细胞破碎技术精选PPT.ppt

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1、关于细胞破碎技术第1页，讲稿共127张，创作于星期二前前 言言细胞破碎是了解细胞组成和结构细胞破碎是了解细胞组成和结构,获得细胞内含获得细胞内含物的必要手段。物的必要手段。胞内的生物活性物质的稳定性差胞内的生物活性物质的稳定性差,条件不适极易条件不适极易失活。特别是微生物细胞十分微小失活。特别是微生物细胞十分微小,细胞壁结构比细胞壁结构比较紧密较紧密,一般方法不易将细胞打破一般方法不易将细胞打破,有些技术虽然有些技术虽然可以可以,但条件严苛但条件严苛,胞内生物活性物质在此条件下胞内生物活性物质在此条件下很易失活很易失活,限制了一些技术的应用。限制了一些技术的应用。在一定程度上细胞破碎仍是生物技

2、术产业化关在一定程度上细胞破碎仍是生物技术产业化关键技术。键技术。第2页，讲稿共127张，创作于星期二破碎细胞的方法和技术破碎细胞的方法和技术 细胞破碎方法细胞破碎方法 物理法物理法 化学法化学法 渗透渗透 超声超声 高压高压 球磨球磨 研磨研磨 碱处碱处 酶法酶法 有机有机 表面表面 休克休克 波法波法 释放释放 法法 法法 理法理法 溶剂溶剂 活性活性 法法 法法 法法 剂法剂法第3页，讲稿共127张，创作于星期二细胞壁的组成和结构细胞壁的组成和结构 微生物细胞外膜使细胞具有刚性的外形微生物细胞外膜使细胞具有刚性的外形,由胞质由胞质膜和细胞壁组成膜和细胞壁组成,其结构影响着细胞破碎。其结构

3、影响着细胞破碎。胞质膜保持着细胞内外的物质浓度梯度胞质膜保持着细胞内外的物质浓度梯度,主要主要由蛋白质和脂类组成。没有细胞壁时由蛋白质和脂类组成。没有细胞壁时,膜对渗透休克膜对渗透休克敏感敏感,对对其它破碎方法影响较小。其它破碎方法影响较小。细胞壁是破碎的主要障碍细胞壁是破碎的主要障碍,其其组成和结构对细组成和结构对细胞破碎有重要影响。细胞壁的组成和结构与遗传胞破碎有重要影响。细胞壁的组成和结构与遗传和环境因素有关和环境因素有关,但在微生物的种属中也存在总结构但在微生物的种属中也存在总结构上的相似性。上的相似性。第4页，讲稿共127张，创作于星期二 细菌细胞壁的组成细菌细胞壁的组成 1964年

4、年Salton首次利用机械破碎法破碎细菌细首次利用机械破碎法破碎细菌细胞，对细菌细胞壁组成、结构和功能进行研究。对胞，对细菌细胞壁组成、结构和功能进行研究。对格兰氏阳性菌和格兰氏阴性菌的细胞壁结构有了较格兰氏阳性菌和格兰氏阴性菌的细胞壁结构有了较为全面认识。为全面认识。除了菌质和一些除了菌质和一些L-型和嗜盐菌以外，几乎型和嗜盐菌以外，几乎所有的细菌的壁的较坚硬部分都是由短肽交联所有的细菌的壁的较坚硬部分都是由短肽交联的糖原链，即粘肽构成，围绕着细胞形成连续的糖原链，即粘肽构成，围绕着细胞形成连续的网状结构，使细胞具有一定的形状和强度。的网状结构，使细胞具有一定的形状和强度。第5页，讲稿共12

