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1、关于流式细胞术(2)第1页，讲稿共45张，创作于星期二流式细胞术简介流式细胞仪简介流式细胞术应用样品的准备结果分析第2页，讲稿共45张，创作于星期二流式细胞术简介流式细胞术(FlowCytometry,FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体,同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。第3页，讲稿共45张，创作于星期二流式细胞仪简介流式细胞仪（FlowCytometer简称FCM）是一项集激光
2、技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。概括来说，流式细胞术就是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数的、快速的定量分析和分选的技术。随着各相关技术的迅速发展，FCM技术已经成为日益完善的细胞分析和分选的工具.第4页，讲稿共45张，创作于星期二流式细胞仪简介流动室及液流驱动系统激光光源及光束形成系统光学系统信号检测与存储、显示、分析系统细胞分选系统第5页，讲稿共45张，创作于星期二第6页，讲稿共45张，创作于星期二第7页，讲稿共45张，创作于星期二第8页，讲稿共45张，创作于星期二第9页，讲稿共45张，创作于星期二第
3、10页，讲稿共45张，创作于星期二第11页，讲稿共45张，创作于星期二第12页，讲稿共45张，创作于星期二第13页，讲稿共45张，创作于星期二第14页，讲稿共45张，创作于星期二第15页，讲稿共45张，创作于星期二第16页，讲稿共45张，创作于星期二流式细胞术应用细胞生物学：细胞生物学：细胞凋亡研究细胞凋亡研究；定量分析细胞周期并分选不同细胞周期时相的细胞；分析生物大分子如DNADNA、RNARNA、抗原、癌基因表达产物等物质与细胞增殖周期的关系，、抗原、癌基因表达产物等物质与细胞增殖周期的关系，进行染色体核型分析，并可纯化进行染色体核型分析，并可纯化X X或Y Y染色体。染色体。肿瘤学：肿瘤
4、学：DNA倍体含量测定是鉴别良、恶性肿瘤的特异指标。近年来已应用DNA倍体测定技术，对白血病、淋巴瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多种实体瘤细胞进行探测。用单克降抗体技术清除血液中的肿瘤细胞。第17页，讲稿共45张，创作于星期二免疫学：研究细胞周期或DNA倍体与细胞表面受体及抗原表达的关系；进行免疫活性细胞的分型与纯化；分析淋巴细胞亚群与疾病的关系；免疫缺陷病如艾滋病的诊断；器官移植后的免疫学监测等。药物学：检测药物在细胞中的分布，研究药的作用机制，亦可用于筛选新药，如化疗药物对肿瘤的凋亡机制，可通过测DNA凋亡峰，Bcl-2凋亡调节蛋白等。第18页，讲稿共45张，创作于星期二血液学：血液细胞的分
5、类、分型，造血细胞分化的研究，血细胞中各种酶的定量分析，如过氧化物酶、非特异性酯酶等；用NBT及DNA双染色法可研究白血病细胞分化成熟与细胞增殖周期变化的关系，检测母体血液中Rh(+)或抗D抗原阳性细胞，以了解胎儿是否可能因Rh血型不合而发生严重溶血；检测血液中循环免疫复合物可以诊断自身免疫性疾病，如红斑狼疮等。第19页，讲稿共45张，创作于星期二样品的准备主要是测量群体中单个细胞经适当染色后其成分所发出的散射光和荧光，经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞经过焦点时，发出一束散射光/或荧光。它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器(光电倍增管或一个固态装置)，光检测器
