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1、关于登革病毒实验室关于登革病毒实验室检测技术检测技术第1页，讲稿共40张，创作于星期二登革病毒的概述 黄病毒科黄病毒科黄病毒属黄病毒属 单股正链单股正链RNA登革病毒登革病毒、4个血清型个血清型形态结构形态结构球形，直径球形，直径37nm50nm 含单股正链含单股正链RNA，长度约，长度约11Kb 编码编码3种结构蛋白，种结构蛋白，7种非结构蛋白种非结构蛋白5-C-PrM(M)-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-33端非编码区含高度保守的核苷酸序列端非编码区含高度保守的核苷酸序列宿主范围宿主范围3种自然宿主：伊蚊、人、低等灵长动物种自然宿主：伊蚊、人、低等灵长
2、动物登革病毒成熟颗粒模拟图登革病毒成熟颗粒模拟图第2页，讲稿共40张，创作于星期二普通登革热：登革热登革热(dengue fever)是由登革热是由登革热病毒所引起，由伊蚊传播的急性传染病毒所引起，由伊蚊传播的急性传染病。其临床特征为突起病。其临床特征为突起发热发热，头痛头痛，全，全身身肌肉、骨骼和关节痛肌肉、骨骼和关节痛，极度疲乏，极度疲乏，皮皮疹疹，淋巴结肿大及白细胞减少，部分病人，淋巴结肿大及白细胞减少，部分病人有出血倾向，病情较轻，通常可自行恢复。有出血倾向，病情较轻，通常可自行恢复。登革出血热：病情较重，致死率高。通常发生于过去已病情较重，致死率高。通常发生于过去已感染过登革病毒而再
3、次感染其他型别的人，感染过登革病毒而再次感染其他型别的人，发病的严重程度与病人血清原来存在的登发病的严重程度与病人血清原来存在的登革病毒抗体密切关系。革病毒抗体密切关系。登革休克综合症：第3页，讲稿共40张，创作于星期二全球形势DFDF广泛分布于有媒介伊蚊存在的热带、亚热带地域。在东南亚、广泛分布于有媒介伊蚊存在的热带、亚热带地域。在东南亚、西太平洋和加勒比海地区呈现地方性流行。西太平洋和加勒比海地区呈现地方性流行。世界卫生组织警告世界卫生组织警告登革热病例正在迅猛增加登革热病例正在迅猛增加已威胁到全球三分之一人口的健康安全已威胁到全球三分之一人口的健康安全WHOWHO估计，全球约估计，全球约
4、2525亿的人群处于亿的人群处于DFDF的威胁中。的威胁中。全球每年有全球每年有50005000万人感染登革热病毒，其中万人感染登革热病毒，其中5050万为万为DHFDHF病例（其病例（其中大部份为儿童）。中大部份为儿童）。目前全世界还没有有效的疫苗预防登革热目前全世界还没有有效的疫苗预防登革热。第4页，讲稿共40张，创作于星期二埃及伊蚊埃及伊蚊白纹伊蚊白纹伊蚊在东南亚及海南省，埃及伊蚊是本病的主要媒介。在东南亚及海南省，埃及伊蚊是本病的主要媒介。在广东、广西，白纹伊蚊是主要媒介。在广东、广西，白纹伊蚊是主要媒介。白纹伊蚊孳生于房屋内外的浅水及积水中。白纹伊蚊孳生于房屋内外的浅水及积水中。成蚊
5、白天吸血，嗜人血。成蚊白天吸血，嗜人血。传传传传 播播播播 媒媒媒媒 介介介介第5页，讲稿共40张，创作于星期二流行病学流行病学 患者和隐性感染者是主要传染源患者和隐性感染者是主要传染源。在流行期间，隐性感染者的数量可达全体人群的在流行期间，隐性感染者的数量可达全体人群的1/3，可能是最重要的传染源。，可能是最重要的传染源。主要发生于市镇人口集中地区，发病与布雷指数有关。主要发生于市镇人口集中地区，发病与布雷指数有关。雨季为发病高峰季节。雨季为发病高峰季节。广东省广东省510月流行。其中月流行。其中8、9月份为高峰。月份为高峰。有一定的周期性（有一定的周期性（45年）。年）。人与人之间不会直接