5、7张，创作于星期二细菌细胞壁的组成细菌细胞壁的组成细菌粘肽结构示意图细菌粘肽结构示意图N-乙酰基胞壁酸(M)和N-乙酰基葡萄糖胺(G)交替形成糖原束,由M引出的纵点代表四肽单元的氨基酸残基，横点代表肽交联桥第6页，讲稿共127张，创作于星期二细菌细胞壁的组成细菌细胞壁的组成 不同物种的不同物种的N-乙酰基胞壁酸在其侧链基团上乙酰基胞壁酸在其侧链基团上的取代有变化。但对糖原链的三维结构没有明显的取代有变化。但对糖原链的三维结构没有明显影响。影响。N-乙酰基胞壁酸残基的乳酸基与肽链结合，乙酰基胞壁酸残基的乳酸基与肽链结合，将糖原链联结起来形成网状结构。将糖原链联结起来形成网状结构。至少至少N-乙酰

6、基胞壁酸残基的乳酰基部分可为四乙酰基胞壁酸残基的乳酰基部分可为四肽单元取代，相邻的糖原链由肽桥交联。大肠杆菌肽单元取代，相邻的糖原链由肽桥交联。大肠杆菌大约有大约有50%的四肽单元未交联，其它的仅作为二的四肽单元未交联，其它的仅作为二聚体交联。在嗜酸乳酸菌中，大约有聚体交联。在嗜酸乳酸菌中，大约有90%的四肽的四肽单元交联，约单元交联，约30%的四肽单元作为三聚体交联。的四肽单元作为三聚体交联。第7页，讲稿共127张，创作于星期二细菌细胞壁的组成细菌细胞壁的组成 虽然几乎所有的细菌都含有基本的粘肽网结虽然几乎所有的细菌都含有基本的粘肽网结构，但格兰氏阳性和阴性细菌的壁结构有明显不构，但格兰氏阳

7、性和阴性细菌的壁结构有明显不同。格兰氏阳性菌的壁相当厚，约同。格兰氏阳性菌的壁相当厚，约15-50 nm，含，含有有40-90%的由基础多糖和磷壁酸质组成的粘肽，的由基础多糖和磷壁酸质组成的粘肽，一些种属的细胞表面有规律地排列着蛋白质亚基。一些种属的细胞表面有规律地排列着蛋白质亚基。格兰氏阴性菌细胞壁由薄的粘肽层格兰氏阴性菌细胞壁由薄的粘肽层(1.5-(1.5-2.0nm)2.0nm)和在电子显微照片上看如同胞质膜一样的外和在电子显微照片上看如同胞质膜一样的外膜组成，粘肽层上还共价结合有脂蛋白，一些种膜组成，粘肽层上还共价结合有脂蛋白，一些种属在外膜上另外还有一层规律排列的蛋白质亚基。属在外膜

8、上另外还有一层规律排列的蛋白质亚基。第8页，讲稿共127张，创作于星期二酵母细胞壁酵母细胞壁 酵母细胞壁结构更难加以说明。总的结构要比格兰氏阳酵母细胞壁结构更难加以说明。总的结构要比格兰氏阳性菌的厚些。面包酵母细胞壁大约为性菌的厚些。面包酵母细胞壁大约为70nm，且随培养时间，且随培养时间的增加细胞壁加厚。的增加细胞壁加厚。酵酵母母细细胞胞壁壁含含有有大大量量葡葡聚聚糖糖，甘甘露露聚聚糖糖和和蛋蛋白白质质，但但不不清清楚楚以以怎怎样样的的方方式式结结合合形形成成基基本本结结构构。在在葡葡聚聚糖糖链链上上有有(1 1,3 3)和和(1 1,6 6)键键联联结结的的分分支支链链结结构构。酵酵母母细

9、细胞胞壁壁的的甘甘露露聚聚糖糖主主要要是是由由(1 1,2 2)糖糖苷苷键键和和少少量量的的(1 1,3 3)糖糖苷苷键键联联结结的的甘甘露露糖糖组组成成，另另外外，也也有有通通过过(1 1,6 6)糖糖苷苷键键联联结结的的甘甘露露寡寡糖糖侧侧链链，在在甘甘露露糖糖残残基基上上有有时时也也有有磷磷酸酸二二酯酯键键。在在酵酵母母细细胞胞壁壁上上发发现现的的蛋蛋白白质质主主要要是是与与甘甘露露糖糖复复合合，多多数数是是酶酶，而而不不是是结结构构组组分分。第9页，讲稿共127张，创作于星期二酵母细胞壁酵母细胞壁格兰氏阳性(a)和阴性(b)细菌的细胞壁的横断面图CM代表胞质膜;CW为细胞壁结构;SU为