6、把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析。第20页，讲稿共45张，创作于星期二细胞凋亡研究细胞凋亡研究细胞凋亡是细胞在基因控制下的有序死亡，在疾病发生、发展中有重要作用，因而研究细胞凋亡有重要意义。细胞凋亡检测方法很多，应用流式细胞仪技术可根据细胞在凋亡过程中发生一系列形态、生化变化从多个角度对细胞凋亡进行定性和定量的测定。第21页，讲稿共45张，创作于星期二细胞形态变化：通过流式细胞仪测定细胞光散射的变化来观察细胞凋亡。在细胞凋亡早期，细胞前向角光散射的能力显著降低，90角光散射的能力增加；在细胞凋亡晚期，前向角和90角光散
7、射的信号均降低。此方法特异性不强，目前使用较少。第22页，讲稿共45张，创作于星期二细胞膜功能改变：（1）磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserinePS）异位：正常情况下，PS位于细胞膜内层，细胞发生凋亡时PS从细胞膜内翻转并暴露在细胞膜外层，是细胞发生凋亡的早期事件。PS与Annexin（一种具有强力抗凝作用的血管蛋白）具有高度亲和力。第23页，讲稿共45张，创作于星期二Flow cytometry of apoptotic cell death Phospholipid redistribution Phospholipid redistribution第24页，讲稿共45张，创作
8、于星期二应用流式细胞仪采用FITC-Annexin/PI双染法进行细胞凋亡检测，可同时描述三群不同状态细胞：FITC-Annexin-/PI-细胞，即正常活力细胞；FITC-Annexin+/PI-细胞，即凋亡细胞；FITC-Annexin+/PI+细胞，即已死亡细胞。此种方法操作过程简单，指标敏感，应用者越来越多。第25页，讲稿共45张，创作于星期二第26页，讲稿共45张，创作于星期二 PI/Hoechst33342双染法：Hoechst33342Hoechst33342（HO）是一种DNA的特异性荧光染料，可通过完整细胞膜，应用PI/Hoechst33342PI/Hoechst33342可
9、将细胞分为三群：正常活细胞（HOHO强/PI-），凋亡细胞（HOHO弱/PI-），（由于凋亡细胞发），（由于凋亡细胞发生生DNADNA降解和丢失，导致降解和丢失，导致HOHO荧光减弱），死亡细胞（HO弱弱/PI+/PI+）。此种方法再结合凋亡细胞前向角光散射能力降）。此种方法再结合凋亡细胞前向角光散射能力降低的特点，能更好地鉴定凋亡细胞，但低的特点，能更好地鉴定凋亡细胞，但HO须紫外光激发，须紫外光激发，由于很多流式细胞仪不配有紫外激光，故此法应用受限。由于很多流式细胞仪不配有紫外激光，故此法应用受限。第27页，讲稿共45张，创作于星期二吖啶橙吖啶橙(AO)/(AO)/溴化乙啶(EB)(EB)
10、双染法双染法:AO:AO是一种异染性荧光染料,可通过完整的质膜可通过完整的质膜,它与核酸的结合主要是嵌入DNA双链的碱基之间，其发射峰为双链的碱基之间，其发射峰为530nm，呈绿色荧光。EB的理化特性与的理化特性与PI相似，不能通过完整质膜。应用相似，不能通过完整质膜。应用AO/EB双染法也可以将细胞分成三群：正常活细胞（AOAO强强/EB-），凋亡细胞（AOAO弱弱/EB-/EB-），死亡细胞（AOAO弱弱/EB+），原理与），原理与PI/Hoechst33342PI/Hoechst33342双染法相似，不同的是AO/EB双染法所的激发光是被广泛使用的氩激光（488nm488nm），而不须紫
11、外光，其缺点是染色过程较复杂，且AOAO易污染设备管道，因此使用此法者较少。易污染设备管道，因此使用此法者较少。第28页，讲稿共45张，创作于星期二放线菌素放线菌素D(7-AAD)D(7-AAD)染色法：染色法：7-AAD7-AAD是一种核酸染料，它不能通过正是一种核酸染料，它不能通过正常质膜，随着细胞凋亡、细胞死亡过程，质膜对常质膜，随着细胞凋亡、细胞死亡过程，质膜对7-AAD7-AAD的通透性逐渐的通透性逐渐增加，结合细胞凋亡中增加，结合细胞凋亡中DNADNA的有控降解，最后通过的有控降解，最后通过7-AAD7-AAD标记标记DNADNA的强弱，将细胞分为三群：的强弱，将细胞分为三群：7-
