafinalvolumeof50LPCRPCR循环条件为：循环条件为：94 5 min94 5 min，1 1个循环；个循环；94 45 s94 45 s，58 30s58 30s，72 45 s72 45 s，3131个循环；个循环；72 40 s72 40 s，2525个循环；个循环；72 7 min72 7 min，1 1个循环。取个循环。取PCRPCR产物产
46、物5 L5 L，1.01.0的琼脂糖电泳检测。的琼脂糖电泳检测。第68页，讲稿共122张，创作于星期三 V VH H 和和V VL L的的PCRPCR扩增结果扩增结果 7500150001000025001002505007501000200010002505000第69页，讲稿共122张，创作于星期三 菌落菌落PCRPCR重组子验证重组子验证123456712345671234567200010007505002501002000200010001000750750500500250250100第70页，讲稿共122张，创作于星期三 改体抗体在大肠杆菌改体抗体在大肠杆菌BL21BL21中的表
47、达中的表达及其纯化及其纯化 1234567897.4 KD66.2 KD42.7 KD31 KD第71页，讲稿共122张，创作于星期三 改体抗体的改体抗体的ELISAELISA初步测定初步测定312456789101112第72页，讲稿共122张，创作于星期三单链抗体单链抗体抗体：抗体：是体液免疫应答的主要效应是体液免疫应答的主要效应分子。分子。由两条相同的重链（由两条相同的重链（H链）链）和两条相同的轻链（和两条相同的轻链（L链）链）组成。组成。双特异性单链抗体的构建与表达双特异性单链抗体的构建与表达第73页，讲稿共122张，创作于星期三单链抗体（单链抗体（scFv）：）：抗体可变区的重链（
48、抗体可变区的重链（VH）与轻链（）与轻链（VL）通过一段多）通过一段多个氨基酸残基构成的弹性短肽（个氨基酸残基构成的弹性短肽（Linker）相连，融合表）相连，融合表达出来的抗体片断。达出来的抗体片断。第74页，讲稿共122张，创作于星期三双特异性单链抗体双特异性单链抗体能识别两种抗原并能与之结合的单链抗体（或抗体复能识别两种抗原并能与之结合的单链抗体（或抗体复合物）称为双特异性单链抗体。合物）称为双特异性单链抗体。本实验将能够各自产生抗本实验将能够各自产生抗DON毒素和抗毒素和抗ZEN毒素毒素的单链抗体基因，连接融合，表达出能同时与的单链抗体基因，连接融合，表达出能同时与DON和和ZEN两种
49、毒素抗原特异性结合的双特异性单链抗两种毒素抗原特异性结合的双特异性单链抗体。体。ZEN:玉米赤霉烯酮玉米赤霉烯酮DON:小麦镰刀菌毒素小麦镰刀菌毒素第75页，讲稿共122张，创作于星期三技术路线技术路线DON和和ZEN抗体基因的提取抗体基因的提取目的基因片段引物的设计目的基因片段引物的设计PCR扩增目的片段扩增目的片段制备感受态细胞制备感受态细胞酶切目的片段、载体，酶切目的片段、载体，linker连接连接转化连接产物转化连接产物酶切验证重组子酶切验证重组子表达、纯化蛋白表达、纯化蛋白第76页，讲稿共122张，创作于星期三载体的构建载体的构建Anti-ZENgeneAnti-DONgeneXho
50、EcoRSalNco连连接接Linker第77页，讲稿共122张，创作于星期三PCR扩增扩增Anti-DON基因基因 1 2 M20001000(bp)800 bp750250100500第78页，讲稿共122张，创作于星期三PCR扩增扩增Anti-ZEN基因基因 M 1 220001000750500250100(bp)750 bp第79页，讲稿共122张，创作于星期三重组验证重组验证第80页，讲稿共122张，创作于星期三PCR验证验证以重组质粒为模板，进行以重组质粒为模板，进行Anti-DON基因的基因的PCR分析。分析。第81页，讲稿共122张，创作于星期三双特异性抗体的表达双特异性抗体