10、有规律排列的亚基;PG为粘肽层;OM为格兰氏阴性菌的外膜；类型不同，亚基可能存在也可能不存在。第10页，讲稿共127张，创作于星期二酵母细胞壁酵母细胞壁酵母细胞壁结构示意图酵母细胞壁结构示意图外层甘露聚糖(M)通过磷酸二酯键与蛋白(P)结合，内部蛋白含有交联的糖原(G)第11页，讲稿共127张，创作于星期二真菌细胞壁真菌细胞壁 大多数真菌的细胞壁是由多糖和少量的蛋白大多数真菌的细胞壁是由多糖和少量的蛋白质及脂类组成，但组成变化很大，只有个别的真质及脂类组成，但组成变化很大，只有个别的真菌细胞壁作了较详细研究。正如细菌和酵母一样，菌细胞壁作了较详细研究。正如细菌和酵母一样，多糖是构成细胞形状和耐

11、受破碎的主要结构物。多糖是构成细胞形状和耐受破碎的主要结构物。真菌细胞壁组成和结构的多样性，真菌细胞壁组成和结构的多样性，不能将一不能将一个种属的结果推广到另一个种属上。从影响细胞破个种属的结果推广到另一个种属上。从影响细胞破碎的角度看，有其共同点，就是菌丝体生长过程中碎的角度看，有其共同点，就是菌丝体生长过程中细胞壁的变化对细胞破碎的影响。细胞壁的变化对细胞破碎的影响。第12页，讲稿共127张，创作于星期二细胞壁组分与真菌分类细胞壁组分与真菌分类关键多糖关键多糖 分类组分类组纤维素，糖原集胞(粘)菌纲(Acrasiomycetes)纤维素，-葡聚糖卵菌目(Oomycetes),水霉目(Sap

12、rolegnicales)霜霉目(Peronosporales),水节霉目(Leptomitales)纤维素，壳多糖，卵菌目(Oomycetes),水节霉目(Leptomitales)-葡聚糖纤维素，壳多糖丝壶菌目(Hyphochytridiomycetes)去乙酰基壳多糖，接合菌目(Zygomycetes)壳多糖壳多糖，-葡聚糖壶菌目(Chytridiomycetes),子囊菌目(Ascomycetes),除了半子囊菌亚纲(Hemiascomycetidae),担子菌纲Basidiomycetes)除了掷孢酵母科(Sporobolomycetaceae)甘露糖,-葡聚糖半子囊菌纲(Hemia

13、scomycetidae)甘露糖,壳多糖红酵母科(Rhodotorulaceae)第13页，讲稿共127张，创作于星期二真菌细胞壁真菌细胞壁粗糙脉孢菌的细胞壁结构示意图粗糙脉孢菌的细胞壁结构示意图 层次组成：层次组成：(a)最外层由最外层由-和和-葡聚糖混合组成葡聚糖混合组成,(b)葡聚糖组合在蛋白类材料中的糖蛋白网络葡聚糖组合在蛋白类材料中的糖蛋白网络,(c)主主要是蛋白质类物质要是蛋白质类物质,(d)内部的壳多糖类物质区，内部的壳多糖类物质区，嵌镶在蛋白类物质中的微原纤维壳多糖。嵌镶在蛋白类物质中的微原纤维壳多糖。第14页，讲稿共127张，创作于星期二真菌细胞壁真菌细胞壁 裂褶菌裂褶菌(S