12、AAD7-AAD强为死亡细胞，强为死亡细胞，7-AAD7-AAD弱是弱是凋亡细胞，凋亡细胞，7-AAD-7-AAD-为正常活力细胞。此法具有染色快速、简便、为正常活力细胞。此法具有染色快速、简便、价格便宜等优点。另外，由于此法不破坏细胞膜，故还可联合价格便宜等优点。另外，由于此法不破坏细胞膜，故还可联合使用使用FITCFITC、PEPE标记的膜蛋白标记的膜蛋白,对特殊细胞群及亚群进行多色荧光分析对特殊细胞群及亚群进行多色荧光分析(虽然虽然AO/EBAO/EB双染法也不破坏被检细胞膜双染法也不破坏被检细胞膜,但由于但由于AOAO及及EBEB的发射光波的发射光波谱分别与谱分别与FITCFITC和和
13、PEPE的发射光波谱相似，故的发射光波谱相似，故AO/EBAO/EB法不能与法不能与FITCFITC和和或或PEPE联合使用联合使用)。此法是应用核酸染料测定细胞凋亡的流式细胞。此法是应用核酸染料测定细胞凋亡的流式细胞仪法中十分实用的方法。仪法中十分实用的方法。第29页，讲稿共45张，创作于星期二细胞器改变：细胞器改变：线粒体膜线粒体膜APO2.7APO2.7蛋白表达：早期凋亡细胞的线粒体蛋白表达：早期凋亡细胞的线粒体膜出现膜出现APO2.7APO2.7蛋白表达，利用荧光标记的单克隆抗体，运用流式细蛋白表达，利用荧光标记的单克隆抗体，运用流式细胞术可以检测早期凋亡细胞。胞术可以检测早期凋亡细胞
14、。DNADNA含量变化：含量变化：主要是主要是PIPI染色法，由于凋亡细胞染色法，由于凋亡细胞DNADNA发生有序降解，被降解的发生有序降解，被降解的低分子量低分子量DNADNA片段从变性细胞膜（经乙醇及透膜剂处理）漏出细片段从变性细胞膜（经乙醇及透膜剂处理）漏出细胞外，使得凋亡细胞内的胞外，使得凋亡细胞内的DNADNA含量减低，在流式细胞仪测定细胞含量减低，在流式细胞仪测定细胞DNADNA含量直方图中含量直方图中G1G1峰前可出现亚二倍体峰，即所谓凋亡峰。峰前可出现亚二倍体峰，即所谓凋亡峰。通过测定凋亡峰百分含量，便可知凋亡细胞比例。此法简便、通过测定凋亡峰百分含量，便可知凋亡细胞比例。此法
15、简便、快速，是目前常用的、经典的测量凋亡细胞的方法。此法存在快速，是目前常用的、经典的测量凋亡细胞的方法。此法存在问题：少量的正常的低问题：少量的正常的低DNADNA含量细胞、由于机械损伤产生含量细胞、由于机械损伤产生DNADNA含量减低的坏死细胞、染色体丢失的分裂相细胞以及细胞碎片和含量减低的坏死细胞、染色体丢失的分裂相细胞以及细胞碎片和微核等都可能出现在亚二倍体峰内。因此，此法的特异性较低。微核等都可能出现在亚二倍体峰内。因此，此法的特异性较低。第30页，讲稿共45张，创作于星期二DNADNA断裂点标记：细胞凋亡时发生断裂点标记：细胞凋亡时发生DNADNA断裂,利用末端转移利用末端转移酶酶
16、(TdT)可以将dUTPdUTP标记到断裂点上标记到断裂点上,称作原位缺口末端标记（TUNELTUNEL）技术。此法有直接标记和间接标记两种，前者的标记物是FITC-dUTPFITC-dUTP，后者的标记物是生物素(biotin)标记的标记的dUTP,需要再用需要再用FITCFITC标记的亲和素标记的亲和素(avidin)与生物素标记的dUTP结合，使标记反应倍增，故间接标记法灵敏度高，但操作较复杂。TUNEL还可以配合其它单抗同时进行细胞表型分析，或与DNADNA含量同时分析。TUNEL法因其灵敏度高而被广泛采用。第31页，讲稿共45张，创作于星期二细胞凋亡相关基因产物检测：细胞凋亡是一个多
