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1、关于现代分子生物学第五章第1页，讲稿共85张，创作于星期二基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心与基本技术。第2页，讲稿共85张，创作于星期二基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。第3页，讲稿共85张，创作于星期二基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细
2、胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。第4页，讲稿共85张，创作于星期二第5页，讲稿共85张，创作于星期二5.1重组DNA技术回顾三大成就：第一，在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质解决了遗传的物质基础问题；第二，50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制解决了基因的自我复制和世代交替问题；第6页，讲稿共85张，创作于星期二第三，50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码阐明了遗传信息的流动与表达机制。第7页，讲稿共85张，创作于星期二表表5-1重组重组DNA技术史上的主要事件技术史上的
3、主要事件年年份份事事件件1869FMiescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。1957A.Kornberg从大肠杆菌中发现了从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶聚合酶I。1959-1960Ochoa发发现现RNA聚聚合合酶酶和和信信使使RNA，并并证证明明mRNA决决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。定了蛋白质分子中的氨基酸序列。1961Nirenberg破破译译了了第第一一个个遗遗传传密密码码；Jacob和和Monod提提出了调节基因表达的操纵子模型。出了调节基因表达的操纵子模型。1964Yanofsky和和Brenner等等人人证证明明，多多肽肽链链上上的的氨氨基基酸
4、酸序序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。1965Holley完完成成了了酵酵母母丙丙氨氨酸酸tRNA的的全全序序列列测测定定；科科学学家家证明细菌的抗药性通常由证明细菌的抗药性通常由“质粒质粒”DNA所决定。所决定。第8页，讲稿共85张，创作于星期二1966Nirenberg，Ochoa，Khorana，Crick等人破译了全部遗传密码。等人破译了全部遗传密码。1967第一次发现第一次发现DNA连接酶连接酶1970Smith，Wilcox和和Kelley分分离离了了第第一一种种限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶，Temin和和Baltimore从
5、从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。肿瘤病毒中发现反转录酶。1972-1973Boyer，Berg等等人人发发展展了了DNA重重组组技技术术，于于72年年获获得得第第一一个个重重组组DNA分子，分子，73年完成第一例细菌基因克隆。年完成第一例细菌基因克隆。1975-1977Sanger与与Maxam和和Gilbert等等人人发发明明了了DNA序序列列测测定定技技术术，1977年年完完成了全长成了全长5387bp的噬菌体的噬菌体x174基因组测定。基因组测定。1978首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。1980美国联
6、邦最高法院裁定微生物基因工程可以被专利化。美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以被专利化。1981Palmiter和和Brinster获获得得转转基基因因小小鼠鼠，Spradling和和Rubin得得到到转转基基因因果蝇。果蝇。1982美美、英英批批准准使使用用第第一一例例基基因因工工程程药药物物胰胰岛岛素素，Sanger等等人人完完成成了入噬菌体了入噬菌体48,502bp全序列测定。全序列测定。第9页，讲稿共85张，创作于星期二1983获得第一例转基因植物。获得第一例转基因植物。1984斯坦福大学获得关于重组斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。的专利。1986GMO首次在环境中释放。首次在环