14、chizophyllum commune)细胞壁的组分细胞壁的组分虽然与之不同，但具有相同的层次结构。三种聚虽然与之不同，但具有相同的层次结构。三种聚合物合物(R)-葡聚糖，葡聚糖，(S)-葡聚糖和壳多糖大约占细胞壁葡聚糖和壳多糖大约占细胞壁干重的干重的70%，(R)-葡聚糖是一个高分枝聚合物，分葡聚糖是一个高分枝聚合物，分支点为支点为(1,3)和和(1,6)，且与壁的惰性层中的微原纤维，且与壁的惰性层中的微原纤维壳多糖复合。壳多糖复合。真菌细胞壁的强度与聚合物的网状结构有关，真菌细胞壁的强度与聚合物的网状结构有关，至少含有的纤维状的壳多糖和纤维素对细胞强度至少含有的纤维状的壳多糖和纤维素对细

15、胞强度有增强作用。有增强作用。第15页，讲稿共127张，创作于星期二细胞壁结构与破碎细胞壁结构与破碎微生物细胞壁的形状和强度与壁内结构聚合物的结构和微生物细胞壁的形状和强度与壁内结构聚合物的结构和它们彼此之间交联及与其它组分的交联程度有关。为达到破它们彼此之间交联及与其它组分的交联程度有关。为达到破碎细胞目的，必须打破这种共价结合的网状结构。这种结构碎细胞目的，必须打破这种共价结合的网状结构。这种结构不仅与其遗传特性有关，也与其生长环境和生长阶段有关，不仅与其遗传特性有关，也与其生长环境和生长阶段有关，而真菌的细胞壁结构还和发酵时的机械作用有关，因此表现而真菌的细胞壁结构还和发酵时的机械作用有

16、关，因此表现为极其丰富的多样性。为极其丰富的多样性。利用机械破碎细胞时，细胞的形状和大小，细胞壁结构利用机械破碎细胞时，细胞的形状和大小，细胞壁结构聚合物的交联程度均是决定破碎难易的重要因素。要预知各聚合物的交联程度均是决定破碎难易的重要因素。要预知各种微生物细胞对机械破碎的耐受能力也有困难。种微生物细胞对机械破碎的耐受能力也有困难。第16页，讲稿共127张，创作于星期二细胞壁结构与破碎细胞壁结构与破碎 利用化学法和酶法破碎细胞时，了解细胞利用化学法和酶法破碎细胞时，了解细胞壁的组成和结构对选择具体方法显得十分重要。壁的组成和结构对选择具体方法显得十分重要。由于在网状结构之上覆盖有保护层，掌握

17、它们由于在网状结构之上覆盖有保护层，掌握它们的结构组成和非结构组成是选择酶和化学方法的结构组成和非结构组成是选择酶和化学方法的依据。然而，有关这些方面的知识还十分有的依据。然而，有关这些方面的知识还十分有限，还需使用其它方法对这种精细结构进行更限，还需使用其它方法对这种精细结构进行更有效的研究。有效的研究。第17页，讲稿共127张，创作于星期二破碎分析破碎分析 破碎细胞的目的主要有二，一是获得细胞的破碎细胞的目的主要有二，一是获得细胞的内含物，二是获得细胞膜物质。不论是那一种目内含物，二是获得细胞膜物质。不论是那一种目的，获得最大的破碎率是所有破碎技术追求的目的，获得最大的破碎率是所有破碎技术

18、追求的目标。标。为了检测破碎过程和破碎结果，需要快速、简捷为了检测破碎过程和破碎结果，需要快速、简捷的细胞破碎程度的分析技术。细胞破碎率可直接利用的细胞破碎程度的分析技术。细胞破碎率可直接利用完整细胞计数法或质量检测法，也可利用细胞释放出完整细胞计数法或质量检测法，也可利用细胞释放出来的特定组分间接测定。来的特定组分间接测定。直接测定法是标准化法，间接测定法可能更有直接测定法是标准化法，间接测定法可能更有用，更有价值。可根据具体情况采用不同的测定方用，更有价值。可根据具体情况采用不同的测定方法。法。第18页，讲稿共127张，创作于星期二1.直接测定法直接测定法使用显微镜或用电子粒子计数器直接进