6、经过呼吸道、消化道或接触等传播。人与人之间不会直接经过呼吸道、消化道或接触等传播。人群易感性和免疫力人群易感性和免疫力 人对登革病毒普遍易感，但感染后并非人人发病。由于对不同型别毒株人对登革病毒普遍易感，但感染后并非人人发病。由于对不同型别毒株感染无交叉免疫力，因此可以发生二次感染。感染一种病毒型产生的免疫对感染无交叉免疫力，因此可以发生二次感染。感染一种病毒型产生的免疫对同型病毒免疫力可持续同型病毒免疫力可持续14年，而对异型病毒的免疫则短。年，而对异型病毒的免疫则短。第6页，讲稿共40张，创作于星期二登革热流行与预防有利于有利于DF流行的因素流行的因素登革病毒（带毒蚊、人、兽）输入登革病毒
7、（带毒蚊、人、兽）输入输入地自然气候输入地自然气候输入地伊蚊密度、输入地伊蚊密度、屋内处积水容器、屋内处积水容器、居民养花、养莲、居民养花、养莲、建筑工地积水、水缸积水建筑工地积水、水缸积水预防登革热健康提醒：预防登革热健康提醒：1.到登革热流行区旅游或生活，应穿着长袖衣服及长裤，并在外露的皮到登革热流行区旅游或生活，应穿着长袖衣服及长裤，并在外露的皮肤及衣服上涂蚊虫驱避药物；肤及衣服上涂蚊虫驱避药物；2.如果房间没有空调设备，应装置蚊帐或防蚊网；如果房间没有空调设备，应装置蚊帐或防蚊网；3.使用家用杀虫剂杀灭成蚊，并遵照包装指示使用适当的分量；使用家用杀虫剂杀灭成蚊，并遵照包装指示使用适当的
8、分量；4.避免在避免在“花斑蚊花斑蚊”出没频繁时段在树荫、草丛、凉亭等户外阴暗处逗留；出没频繁时段在树荫、草丛、凉亭等户外阴暗处逗留；5.防止积水，清除伊蚊孳生地；防止积水，清除伊蚊孳生地；6.尽量避免用清水养植植物；尽量避免用清水养植植物；7.对于花瓶等容器，每星期至少清洗、换水一次，勿让花盆底盘留有积水。对于花瓶等容器，每星期至少清洗、换水一次，勿让花盆底盘留有积水。把所有用过的罐子及瓶子放进有盖的垃圾桶内。把所有用过的罐子及瓶子放进有盖的垃圾桶内。第7页，讲稿共40张，创作于星期二实验室确诊病例普通登革热：登革病毒血清特异性IgM抗体阳性，结合临床症状恢复期血清特异性IgG抗体比急性期有
9、4倍以上增长从急性病人血清、脑脊液或尸解脏器中分离到病毒或检测到病毒序列或检测到病毒抗原登革出血热：多器官大量出血肝肿大血容比增加20以上登革休克综合症：伴休克第8页，讲稿共40张，创作于星期二登革热实验室检测常规方法登革热实验室检测常规方法C6/36细胞培养技术细胞培养技术登革病毒的分离和鉴定登革病毒的分离和鉴定血凝抑制试验（血凝抑制试验（HI）补体结合试验（补体结合试验（CF）中和试验（中和试验（NT）间接免疫荧光试验（间接免疫荧光试验（IFA）酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISA）胶体金免疫层析快速诊断试验胶体金免疫层析快速诊断试验 免疫斑点试验免疫斑点试验(DIBA)RT-P
10、CR荧光荧光PCR第9页，讲稿共40张，创作于星期二标本的采集与保存采集对象 主要为登革热疑似病例、临床诊断病例等，必要时采集疑似病例的密切接触者标本。根据采样时间确定检测目的病原学检测病原学检测 初次感染：初次感染：出现登革热症状的前出现登革热症状的前12和发病后的和发病后的35天天 再次感染：再次感染：出现登革热症状的前后出现登革热症状的前后12天天血清学检测血清学检测初次感染：初次感染：出现登革热症状出现登革热症状1周后可检测到周后可检测到IgM;2周后可检测到周后可检测到IgG 再次感染：再次感染：出现登革热症状后出现登革热症状后12天可检测到天可检测到IgM和和IgG 第10页，讲稿