7、境中释放。1988Watson出任出任“人类基因组计划人类基因组计划”首席科学家。首席科学家。1989DuPont公司获得转肿瘤基因小鼠公司获得转肿瘤基因小鼠“Oncomouse”。1992欧欧共共体体35个个实实验验室室联联合合完完成成酵酵母母第第三三染染色色体体全全序序列列测测定定(315kb)。1994第一批基因工程西红柿在美国上市。第一批基因工程西红柿在美国上市。1996完成了酵母基因组完成了酵母基因组(1.25107bp)全序列测定。全序列测定。1997英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。2000完完 成成 第第 一一 个个 高高 等等 植植 物物 拟
8、拟 南南 芥芥 的的 全全 序序 列列 测测 定定（(1.15108bp)。2001完成第一个人类基因组全序列测定完成第一个人类基因组全序列测定(2.7109bp)。第10页，讲稿共85张，创作于星期二限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端或平端的小片段。（1）限制性核酸内切酶）限制性核酸内切酶第11页，讲稿共85张，创作于星期二图图5-1几种主要几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶内切酶所识别的序列及其酶切末端切
9、末端。第12页，讲稿共85张，创作于星期二图图5-2DNA连接酶能把不同的连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体。片段连接成一个整体。a.DNA的的粘粘性性末末端端;b.DNA的的平平末末端端;c.化化学学合合成成的的具具有有EcoRI粘粘性性末末端的端的DNA片段。片段。（2）DNA连接酶连接酶第13页，讲稿共85张，创作于星期二 仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体（vector）。病毒、噬菌体和质粒等小分子量
10、复制子都可以作为基因导入的载体。（3）分子克隆的载体）分子克隆的载体第14页，讲稿共85张，创作于星期二图图5-3重组重组DNA操作过程示意图操作过程示意图第15页，讲稿共85张，创作于星期二目的基因的表达目的基因的表达第16页，讲稿共85张，创作于星期二第17页，讲稿共85张，创作于星期二第18页，讲稿共85张，创作于星期二第19页，讲稿共85张，创作于星期二第20页，讲稿共85张，创作于星期二5.2DNA基本操作技术基本操作技术5.2.1核酸凝胶电泳技术核酸凝胶电泳技术自 从 琼 脂 糖（agarose）和 聚 丙 烯 酰 胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量
11、大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。第21页，讲稿共85张，创作于星期二一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。第22页，讲稿共85张，创作于星期二 生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，所以，DNA和RNA又被称为多聚阴离子（polyanions），在电场中向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的
12、速度向正电极方向迁移。第23页，讲稿共85张，创作于星期二琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.250kb之间。聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。第24页，讲稿共85张，创作于星期二表5-2琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力凝胶类型及浓度分离DNA的大小范围（bp）0.3%琼脂糖5000010000.7%琼脂糖2000010001.4%琼脂糖60003004.0%聚丙烯酰胺100010010.0%聚丙烯酰胺5002520.0%聚丙烯酰胺501第25页，讲稿共85张，创作于星期二 在凝胶电泳中，加