19、行完整细胞计使用显微镜或用电子粒子计数器直接进行完整细胞计数数,适合细胞破碎过程。然而，破碎释放的物质，如适合细胞破碎过程。然而，破碎释放的物质，如DNA和其它聚合物组分会干扰计数。为进行显微镜计数，可和其它聚合物组分会干扰计数。为进行显微镜计数，可进行染色，以便区分破碎和未破碎细胞。例如破碎的格进行染色，以便区分破碎和未破碎细胞。例如破碎的格兰氏阳性细菌会象阴性菌一样染色；如格兰氏染色法时，兰氏阳性细菌会象阴性菌一样染色；如格兰氏染色法时，未破碎酵母细胞显紫色，而破碎细胞显亮红色。未破碎酵母细胞显紫色，而破碎细胞显亮红色。对于量大的样品，显微镜计数法耗时，枯燥；电子粒子对于量大的样品，显微镜

20、计数法耗时，枯燥；电子粒子计数器虽可测定酵母细胞破碎率，但大的细胞破碎物可计数器虽可测定酵母细胞破碎率，但大的细胞破碎物可能有干扰；用于细菌破碎率的测定时能有干扰；用于细菌破碎率的测定时,灵敏度较低。灵敏度较低。第19页，讲稿共127张，创作于星期二2.间接测定法间接测定法依据破碎过程中破碎的细胞释放的胞内物质量测算，如测依据破碎过程中破碎的细胞释放的胞内物质量测算，如测定可溶性蛋白量或酶活性等，但需与破碎率达到定可溶性蛋白量或酶活性等，但需与破碎率达到100%的标的标准进行比较。在使用酶活性测定法时需注意，由于粗酶提取准进行比较。在使用酶活性测定法时需注意，由于粗酶提取物的酶动力学与完整细胞

21、或纯化的酶可能有差别而产生误差。物的酶动力学与完整细胞或纯化的酶可能有差别而产生误差。当使用较浓的细胞悬浮液时，为获得准确结果，必须当使用较浓的细胞悬浮液时，为获得准确结果，必须进行校正。这是由于破碎细胞释放胞内物质与水混合进行校正。这是由于破碎细胞释放胞内物质与水混合时会使体积增加。另外，稀释法并不适合在破碎过程时会使体积增加。另外，稀释法并不适合在破碎过程中易失活的物质测定。因此需使用新的方法。中易失活的物质测定。因此需使用新的方法。第20页，讲稿共127张，创作于星期二(1)稀释法稀释法如果细胞破碎过程中失活不成为问题，可通过测定如果细胞破碎过程中失活不成为问题，可通过测定破碎样品破碎样

22、品(Cu)和稀释样品和稀释样品(Cd)的上清液中的可溶性蛋白来的上清液中的可溶性蛋白来测定破碎率。使用公式可获得破碎样品的水相体积百分数测定破碎率。使用公式可获得破碎样品的水相体积百分数(Fd),Fd=(Vd/Vs)Cd/(Cu-Cd)Vd为加到体积为为加到体积为Vs的破碎样品中的稀释剂体积。使用的破碎样品中的稀释剂体积。使用Folin-Lowry法或双缩脲法测定蛋白质，通过下式可得破法或双缩脲法测定蛋白质，通过下式可得破碎悬浮物中单位质量的细胞所含的蛋白质碎悬浮物中单位质量的细胞所含的蛋白质(Rp)，Rp=Fd(Cu/X)(2)X是以干物重为基础的细胞浓度。为计算细胞破碎率，是以干物重为基础

