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1、关于核酸核酸的理化性质第1页，讲稿共29张，创作于星期二一、核酸的一、核酸的一般理化性质一般理化性质1、状态：、状态：DNA为白色纤维状固体，为白色纤维状固体，RNA为白色粉末；为白色粉末；2、溶解性：、溶解性：微溶于水，不溶于一般有机溶剂（乙微溶于水，不溶于一般有机溶剂（乙醇沉淀核酸），其钠盐易溶于水；醇沉淀核酸），其钠盐易溶于水；3、粘度：、粘度：DNA的粘度极高，而的粘度极高，而RNA粘度要小得多；粘度要小得多；（一）物理性质（一）物理性质第2页，讲稿共29张，创作于星期二核酸酶核酸酶是指所有可以水解核酸的酶。是指所有可以水解核酸的酶。3,5-磷酸二酯键断裂磷酸二酯键断裂切割点不同，产物
2、不同，如切割点不同，产物不同，如3-单核苷酸，单核苷酸，5-单核苷单核苷酸酸水解磷酸二酯键的酶：水解磷酸二酯键的酶：核酸酶核酸酶（二）稳定性（二）稳定性核酸可被核酸可被酸、碱或酶酸、碱或酶水解成各种组分，即水解成各种组分，即核酸的核酸的降解降解第3页，讲稿共29张，创作于星期二（1）碱水解：）碱水解：RNA可在室温下被稀碱水解成核苷酸，可在室温下被稀碱水解成核苷酸，而而DNA对碱稳定。对碱稳定。例如，例如，在在0.1mol/L NaOH溶液中，溶液中，RNA几乎完全水解，随着磷酸二酯键的断裂，先生成几乎完全水解，随着磷酸二酯键的断裂，先生成2,3-环核苷酸中间物，最后生成环核苷酸中间物，最后生
3、成2-或或3-磷酸核苷的混磷酸核苷的混合物；合物；DNA由于不存在由于不存在2-OH，不能被碱水解。，不能被碱水解。利利用用上上述述性性质质可可测测定定RNA的的碱碱基基组组成成或或除除去去溶溶液液中的中的RNA。1 1、酸或碱水解酸或碱水解 DNA和和RNA对酸或碱的耐受程度不同。对酸或碱的耐受程度不同。第4页，讲稿共29张，创作于星期二（2 2）酸水解）酸水解 酸性条件下，磷酸二酯键比糖苷键稳定，酸性条件下，磷酸二酯键比糖苷键稳定，嘌呤嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键稳定性最差。与脱氧核糖之间的糖苷键稳定性最差。若对核酸进行酸水解，首先生成的是若对核酸进行酸水解，首先生成的是无嘌呤酸无嘌呤酸。因
4、。因此对核酸进行部分水解时，很少采用酸水解。此对核酸进行部分水解时，很少采用酸水解。1 1、酸或碱水解酸或碱水解 第5页，讲稿共29张，创作于星期二根据底物不同：根据底物不同：DNA水解酶（水解酶（DNase）RNA水解酶（水解酶（RNase）根据作用方式：根据作用方式：核酸外切酶核酸外切酶(限制性和非限制性限制性和非限制性)核酸内切酶核酸内切酶(53或或35)核核酸酸内内切切酶酶的的作作用用方方式式是是从从多多聚聚核核苷苷酸酸链链中中间间开开始始，在某个位点切断磷酸二酯键在某个位点切断磷酸二酯键核核酸酸外外切切酶酶的的作作用用方方式式是是从从多多聚聚核核苷苷酸酸链链的的一一端端（3-端端或或
5、5-端）开始，逐个水解切除核苷酸端）开始，逐个水解切除核苷酸3 3、酶水解、酶水解核酸酶分类核酸酶分类第6页，讲稿共29张，创作于星期二5533外切位点外切位点外切位点外切位点内切位点内切位点内切位点内切位点第7页，讲稿共29张，创作于星期二实验室常用的实验室常用的RNase有有3种：种：牛胰核糖核酸酶（牛胰核糖核酸酶（RNase I）：专一性内切酶，产物：专一性内切酶，产物为为3-嘧啶核苷酸及以嘧啶核苷酸及以3-嘧啶核苷酸为结尾的寡核苷酸。嘧啶核苷酸为结尾的寡核苷酸。核糖核酸酶核糖核酸酶T1：产物为产物为3-嘌呤核苷酸及以嘌呤核苷酸及以3-嘌呤嘌呤核苷酸为结尾的寡核苷酸。核苷酸为结尾的寡核苷