11、共40张，创作于星期二标本的采集与保存蚊媒标本主要为埃及伊蚊、白纹伊蚊或其它可疑蚊种，检测抗原，常用于登革病毒监测。采集回来的蚊子置20冻死后，按蚊种及捕获地点分组，以每组2050只分装于螺口冻存管，70C冰箱或液氮保存。蚊媒标本的检测目的是登革病毒分离或登革病毒核酸检测，因此标本采集后应确保存于超低温条件下。第11页，讲稿共40张，创作于星期二蚊虫标本研磨程序一组标本（一组标本（50只蚊子）只蚊子）转入转入1.5ml 的的eppendorf离心管离心管加入加入100l标本处理液标本处理液用小型电动研磨器将蚊子磨匀用小型电动研磨器将蚊子磨匀补加补加900l标本处理液标本处理液4C，10000r
12、pm，离心，离心10min标本处理液标本处理液:MEM 90ml 小牛血清小牛血清 2 ml 庆大霉素（庆大霉素（50g/ml)100l两性霉素两性霉素B（1000g/ml）1ml青链霉素（青链霉素（1000U/ml）1ml用用7.5%碳酸氢钠溶液调至碳酸氢钠溶液调至PH7.2。用于：用于：登革病毒分离登革病毒分离 登革病毒核酸检测登革病毒核酸检测剩余的研磨液需保存在剩余的研磨液需保存在-70C冰箱中以备复查。冰箱中以备复查。注意：研磨过程最好在冰上操作；注意：研磨过程最好在冰上操作；低温离心机低温离心机4第12页，讲稿共40张，创作于星期二标本的采集与保存血液标本是登革病毒检测的主要标本，采
13、集5ml为宜，血清、血浆都可，可检测抗原或抗体。用于抗体检测的血清标本最多可在28保存一周，长期保存应在20以下。用于抗原检测的血清标本应保存于70。全血冰冻溶解后会产生溶血，未分离血清的标本应避免冰冻保存。第13页，讲稿共40张，创作于星期二感染登革病毒后的免疫反应第14页，讲稿共40张，创作于星期二采集第二份血的重要性17天，7080核酸阳性，晚恢复期血清（1430天）抗体检测可进一步确认可分辨初次和二次感染对于初次感染，晚恢复期血清可用以型别鉴定第15页，讲稿共40张，创作于星期二检测方法的选择5天 急性期，3种方法813天 早恢复期 1430天 晚恢复期病毒分离 7天 抗体检测 3小时
14、病毒核酸检验 2-3小时血清抗体检测第16页，讲稿共40张，创作于星期二登革病毒的分离和鉴定登革病毒的分离和鉴定所用样本急性期血清、血浆、淋巴细胞尸体组织：尤其是肝、脾、淋巴结、胸腺蚊子样本的保存48小时内进行病毒分离，可放于48存放时间较长，应把血清分离出来，70 保存，避免冻融淋巴细胞，抗凝血应在几小时内送实验室分离方法：敏感细胞分离、乳鼠接种分离、蚊虫接种分离。分离方法：敏感细胞分离、乳鼠接种分离、蚊虫接种分离。常用常用C6/36细胞进行登革病毒分离。细胞进行登革病毒分离。鉴定方法：鉴定方法：中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验、单克隆抗体免疫荧光技术、中和试验、补体结合试验、血凝抑制试
15、验、单克隆抗体免疫荧光技术、PCR技术。技术。第17页，讲稿共40张，创作于星期二病毒分离1.接种到蚊头(最敏感)2.接种敏感细胞：C6/36，BHK21（成本效益最高）3.接种乳鼠鉴定方法：鉴定方法：中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验、单克隆抗体免疫荧光技术、中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验、单克隆抗体免疫荧光技术、PCR技术技术。第18页，讲稿共40张，创作于星期二C6/36细胞分离登革病毒分离登革病毒单层单层C6/36细胞的准备细胞的准备（C6/36细胞通常细胞通常28培养培养23天后可长成单层，天后可长成单层，710天传下一代。天传下一代。C6/36细胞形态为类圆形，易于贴壁生长