23、的细胞浓度。为计算细胞破碎率，必须测定相当于破碎率为必须测定相当于破碎率为100%的的Rp值。值。第21页，讲稿共127张，创作于星期二(1)稀释法稀释法一般来说，水相体积百分数一般来说，水相体积百分数Fd与样品的稀释量无与样品的稀释量无关。这也说明蛋白质的溶解度不受样品的稀释的影响。关。这也说明蛋白质的溶解度不受样品的稀释的影响。但实际上，在多数条件下，稀释会影响蛋白质的溶解度，但实际上，在多数条件下，稀释会影响蛋白质的溶解度，因此在采用稀释法之前，要检查稀释对蛋白质溶解度的因此在采用稀释法之前，要检查稀释对蛋白质溶解度的影响。影响。第22页，讲稿共127张，创作于星期二(2)质量平衡法质量

24、平衡法 破碎样品的水相体积分数破碎样品的水相体积分数(F)与样品破碎前的水与样品破碎前的水相体积分相体积分(Fo)及完整细胞内的含水量及完整细胞内的含水量(质量分数质量分数M)的的关系为：关系为：F=Fo+(1-Fo)M R(Qc/Qaq)R为细胞破碎率，为细胞破碎率，Qc为细胞密度，而为细胞密度，而Qaq为水为水悬浮介质的密度。在上式中假设细胞内水释放会使悬浮介质的密度。在上式中假设细胞内水释放会使水相体积分数增加。利用凯氏定氮法测定破碎样品水相体积分数增加。利用凯氏定氮法测定破碎样品水相水相(Cn)和未破碎细胞和未破碎细胞(Cno)的氮含量表示蛋白含的氮含量表示蛋白含量，它们与量，它们与F

25、和和R的关系为：的关系为：R=FCn/CnoX 第23页，讲稿共127张，创作于星期二(2)质量平衡法质量平衡法 将两式合拚，删去将两式合拚，删去F项，得项，得 R=Fo Cn/Cno X-(1-Fo)Cn M(Qc/Qaq)当细胞浓度当细胞浓度(X)高时，用直接测定法测定细胞浓有困难，高时，用直接测定法测定细胞浓有困难，也可从样品的物理性质和固体质量分数计算得到。也可从样品的物理性质和固体质量分数计算得到。X=Qc Qaq W(1-M)/W(Qaq-Qc)+Qc(1-M)使用质量平衡法计算细胞破碎率时使用了几个假设，使用质量平衡法计算细胞破碎率时使用了几个假设，因此该方法的准确度有时比稀释法

26、差。但是，当稀释影因此该方法的准确度有时比稀释法差。但是，当稀释影响蛋白的溶解度，不能使用稀释法时，可以使用质量平响蛋白的溶解度，不能使用稀释法时，可以使用质量平衡法测定细胞破碎率。衡法测定细胞破碎率。第24页，讲稿共127张，创作于星期二(3)电导测定法电导测定法 电导测定法是依据细胞物质释放到水中会改电导测定法是依据细胞物质释放到水中会改变溶液电导的原理发展的一种快速测定方法。细变溶液电导的原理发展的一种快速测定方法。细胞悬浮液电导的增加与细胞破碎率成正比。胞悬浮液电导的增加与细胞破碎率成正比。这种方法需要有其它方法作对比。因为电导这种方法需要有其它方法作对比。因为电导与生物类型，保存条件

27、，细胞浓度，温度，悬浮与生物类型，保存条件，细胞浓度，温度，悬浮介质中的电解质类型和含量等有关。因此，在利介质中的电解质类型和含量等有关。因此，在利用电导测定法测定细胞破碎率时，为了保证测定用电导测定法测定细胞破碎率时，为了保证测定的准确，除破碎率以外的准确，除破碎率以外,必须在保持的其它所有必须在保持的其它所有条件恒定的情况下进行。条件恒定的情况下进行。第25页，讲稿共127张，创作于星期二渗透休克法渗透休克法第26页，讲稿共127张，创作于星期二原原 理理 依靠细胞内外渗透压差突然加大造成细胞壁破裂依靠细胞内外渗透压差突然加大造成细胞壁破裂,使使胞内物质释放到溶液中。胞内物质释放到溶液中。