6、酸。核糖核酸酶核糖核酸酶T2：主要作用于：主要作用于Ap残基，将残基，将tRNA降解降解为为 3-腺苷酸为末端的寡核苷酸。腺苷酸为末端的寡核苷酸。3 3、酶水解、酶水解第8页，讲稿共29张，创作于星期二实验室常用的实验室常用的DNase有有2种：种：牛胰脱氧核糖核酸酶牛胰脱氧核糖核酸酶I（DNase I）：水解产物：水解产物为平均长度为为平均长度为4个个核苷酸，以核苷酸，以5-P为末端的寡聚核为末端的寡聚核苷酸。苷酸。牛胰脱氧核糖核酸酶牛胰脱氧核糖核酸酶II（DNase II）：）：水解产水解产物为平均长度为物为平均长度为6个个核苷酸，以核苷酸，以3-P为末端的寡聚核为末端的寡聚核苷酸。苷酸。
7、3 3、酶水解、酶水解第9页，讲稿共29张，创作于星期二 非非特特异异性性核核酸酸酶酶：即即水水解解DNA又又水水解解RNA的的酶酶。有有些些非非特特异异性性核核酸酸酶酶也也作作为为工工具具酶酶应应用用到到科科学学研研究究中中。如如：蛇蛇毒毒磷磷酸酸二二酯酯酶酶和和脾脾磷磷酸酸二二酯酯酶酶均均是是水水解解DNA和和RNA的的外外切切核核酸酸酶酶。前前者者从从3端端开开始始，生生成成5单单核核苷苷酸酸，后后者者从从 5末末端端开开始始，生成生成3单核苷酸单核苷酸。D-核核糖糖与与浓浓盐盐酸酸和和苔苔黑黑酚酚（甲甲基基间间苯苯二二酚酚）共共热热产产生生绿色绿色；D-2-脱氧核糖与酸和二苯胺一同加热
8、产生脱氧核糖与酸和二苯胺一同加热产生蓝紫色。蓝紫色。以此区别以此区别DNA和和RNA，或作为定量测定基础。，或作为定量测定基础。第10页，讲稿共29张，创作于星期二二、核酸的紫外吸收二、核酸的紫外吸收第11页，讲稿共29张，创作于星期二DNA或或RNA的定量的定量A260=1.0 相当于相当于 50g/ml 双链双链DNA(dsDNA)40g/ml 单链单链DNA(ssDNA or RNA)20g/ml 寡核苷酸寡核苷酸确定样品中核酸的纯度确定样品中核酸的纯度 纯纯 DNA:A260/A280=1.8纯纯 RNA:A260/A280=2.0n紫外吸收的应用紫外吸收的应用第12页，讲稿共29张，
9、创作于星期二n与蛋白质相似，核酸分子中既含有与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）酸性基团（磷酸基）也含有也含有碱性基团（氨基），碱性基团（氨基），因而核酸也具有因而核酸也具有两性性质。两性性质。由于核酸分子中的由于核酸分子中的磷酸磷酸是一个是一个中等强度的酸中等强度的酸，而碱性，而碱性（氨基）（氨基）是一个是一个弱碱弱碱，所以核酸的，所以核酸的等电点比较低。等电点比较低。如如DNA的等电点为的等电点为44.5，RNA的等电点为的等电点为22.5。三、核酸的酸碱性质及等电点三、核酸的酸碱性质及等电点第13页，讲稿共29张，创作于星期二1、概念：概念：指核酸的双螺旋区的指核酸的双螺旋区
10、的氢键断裂氢键断裂，空间结构破，空间结构破坏，形成单链无规则线团状态的过程坏，形成单链无规则线团状态的过程2、变性因素：、变性因素：加热、酸碱度改变、有机溶剂、酰胺、加热、酸碱度改变、有机溶剂、酰胺、尿素等。尿素等。3、DNA变性的实质变性的实质：DNA双链间氢键的断裂，生物双链间氢键的断裂，生物活性丧失。活性丧失。四、核酸的变性、复性与杂交四、核酸的变性、复性与杂交（一）核酸的变性（一）核酸的变性第14页，讲稿共29张，创作于星期二第15页，讲稿共29张，创作于星期二4、特点：、特点：并不涉及共价键的断裂并不涉及共价键的断裂，即磷酸二酯键不，即磷酸二酯键不发生断裂，因此一级结构不发生变化。发
11、生断裂，因此一级结构不发生变化。5、变性后其它理化性质变化：、变性后其它理化性质变化：OD260增高；粘度增高；粘度下降；比旋度下降；浮力密度升高；酸碱滴定曲线改变。下降；比旋度下降；浮力密度升高；酸碱滴定曲线改变。（一）核酸的变性（一）核酸的变性第16页，讲稿共29张，创作于星期二增增色色效效应应(hyperchromic effect)：DNA变变性性时时其其溶液溶液OD260增高增高的现象。的现象。6、DNA的热变性和熔解温度（的热变性和熔解温度（Tm）第17页，讲稿共29张，创作于星期二nDNA的解的解链链曲线曲线连连续续加加热热DNA的的过过程程中中以以温温度度相相对对于于A260值