16、，但贴壁不牢。细胞形态为类圆形，易于贴壁生长，但贴壁不牢。C6/36细胞是传代细胞，理论上可以无限传代。）细胞是传代细胞，理论上可以无限传代。）细胞管法、细胞板法细胞管法、细胞板法标本的处理标本的处理血清标本、蚊虫标本和组织标本血清标本、蚊虫标本和组织标本 标本接种标本接种接种、吸附、细胞毒性的处理接种、吸附、细胞毒性的处理结果观察结果观察每天观察细胞生长情况每天观察细胞生长情况第19页，讲稿共40张，创作于星期二正常正常C6/36细胞（细胞（100X）C6/36细胞接种病人血清第二天时出现的血清毒性现象（细胞接种病人血清第二天时出现的血清毒性现象（100X）细胞培养分离登革病毒第20页，讲稿
17、共40张，创作于星期二登革登革1型病毒在型病毒在C6/36细胞上病变情况（细胞上病变情况（100X）登革登革2型病毒在型病毒在C6/36细胞上病变情况细胞上病变情况（100X）登革登革3型病毒在型病毒在C6/36细胞上病变情况细胞上病变情况（100X）登革登革4型病毒在型病毒在C6/36细胞上病变情况（细胞上病变情况（100X）第21页，讲稿共40张，创作于星期二血凝抑制试验血凝试验血凝试验血凝抑制试验血凝抑制试验有血凝素（HA）的病毒能凝集人或动物红细胞，称为血凝现象，血凝现象能被相应抗体抑制称为血凝抑制试验，原理是相应抗体与病毒结合后，阻止病毒表面HA与红细胞结合，使原有的血凝反应被抑制。
18、过去最常规的方法，优点：敏感容易操作，需要的仪器少，结果可靠，HI抗体可存在3045年；缺点：样本要预处理，必须双份血，难以区分登革病毒感染和其他黄病毒感染（如乙脑病毒、西尼罗病毒等）。第22页，讲稿共40张，创作于星期二补体结合试验抗体与抗原反应形成复合物，通过激活补体而介导溶血反应，可作为反应强度的指示系统。没有广泛应用，操作较难，可用于检测现感染，不适用于血清流行病学研究。第23页，讲稿共40张，创作于星期二中和试验（NT）优点：最特异和敏感的方法缺点：昂贵，耗时长，技术复杂，不常用第24页，讲稿共40张，创作于星期二间接免疫荧光试验抗原抗原抗体抗体荧光标记荧光标记抗抗体抗抗体原理：原理
19、：缺点：需要荧光显微镜，和富有经验的试验人员第25页，讲稿共40张，创作于星期二快速检测试剂全血、血清、血浆含所有检测所需物品储存温度(2-30C)90%敏感性和特异性15 分钟出结果可鉴别初次和二次感染25 tests 第26页，讲稿共40张，创作于星期二酶联免疫吸附试验酶标记登革病毒单抗与登革病毒复合物人IgM抗体抗人抗人IgM单克隆抗体单克隆抗体捕捉法（检测登革病毒抗体捕捉法（检测登革病毒抗体IgM）IgM抗体出现的比IgG早一点,约5天后可以查到。初次感染的IgM比二次感染高的多，IgM可持续23个月诊断意义：IgM阳性不表明现感染，有可能是23个月前感染，在登革尚未地方性流行地区，可
20、用于临床检测和人群监测第27页，讲稿共40张，创作于星期二酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验间接法间接法(检测登革病毒抗体检测登革病毒抗体IgM或或IgG)1.酶标板孔上包被登革病毒抗原酶标板孔上包被登革病毒抗原2.每孔中加血清标本稀释液每孔中加血清标本稀释液（如果含登革病毒抗体（如果含登革病毒抗体IgM或或IgG即可结合）即可结合）3.加加HRP标记的二抗（抗人标记的二抗（抗人IgM或抗人或抗人IgG），在适当的底物作用下呈现颜色反应），在适当的底物作用下呈现颜色反应4.肉眼判断颜色深浅或加终止液后用酶标仪读取每孔不同的吸光值，初步判断标肉眼判断颜色深浅或加终止液后用酶标仪读取每孔不同的吸光值