28、将收集到的细胞用适当的缓冲液或生理盐水洗涤，除去细将收集到的细胞用适当的缓冲液或生理盐水洗涤，除去细胞沾染的培养基或其它杂质，将其悬浮在含胞沾染的培养基或其它杂质，将其悬浮在含10-30%蔗糖的蔗糖的适当缓冲液中，为了防止目的酶或蛋白质失活，若目的适当缓冲液中，为了防止目的酶或蛋白质失活，若目的酶或蛋白质需要金属离子时，在缓冲液中加入金属离子；酶或蛋白质需要金属离子时，在缓冲液中加入金属离子；若金属离子会使目的酶或蛋白质失活，在缓冲液中需加若金属离子会使目的酶或蛋白质失活，在缓冲液中需加入金属离子螯合剂，如入金属离子螯合剂，如EDTA等。在低温下，使细胞悬浮液等。在低温下，使细胞悬浮液混合均匀

29、，放置使细胞内外渗透压达到平衡。在低温下离心，混合均匀，放置使细胞内外渗透压达到平衡。在低温下离心，收集细胞；在激烈的搅拌下将细胞快速加到较大体积的低浓度收集细胞；在激烈的搅拌下将细胞快速加到较大体积的低浓度的缓冲液中，由于细胞外渗透压突然降低，使细胞破碎。的缓冲液中，由于细胞外渗透压突然降低，使细胞破碎。第27页，讲稿共127张，创作于星期二应用应用 用此法处理大肠杆菌，可使磷酸酯酶、核糖核酸酶用此法处理大肠杆菌，可使磷酸酯酶、核糖核酸酶I以及以及脱氧核糖核酸酶等释放到溶液中。释放的蛋白质的量一般脱氧核糖核酸酶等释放到溶液中。释放的蛋白质的量一般仅占细胞蛋白质的仅占细胞蛋白质的4-7%。因此

30、，后序的蛋白质分离纯化比。因此，后序的蛋白质分离纯化比较简单。此法对细胞壁外有着牢固的糖蛋白包裹层，使胞较简单。此法对细胞壁外有着牢固的糖蛋白包裹层，使胞内渗透压不受严重影响的内渗透压不受严重影响的格兰氏阳性菌格兰氏阳性菌不适用。不适用。在高渗透压环境下生长的细菌在高渗透压环境下生长的细菌,如海洋细菌，嗜盐细菌，如海洋细菌，嗜盐细菌，更适合该法。如可有效的将海洋发光细菌的细菌荧光素酶更适合该法。如可有效的将海洋发光细菌的细菌荧光素酶释放，酶释放率可达到释放，酶释放率可达到80-90%。第28页，讲稿共127张，创作于星期二超声破碎法超声破碎法第29页，讲稿共127张，创作于星期二设备和原理设备

31、和原理 超声破碎器由高频电发生器和产生高强度超声信号的超声破碎器由高频电发生器和产生高强度超声信号的电功率转换器构成，并把超声波传送到与其接触的溶液中。电功率转换器构成，并把超声波传送到与其接触的溶液中。一般在频率一般在频率15-25KHz下进行操作，由声波的冲击和振荡，在下进行操作，由声波的冲击和振荡，在溶液中产生空化作用，空化泡的急剧膨胀压缩和内向爆破产生溶液中产生空化作用，空化泡的急剧膨胀压缩和内向爆破产生冲击弹性波，将声能转化为机械能，形成粘性消散涡流，如果冲击弹性波，将声能转化为机械能，形成粘性消散涡流，如果液体旋涡小于细胞尺寸，产生不同密度移动，当细胞的动能超液体旋涡小于细胞尺寸，