13、入溴化乙锭（ethidiumbromide，EtBr）染料对核酸分子进行染色，然后放置在紫外光下观察，可灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05g的微量DNA，也可以被清晰地检测出来。第26页，讲稿共85张，创作于星期二溴化乙锭是一种具扁平分子的核酸染料，能插入到DNA或RNA分子的相邻碱基之间，并在300nm波长的紫外光照射下发出荧光。第27页，讲稿共85张，创作于星期二图图5-4溴化乙锭染料的化学结构及其对溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光
14、照射下，琼脂糖凝胶电泳中电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。第28页，讲稿共85张，创作于星期二第29页，讲稿共85张，创作于星期二5.2.2细菌转化与目标细菌转化与目标DNA分子的增殖分子的增殖 所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。第30页，讲稿共85张，创作于星期二转化转化(transformation)特指以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。转染转染(transfection)是指噬
15、菌体、病毒或以它作为载体构成的重组子导入细胞的过程。转导转导(transduction)以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌的过程。上述概念往往容易混淆。第31页，讲稿共85张，创作于星期二转化是一个自然存在的过程。细菌处于容易吸收外源DNA状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。重组DNA转化细菌的技术操作关键就是通过化学方法，人工诱导细菌细胞进入一个敏感的感受态，以便外源DNA进入细菌内。这项技术始于Mandel和Higa1970年的观察，他们发现细菌经过冰冷的CaCl2溶液处理及短暂热休克后，容易被噬菌体DNA感染，随后Cohn于1972年进一步证明质粒DNA用同样的
16、方法也可进入细菌。第32页，讲稿共85张，创作于星期二转化原理：转化原理：将快速生长中的大肠杆菌置于经0预处理的低渗氯化钙溶液中，使细胞膨胀，细胞膜通透性发生变化，易与外源DNA相粘附并在细胞表面的复合物。42下做短暂热刺激，复合物便会被细胞所吸收。在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达，就可涂布于选择性培养基中分离转化子。细菌转化及蓝白斑筛选：图5-5第33页，讲稿共85张，创作于星期二图图5-6噬噬菌菌体体可可以以作为克隆载体作为克隆载体第34页，讲稿共85张，创作于星期二第35页，讲稿共85张，创作于星期二5.2.3聚合酶链反应技术（聚合酶链反应技术（PCR）首先将双链DNA分子加热
17、分离成两条单链，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种dNTP合成新生的DNA互补链。因为DNA聚合酶需要有一小段双链DNA来启动（“引导”）新链的合成，所以，新生DNA链的起点由寡核苷酸引物在模板DNA链两端的退火位点所决定。第36页，讲稿共85张，创作于星期二由于在PCR反应中所选用的一对引物，是按照与扩增区段两端序列彼此互补的原则设计的，因此每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始并朝相反方向延伸的。第37页，讲稿共85张，创作于星期二整个PCR反应的全过程，即DNA解链（变性）、引物与模板DNA相结合（退火）、DNA合成（链的延伸）三步，可以被不断重复。经多次循环
18、之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应是2n。第38页，讲稿共85张，创作于星期二图图图图5-8 PCR5-8 PCR指数扩增时循环次数与指数扩增时循环次数与指数扩增时循环次数与指数扩增时循环次数与DNADNA产物数量的比较。产物数量的比较。产物数量的比较。产物数量的比较。第39页，讲稿共85张，创作于星期二主要步骤：将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温（94）环境下加热1分钟，使双链DNA变性，形成单链模板DNA。第40页，讲稿共85张，创作于星期二然后降低反应温度（约50），致冷1分钟，使寡核苷酸引物与两条单链模板D