12、值作作图图，所所得得的的曲曲线线称称为为解链曲线解链曲线。解解链链过过程程中中，紫紫外外吸吸光光度度的的变变化化达达到到最最大大变变化化值值的的一一半半时时所所对对应应的的温温度度，称称为为熔熔解解温温度度，用用Tm表表示示，也称解链温度。也称解链温度。熔解温度熔解温度(melting temperature,Tm)第18页，讲稿共29张，创作于星期二（1）G-C对对含含量量：G-C的的含含量量高高，Tm值值高高。因因而而测测定定Tm值值，可可反反映映DNA分分子子中中G、C含含量量，可可通通过过经经验验公式计算：公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)2.44（2）溶溶液液的的离离子子强强
13、度度：离离子子强强度度较较低低的的介介质质中中DNA的的Tm较低。在纯水中，较低。在纯水中，DNA在室温下变性。在室温下变性。（3）溶液的）溶液的pH值和变性剂值和变性剂影响影响Tm的因素的因素第19页，讲稿共29张，创作于星期二1、复性、复性：变性：变性DNA在适当条件下，两条彼此在适当条件下，两条彼此分开的单链重新缔合成为双螺旋结构的过程分开的单链重新缔合成为双螺旋结构的过程退退火火：将将热热变变性性的的DNA骤骤然然冷冷却却至至低低温温时时，DNA不不可可能能复复性性。但但是是将将变变性性的的DNA缓缓慢慢冷冷却却时，可以复性，又称时，可以复性，又称“退火退火”。（二）核酸的复性（二）核
14、酸的复性第20页，讲稿共29张，创作于星期二2、复性表现：、复性表现：许多理化性质可恢复，生物活许多理化性质可恢复，生物活性得以性得以部分恢复部分恢复。3、影响复性的因素：、影响复性的因素：分子量越大复性越难；分子量越大复性越难；浓度越大，复性越容易；浓度越大，复性越容易；DNA的复性也与的复性也与它本身的组成和结构有关。它本身的组成和结构有关。DNA复性的程复性的程度、速率与复性过程的条件有关。度、速率与复性过程的条件有关。（二）核酸的复性（二）核酸的复性第21页，讲稿共29张，创作于星期二DNA复性复性第22页，讲稿共29张，创作于星期二 核酸杂交核酸杂交：核酸变性后进行复性的过程中，来：
15、核酸变性后进行复性的过程中，来源不同的源不同的DNA（或（或RNA）片段，按碱基互补关系）片段，按碱基互补关系形成杂交双链分子的过程。形成杂交双链分子的过程。杂交双链可在杂交双链可在DNA与与DNA链之间，也可在链之间，也可在RNA与与DNA链之间形成。链之间形成。杂交的本质杂交的本质就是在一定就是在一定条件下使互补核酸链实现复性。条件下使互补核酸链实现复性。核酸的杂交在核酸的杂交在分子生物学和遗传学分子生物学和遗传学的研究中的研究中具有重要意义。具有重要意义。（三）核酸的杂交（三）核酸的杂交第23页，讲稿共29张，创作于星期二n核酸分子杂交核酸分子杂交第24页，讲稿共29张，创作于星期二第25页，讲稿共29张，创作于星期二应用最广。应用最广。原理：原理：碱基配对；碱基配对；聚合酶可催化在试管内合聚合酶可催化在试管内合成与模板互补的成与模板互补的 DNA新新链；链；双脱氧核苷酸无双脱氧核苷酸无3-OH，合，合成到此终止；成到此终止；可电泳分离随机得到的大可电泳分离随机得到的大小不等的片段。小不等的片段。六、核酸序列测定六、核酸序列测定Sanger法法第26页，讲稿共29张，创作于星期二双脱氧法第27页，讲稿共29张，创作于星期二核核酸酸序序列列测测定定第28页，讲稿共29张，创作于星期二感谢大家观看第29页，讲稿共29张，创作于星期二