17、种基因参与的复杂过程,目前已知与bcl-2基因、c-myc基因、P53基因等有关，这些基因都有相关产物，目前针对这些相关产物已有单克隆抗体生产，应用这些单抗，通过流式细胞仪可检测造血细胞凋亡相关基因蛋白表达水平，相互关系。第32页，讲稿共45张，创作于星期二流式细胞仪测定细胞凋亡方法、层次众多，且具有快速、准确特点，应用十分广泛。在实际应用中应注意采用多种方法结合使用，使结果更加可靠准确。第33页，讲稿共45张，创作于星期二细胞凋亡流式检测固定细胞的染色方法非固定细胞的染色方法第34页，讲稿共45张，创作于星期二固定细胞的染色方法第35页，讲稿共45张，创作于星期二PI单染色法单染色法（1）1
18、 1收集细胞（收集细胞（1 15 5）106106个，个，5005001000r/min1000r/min离心离心5min5min，弃去培，弃去培养液。养液。2 23mlPBS3mlPBS洗一次。洗一次。3 3离心去离心去PBSPBS，加入冰预冷的，加入冰预冷的7070的乙醇固定，的乙醇固定，4 4，1h1h。4 4离心弃去固定液，离心弃去固定液，3mlPBS3mlPBS重悬重悬5min5min。5 5400400目的筛网过滤目的筛网过滤1 1次，次，5005001000r/min1000r/min离心离心5min5min，弃去，弃去PBSPBS。6 6用用1mlPI1mlPI染液，染液，4
19、4避光避光30min30min。7 7流式细胞仪检测：流式细胞仪检测：PIPI用氩离子激发荧光，激发光波波长为用氩离子激发荧光，激发光波波长为488nm488nm，发射光波波长大于，发射光波波长大于630nm630nm，产生红色荧光，可分析前散射，产生红色荧光，可分析前散射光对侧散射光的散点图及光对侧散射光的散点图及PIPI荧光的直方图。荧光的直方图。第36页，讲稿共45张，创作于星期二PI单染色法单染色法（2）1 1收集细胞（收集细胞（11061106个），个），5005001000r/min1000r/min离心离心5min5min，弃去培养液。，弃去培养液。2 21mlPBS/FCS1m
20、lPBS/FCS洗一次。洗一次。3 35005001000r/min1000r/min离心离心5min5min去去PBS/FCSPBS/FCS，加入，加入500lPBS/FCS500lPBS/FCS和和500l500l的多聚甲醛的多聚甲醛固定液，轻轻混匀，在固定液，轻轻混匀，在4 4下固定下固定4min4min。4 45005001000r/min1000r/min离心离心5min5min弃去固定液，室温加入含弃去固定液，室温加入含0.20.2 TweenTween的的PBS1mlPBS1ml，3737孵育孵育15min15min。5 51mlPBS/FCS1mlPBS/FCS洗洗3 3次，每
21、次次，每次5min5min。6 6400400目的筛网过滤目的筛网过滤1 1次。次。7 75005001000r/min1000r/min离心离心5min5min去去PBS/FCSPBS/FCS，用，用1.0mlPI1.0mlPI染液，染液，4 4避光至少避光至少30min30min。染色在染色在24h24h之内皆可行，流式细胞仪分析。之内皆可行，流式细胞仪分析。第37页，讲稿共45张，创作于星期二调亡细胞的调亡细胞的TUNEL的流式细胞仪分析的流式细胞仪分析1 1离心收集细胞，离心收集细胞，PBSPBS洗洗1 12 2次。次。2 21 1多聚甲醛低温下固定多聚甲醛低温下固定15min15mi
22、n。3 33mlPBS3mlPBS洗洗1 1次，次，7070乙醇固定，冰箱内放置乙醇固定，冰箱内放置1 13 3天。天。4 4PBSPBS轻洗轻洗1 1次次5 5细胞与细胞与TdTTdT标记液标记液3737孵育，时间孵育，时间1 12h2h。6 6PBSPBS轻洗轻洗1 1次。次。7 7细胞在黑暗中细胞在黑暗中3737与与100l100l的染色缓冲液孵育的染色缓冲液孵育30min30min。8 8含含0.10.1 Triton-X100Triton-X100的的PBSPBS轻洗轻洗1 1次。次。9 91mlPBS1mlPBS（含（含5mg/mlPI,0.1%RNaseA5mg/mlPI,0.1