19、NA发生退火作用并结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上。第41页，讲稿共85张，创作于星期二最后，将反应混合物的温度上升到72左右保温1-数分钟，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板分子按53方向延伸，合成新生DNA互补链。第42页，讲稿共85张，创作于星期二聚合酶链式反应示意图。（a）起始材料，双链DNA；（b）反应混合物加热后发生链分离，降温使引物结合到待扩增靶DNA区段两端的退火位点上；（c）Taq聚合酶以单链DNA为模板在引物的引导下利用反应混合物中的dNTPs合成互补的新链DNA；（d）将反应混合物再次加热，使旧链和新链分开；（e）合成新的互补链DN
20、A；（f）重复b；（g）重复c、第43页，讲稿共85张，创作于星期二引物设计一般遵循下列原则：引物设计一般遵循下列原则：(1)引物长度以1530bp为宜。(2)引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物G+C含量宜在4555%左右。(3)引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在3末端不应有互补链存在。(4)引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。要求在引物设计时采用计算机进行辅助检索分析。(5)引物3末端碱基:原则上要求引物3末端与模板DNA一定要配对。(6)引物5末端碱基:PCR反应物5末端碱基并没有严格的限制，只要与模板DNA结合的引物长度足够，其5末端碱基可以不与模板D
21、NA匹配而呈游离状态。第44页，讲稿共85张，创作于星期二PCR反应引物设计:PCR作为一个体外酶促反应，其效率和特异性取决于两个方面:一是引物与模板的特异结合二是多聚酶对引物的有效延伸基因组DNA作为模板时，由于其数量的庞大及结构复杂，除了特异扩增外，往往很容易产生非特异性扩增产物。引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。第45页，讲稿共85张，创作于星期二5.2.4实时定量实时定量PCR（Realtime-PCR）普通PCR扩增产物总量变化大。实时定量PCR技术：利用带荧光检测的PCR仪对PCR过程DNA累积作出动态监测。荧光染料：SYBRGreenI：图：图5-9TaqMan探针：图
22、探针：图5-10第46页，讲稿共85张，创作于星期二5.2.5基因组基因组DNA文库构建文库构建基因组DNA文库构建：把某种生物基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆。汇集包含基因组中所有DNA序列的克隆，称为基因组DNA文库。基因组基因组DNA文库构建示意图：图文库构建示意图：图5-13常用载体：噬菌体；柯斯质粒；BAC；PAC；YAC第47页，讲稿共85张，创作于星期二5.3RNA基本操作技术基本操作技术在DNA水平上分离真核生物的靶基因难度大：基因组DNA庞大；大量重复序列；有内含子。而分离mRNAcDNA目的基因工作简单，速度快。但是，RNA分子：敏感，稳定
23、性差，某些基因的mRNA具有时相和转录的特殊性。第48页，讲稿共85张，创作于星期二5.3.1总总RNA的提取的提取1、操作要求高：选择合适的时相、采用适当的条件与材料，避免降解。2、方法：Trizol法。由苯酚和异硫氰酸胍组成，可迅速破坏细胞结构，使RNA释放，并保持RNA完整。3、浓度和纯度鉴定：通过OD260/OD280的比值来鉴定第49页，讲稿共85张，创作于星期二5.3.2mRNA的纯化的纯化根据mRNA3端具有polyA尾巴的特点，利用寡聚（dT）-纤维素柱色谱法纯化获得高纯度的mRNA。图图5-14第50页，讲稿共85张，创作于星期二图5-14PolyATtractmRNA的分离
24、纯化过程简图第51页，讲稿共85张，创作于星期二5.3.3cDNA的合成的合成使使用用oligodT或或随随机机引引物物，通通过过RT-PCR法（法（逆转录酶）。逆转录酶）。图图5-15定向定向cDNA的合成与分子修饰：的合成与分子修饰：图图5-16第52页，讲稿共85张，创作于星期二图图5-15cDNA合合成过程示意图成过程示意图第53页，讲稿共85张，创作于星期二5.3.4cDNA文库的构建文库的构建获得的含有某种组织器官cDNA信息的噬菌体文库，可用于筛选目的基因、大规模测序、基因芯片杂交等功能。做法：mRNAcDNA载体大肠杆菌一一个个完完整整的的cDNA文文库库通通常常包包含含大大于
25、于500000的的独独立立克克隆。隆。第54页，讲稿共85张，创作于星期二5.3.5基因文库的筛选基因文库的筛选通通过过某某种种特特定定的的方方法法从从基基因因文文库库中中鉴鉴定定出出含含有有所所需需DNA分子的特定克隆过程。分子的特定克隆过程。1、核酸杂交法（、核酸杂交法（Sourthernblotting）：）：图图5-172、PCR筛选法筛选法3、免免疫疫筛筛选选法法（Westernblotting）：该该法法适适用用于于对表达文库的筛选。图对表达文库的筛选。图5-18第55页，讲稿共85张，创作于星期二5.4SNP的理论与应用的理论与应用SNP：singlenucleotidepoly