21、，初步判断标 本本中抗体的含量中抗体的含量IgG 非特异，与其它黄病毒有交叉反应，不能用于分型，敏感性比HI好，正取代HI第28页，讲稿共40张，创作于星期二登革病毒的核酸检测：登革病毒的核酸检测：登革病毒的核酸检测：登革病毒的核酸检测：PCRPCR检测与鉴定登革病毒处理流程检测与鉴定登革病毒处理流程检测与鉴定登革病毒处理流程检测与鉴定登革病毒处理流程 血清（细胞上清或组血清（细胞上清或组织研磨液）织研磨液）病毒病毒RNA提取提取cDNA的合成的合成登革病毒型特异引物登革病毒型特异引物PCR扩增扩增凝胶电泳，结果判断凝胶电泳，结果判断用用QIAamp Viral RNA Kit或者或者Roch
22、e Viral RNA Kit提取病毒提取病毒RNA 根据根据PCR特异性产物片段大特异性产物片段大小进行判断小进行判断 第29页，讲稿共40张，创作于星期二RT-PCRRT-PCR检测登革病毒基因与分型检测登革病毒基因与分型登革热诊断标准（登革热诊断标准（登革热诊断标准（登革热诊断标准（WS216-2008WS216-2008WS216-2008WS216-2008）型别引物名称引物序列（53）扩增片段通用引物D1TGAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCGD2TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC511bp1型登革病毒D1TGAATATGCTGAAACGCG
23、CGAGAAACCG482 bpTS1CGTCTCAGTGATCCGGGGG2型登革病毒D1TGAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG119bpTS2CGCCAGAAGGGCCATGAACAG3型登革病毒D1TGAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG290bpTS3TAACATCATCATGAGACAGAGC4型登革病毒D1TGAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG392bpTS4CTCTGTTGTCTTAAACAAGAGA第30页，讲稿共40张，创作于星期二500bp500bp通用引物通用引物通用引物通用引物PCRPCRPCRPCR结果结果结果结果分
24、型引物分型引物分型引物分型引物PCRPCRPCRPCR结果结果结果结果 M I M I 通用产物：通用产物：511bp 分型产物：分型产物：482bp，：119bp，：290bp，：392bp第31页，讲稿共40张，创作于星期二Real time PCRReal time PCR检测登革病毒处理流程检测登革病毒处理流程检测登革病毒处理流程检测登革病毒处理流程血清（细胞上清或组血清（细胞上清或组织研磨液）织研磨液）病毒病毒RNA提取提取cDNA的合成的合成Real timePCR结果判断结果判断用用QIAamp Viral RNA Kit或或Roche Viral RNA Kit提取病毒提取病毒