23、%RNaseA）重悬。）重悬。1010 流式细胞仪分析红色（流式细胞仪分析红色（PIPI）对绿色荧光（）对绿色荧光（FITCFITC）的地形图。）的地形图。第38页，讲稿共45张，创作于星期二ISNT的流式细胞仪分析的流式细胞仪分析1 1离心收集细胞，离心收集细胞，PBSPBS洗洗1 12 2次次2 21 1多聚甲醛低温下固定多聚甲醛低温下固定15min15min。3 33mlPBS3mlPBS洗洗1 1次，次，7070乙醇固定，冰箱内放置乙醇固定，冰箱内放置1 13 3天。天。4 4PBSPBS轻洗轻洗1 1次。次。5 521052105细胞与细胞与12.5l12.5l的缺口平移缓冲液在的缺
24、口平移缓冲液在1515共孵育共孵育6h6h，每过，每过15min15min振动振动1 1次。次。6 6PBSPBS轻洗轻洗1 1次。次。7 7细胞在黑暗中细胞在黑暗中3737与与100l100l的染色缓冲液孵育的染色缓冲液孵育30min30min。8 8含含0.10.1 Triton-X100Triton-X100的的PBSPBS轻洗轻洗1 1次。次。9 91mlPBS1mlPBS（含（含5mg/mlPI,0.1%RNaseA5mg/mlPI,0.1%RNaseA）重悬。）重悬。1010 流式细胞仪分析红色（流式细胞仪分析红色（PIPI）对绿色荧光（）对绿色荧光（FITCFITC）的地形图）的
25、地形图第39页，讲稿共45张，创作于星期二非固定细胞的染色方法第40页，讲稿共45张，创作于星期二Hoechst 33342/PI双染色法双染色法1悬浮生长的细胞在培养状态下加入悬浮生长的细胞在培养状态下加入Heochst33342Heochst33342，终浓度为1g/ml；帖壁生长的细胞用含有0.020.02EDTAEDTA的的0.25胰蛋白酶消化成单细胞悬液，离心，弃上清，用1ml1ml全培养液重悬细胞，加入Heochst33342，终浓度，终浓度为为1g/ml1g/ml，37孵育710min。2 24 45005001000r/min离心弃去染液。3加入加入1.0mlPI染液，染液，4
26、 4避光染色15min15min。4 4400目的筛网过滤1 1次。5 5流式细胞仪分析。第41页，讲稿共45张，创作于星期二Annexin V/PI双染色法双染色法1 1细胞收集：悬浮细胞直接收集细胞收集：悬浮细胞直接收集10ml10ml的离心管中，而帖壁细胞的离心管中，而帖壁细胞先用滴管轻轻吹打，调亡细胞一经吹打可能脱壁，收集到先用滴管轻轻吹打，调亡细胞一经吹打可能脱壁，收集到10ml10ml的离的离心管中，没脱壁的细胞用心管中，没脱壁的细胞用0.020.02的的EDTAEDTA消化使之脱壁，每样本消化使之脱壁，每样本细胞数为（细胞数为（1 15 5）106106，5005001000r/
27、min1000r/min离心离心5min5min弃去培养液。弃去培养液。2 2用孵育缓冲液洗用孵育缓冲液洗1 1次，次，5005001000r/min1000r/min离心离心5min5min。3 3用用100l100l的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育101015min15min。4 45005001000r/min1000r/min离心离心5min5min沉淀细胞，孵育缓冲液洗沉淀细胞，孵育缓冲液洗1 1次。次。5 5加入荧光溶液加入荧光溶液4 4下孵育下孵育20min20min，避光并不时振动。，避光并不时振动。第42页，讲稿共45张，创作于星期二结果分析Annexin VAnnexin VPIPI第43页，讲稿共45张，创作于星期二谢谢第44页，讲稿共45张，创作于星期二感谢大家观看第45页，讲稿共45张，创作于星期二