26、morphism，单核苷酸多态性。具有很高的遗传稳定性，是继限制性片段长度多态性（RFLP）、RAPD和微卫星DNA（SSR）标记之后的第三代遗传标记。第56页，讲稿共85张，创作于星期二RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphisma）技术）技术lRFLP标记是发展最早的标记是发展最早的DNA标记技术。标记技术。RFLP是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、失重排或点突变所引起的。lRFLP技 术 主 要 包 括 以 下 基 本 步 骤：DNA提取用限制性内切酶酶切DNA用凝胶电泳分开DNA片段把DNA片段转移
27、到滤膜上利用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA片段（Southern杂交）和结果分析。第57页，讲稿共85张，创作于星期二第58页，讲稿共85张，创作于星期二第59页，讲稿共85张，创作于星期二RAPD技术技术lRAPD（(RandomAmplifiedPolymorphicDNA）技技术术是是建建立立在在PCR(PolymeraseChainReaction)基基础础之之上上的的一一种种可可对对整整个个未未知知序序列列的的基基因因组组进进行行多多态态性性分分析析的的分分子子技技术术。其以基因组DNA为模板,以单个人工合成的随机多态核苷酸序列(通常为10个碱基对)为引物,在热稳定的DNA聚合
28、酶(Taq酶)作用下,进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离、溴化乙锭染色后,在紫外透视仪上检测多态性。扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。RAPD技术现已广泛的应用于生物的品种鉴定、系谱分析及进化关系的研究上。第60页，讲稿共85张，创作于星期二第61页，讲稿共85张，创作于星期二SSR（simple sequence repeats）技术技术l微微卫卫星星DNA：重重复复单单位位序序列列最最短短，只只有有26bp，串串联联成成簇簇，长长度度50100bp，又又称称为为短短串串联联重重复复序序列列（Short Tandem RepeatSTR)。广泛分布于基因组中。广泛分布于
29、基因组中。lSSR标记的基本原理：标记的基本原理：l根根据据微微卫卫星星序序列列两两端端互互补补序序列列设设计计引引物物，通通过过PCR反反应应扩扩增增微微卫卫星星片片段段，由由于于核核心心序序列列串串联联重重复复数数目目不不同同，因因而而能能够够用用PCR的的方方法法扩扩增增出出不不同同长长度度的的PCR产产物物，将将扩扩增增产产物物进进行行凝凝胶胶电电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。l第62页，讲稿共85张，创作于星期二SNP检测技术检测技术传传统统SNP检检测测方方法法：RFLP、PCR-SSCP、DHPLC等等，最
30、最终终均均需需通通过过凝凝胶胶电电泳泳分分析析，通通量量受受到到限限制制，并并只只能能判判断断有有无无，而而不不知知碱碱基基类类型型。必必须须进进行行DNA测序。测序。基基因因分分型型：利利用用数数据据库库已已有有SNP进进行行特特定定人人群群序序列列和发生频率研究，包括如下方法：和发生频率研究，包括如下方法：第63页，讲稿共85张，创作于星期二1、基基因因芯芯片片技技术术：通过优化芯片杂交程序，使探针只与完全互补的序列杂交，而不与含有单个错配碱基序列杂交。2、Taqman技技术术：运用了荧光共振能量转换（FRET）技术。3、分子信标技术：分子信标技术：也运用了FRET技术。4、焦磷酸测序法焦
31、磷酸测序法第64页，讲稿共85张，创作于星期二SNP的应用的应用1、人类基因单体的绘图2、SNP与疾病易感基因的相关性分析3、指导用药与药物设计第65页，讲稿共85张，创作于星期二5.5基因克隆技术基因克隆技术在多细胞的高等生物个体水平上，人们用克隆（clone）表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。在细胞水平上，克隆是指由同一个祖细胞分裂而来的一群带有完全相同遗传物质的子细胞。第66页，讲稿共85张，创作于星期二在分子生物学中，人们把将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之得以永久保存和复制的过程称为克隆（动词）。第67页，讲稿共85张，创作于星期二基因克隆，包括