25、RNA 登革病毒是登革病毒是RNA病毒，病毒，PCR前先进行前先进行RT 根据根据Real time PCR后软件后软件分析得到的扩增曲线进行判断分析得到的扩增曲线进行判断 引物与探针的特异性是反应引物与探针的特异性是反应成功与否的关键因素成功与否的关键因素 第32页，讲稿共40张，创作于星期二登革病毒检测用引物与探针登革病毒检测用引物与探针登革热诊断标准（登革热诊断标准（登革热诊断标准（登革热诊断标准（WS216-2008WS216-2008WS216-2008WS216-2008）登革病毒通用引物登革病毒通用引物 Den-FP：5 GCATATTGACGCTGGGAGAGA3Den-RP：
26、5GGCGTTCTGTGCCTGGAAT3登革病毒通用探针登革病毒通用探针Den-Probe：5 FAMCAGAGATCCTGCTGTCTCMGB3 引物和探针均由上海基康生物技术有限公司合成及标记，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。引物和探针均由上海基康生物技术有限公司合成及标记，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。也可用商业化试剂盒（上海之江生产的登革热通用性荧光也可用商业化试剂盒（上海之江生产的登革热通用性荧光PCR核酸检测试剂盒）。核酸检测试剂盒）。也可用荧光也可用荧光PCR方法对登革病毒进行基因分型（方法对登革病毒进行基因分型（WS216-2008）。）。第33页，讲稿共40张，创作于星期二登革病
27、毒基因组序列测定与分析登革病毒基因组序列测定与分析 DNA序列测定是分析某特定基因的结构和序列测定是分析某特定基因的结构和功能的基础。功能的基础。登革病毒基因组的序列分析可反映登革病毒登革病毒基因组的序列分析可反映登革病毒基因变异的遗传信息。基因变异的遗传信息。通过测定来源于不同时期不同地理区域不同通过测定来源于不同时期不同地理区域不同动物宿主登革病毒株的核苷酸序列，可对动物宿主登革病毒株的核苷酸序列，可对登革病毒的分子进化史进行系统分析登革病毒的分子进化史进行系统分析。第34页，讲稿共40张，创作于星期二E基因：中和抗原表位，型特异表位，在登革病毒的致病和免疫中起着至关重要的作用第35页，讲
28、稿共40张，创作于星期二历年深圳市登革热病例病毒型别历年深圳市登革热病例病毒型别2005年：D2，D42007年：D32008年：D1，D22009年：D2，D32010年：D1（首次本地爆发疫情首次本地爆发疫情）深圳市历年发生的登革热疫情，病毒流行株的E基因序列均可追溯到国外的毒株，提示深圳市的登革热仍有可能为输入性的，输入地主要为东南亚各国。第36页，讲稿共40张，创作于星期二深圳市登革病毒E基因进化分析登革2型病毒分离株SZ0521的系统进化树 登革4型病毒分离株SZ0524的系统进化树第37页，讲稿共40张，创作于星期二 疑似登革热病人发病内血清接种C6/36细胞IgM、IgG ELI
29、SAReal time RT-PCR快速测登革病毒（可选）IgM和IgG ELISA阴性IgM或IgG ELISA阳性Real time RT-PCR或RT-PCR鉴定阴性盲传3代仍为阴性判定登革病毒型别登革病毒培养阴性判定为阴性IgG阳性，IgM很低或阴性IgM很高，IgG很低或阴性IgM和IgG阳性，但较低二次感染初次感染IgM和IgG仍保持较低水平甚至降低IgM升高或IgG4倍升高采集第二份血判为阴性判为阳性第38页，讲稿共40张，创作于星期二建 议1.尽可能采集早期样本，标明病人的发热时间，采样时间，关系到检测方法的选择2.血清学检测同时检测IgM和IgG抗体，以免漏检3.采集双份血4.留意其它虫媒病毒病（例如基孔肯雅热）第39页，讲稿共40张，创作于星期二04.04.2023感谢大家观看第40页，讲稿共40张，创作于星期二