32、目的基因的分离和鉴定两个内容，分四个基本步骤：(1)DNA材料的选择与片段化；(2)外源DNA片段与载体分子的体外连接反应；(3)将人工重组的DNA分子导入它们能够进行正常复制的寄主细胞；(4)重组转化子克隆的选择或筛选。*真核生物基因（大，有重复序列）真核生物基因（大，有重复序列）cDNA克隆克隆法法。法法。第68页，讲稿共85张，创作于星期二RACE（RaidamplificationofcDNAends）技术）技术是一项在是一项在已知已知cDNA序列（部分）序列（部分）的基础上克隆的基础上克隆5或或3端缺失序列的技术。端缺失序列的技术。主要操作步骤如图主要操作步骤如图5-22所示。所示。
33、RACE技术除了用于获得全长技术除了用于获得全长cDNA序列外，还被序列外，还被应用于识别获得应用于识别获得5和和3端非转录序列。端非转录序列。5.5.1RACE技术技术第69页，讲稿共85张，创作于星期二该法通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异性扩增目的基因片段。因为Tester和Driver在接受差示分析前均经一个4碱基切割酶处理，形成平均长度256bp的代表群，保证绝大部分遗传信息能被扩增。5.5.2应用应用cDNA差示分析法克隆基因差示分析法克隆基因第70页，讲稿共85张，创作于星期二图图5-23RDA流流程图。程图。第71页，讲稿共85张，创作于星期二1、基因
34、大规模克隆的目的、基因大规模克隆的目的Gateway技术利用噬菌体进行位点特异性DNA片段重组，实现不需要传统的酶切连接过程的基因快速克隆和载体间平行转移，为大规模克隆基因组注释的可译框架提供了保障。2、Gateway克隆技术要点克隆技术要点（1）Topo反应：将目的基因PCR产物连入Entry载体（2）LR反应：将目的片断从Entry载体重组入表达载体图图5-24a，5-24b。5.5.3Gateway大规模克隆技术大规模克隆技术第72页，讲稿共85张，创作于星期二图图5-24Gateway大规模克隆策略大规模克隆策略第73页，讲稿共85张，创作于星期二基因的图位克隆法（Map-basedc
35、loning）是分离未知性状目的基因的一种良好方法。所有具有某种表现型的基因都可以通过该方法克隆得到。首先，通过构建遗传连锁图，将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记。5.5.4基因的图位克隆法基因的图位克隆法第74页，讲稿共85张，创作于星期二其次，通过对许多不同的生态型及大量限制性内切酶和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的RFLP标记，通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来（图5-25）。第75页，讲稿共85张，创作于星期二图图5-25染色体步移法克隆基因示意图染色体步移法克隆基因示意图第76页，讲稿共85张，
36、创作于星期二图图5-26用图位克隆法获得控制水稻脆杆基因用图位克隆法获得控制水稻脆杆基因BCl第77页，讲稿共85张，创作于星期二1995年，首次提出了蛋白组学的概念。其是蛋白质和基因组研究在形式和内容方面的结合，致力于研究某一物种、个体、器官或细胞在特定条件、特定时间所表达的全部蛋白质图谱。基因组是相对固定的，但各个基因的表达调控与表达程度却有时空性。5.6蛋白质组与蛋白质组学技术蛋白质组与蛋白质组学技术第78页，讲稿共85张，创作于星期二1975年首次建立了等电聚焦及SDS-聚丙烯酰胺凝胶双向电泳技术，该方法依赖于蛋白质分子的等电点和相对分子质量的差异。目前，双向电泳的分辨率达到每块胶10
37、000个蛋白白点。5.6.1双向电泳技术双向电泳技术第79页，讲稿共85张，创作于星期二第80页，讲稿共85张，创作于星期二蛋白质印迹法（Westernblotting），又称为免疫印迹法（immunoblotting）,用于鉴定蛋白质，其原理是根据被测蛋白质能与特异性抗体结合的特性和该蛋白质的相对分子质量。5.6.2蛋白质印迹法蛋白质印迹法第81页，讲稿共85张，创作于星期二图图5-28WesternBlotting示意图示意图第82页，讲稿共85张，创作于星期二第83页，讲稿共85张，创作于星期二生物质谱法用于鉴定电泳分离后的蛋白质。错误率：低于百万分之一。工作原理：蛋白质酶解成肽段与基质混合激光轰击、喷射分析达到检测器的时间由质量/电荷比决定质谱图比较分析：通过比较肽质量指纹图谱与数据库中不同肽段的理论分子质量来寻找。5.6.3蛋白质的质谱分析蛋白质的质谱分析第84页，讲稿共85张，创作于星期二感谢大家观看第85页，讲稿共85张，创作于星期二