32、产生不同密度移动，当细胞的动能超过细胞壁强度时，至使细胞破碎。因此，细胞破碎率与输入功过细胞壁强度时，至使细胞破碎。因此，细胞破碎率与输入功率大小，细胞大小，细胞壁强度，细胞形状和破碎时间有关。率大小，细胞大小，细胞壁强度，细胞形状和破碎时间有关。一般来说，超声破碎对球状或近球状细胞较有效，对丝状菌破一般来说，超声破碎对球状或近球状细胞较有效，对丝状菌破碎效果较差。在输入功率为碎效果较差。在输入功率为60-195W的条件下，细胞破碎时的条件下，细胞破碎时的蛋白释放与细胞浓度无关，最大细胞浓度可达的蛋白释放与细胞浓度无关，最大细胞浓度可达60 mg/ml。第30页，讲稿共127张，创作于星期二设

33、备和原理设备和原理 在破碎输入功率恒定条件下，对面包酵母破碎实验过在破碎输入功率恒定条件下，对面包酵母破碎实验过程的理论分析得出以下关系式程的理论分析得出以下关系式:1-Rp=exp-(kt)这里这里Rp为蛋白释放率，为蛋白释放率，k为蛋白释放常数，为蛋白释放常数，t为破碎时间为破碎时间(min)。在面包酵母浓度为。在面包酵母浓度为20mg/ml，超声波频率为，超声波频率为20KHz，输入功率，输入功率190瓦的条件下，蛋白释放常数瓦的条件下，蛋白释放常数k与输入功率与输入功率有如下关系有如下关系:k=b(p-po)/0.9 其中其中b为常数，为常数，p是输入功率是输入功率(J/kg.s)，p

34、o是空化作用的最低是空化作用的最低界限输入功率。界限输入功率。第31页，讲稿共127张，创作于星期二应用与局限应用与局限 最大问题是在超声过程中声波被溶液吸收产生大最大问题是在超声过程中声波被溶液吸收产生大量热量，不能及时将热量移出，细胞悬浮液的温度急量热量，不能及时将热量移出，细胞悬浮液的温度急剧升高，导致酶和其它生物活性物质变性失活。因此，剧升高，导致酶和其它生物活性物质变性失活。因此，在实验室中往往采取间断破碎的方法，即经短时间破在实验室中往往采取间断破碎的方法，即经短时间破碎，冷却降温，再进行破碎，经多次反复达到破碎目碎，冷却降温，再进行破碎，经多次反复达到破碎目的。的。因此在细胞破碎

35、过程中，有效冷却是关键。因此在细胞破碎过程中，有效冷却是关键。也因大容量容器的声波传递和散热困难，限制了超也因大容量容器的声波传递和散热困难，限制了超声破碎的大规模应用。声破碎的大规模应用。第32页，讲稿共127张，创作于星期二应用与局限应用与局限 超声破碎在实验室应用比较普遍，处理量小时比较方便。超声破碎在实验室应用比较普遍，处理量小时比较方便。超声波作用产生游离基，超声波作用产生游离基，超声波会造成蛋白质结构变化超声波会造成蛋白质结构变化均会使之失活。均会使之失活。超声破碎法细胞较为彻底，细胞内含物全部释放，破超声破碎法细胞较为彻底，细胞内含物全部释放，破碎细胞悬浮液粘稠，利用简单的过滤法

36、难于回收含有目的碎细胞悬浮液粘稠，利用简单的过滤法难于回收含有目的产物的上清液，只有通过长时间离心回收上清液，使后序产物的上清液，只有通过长时间离心回收上清液，使后序工艺复杂。工艺复杂。超声噪音污染环境，影响人们健康，应对操作人员加超声噪音污染环境，影响人们健康，应对操作人员加以保护。以保护。第33页，讲稿共127张，创作于星期二应用与局限应用与局限 在超声破碎细胞时，正确的方法是探头的下表面处于在超声破碎细胞时，正确的方法是探头的下表面处于菌悬液表面下菌悬液表面下0.3-1.0 cm处最好，深浅以不会使菌悬液产处最好，深浅以不会使菌悬液产生大量泡沫为准。生大量泡沫为准。超声破碎细胞的破碎率一

37、般可达到超声破碎细胞的破碎率一般可达到80-90%，如要进一，如要进一步提高破碎率，需增加更多的破碎时间。因后期破碎率提高并步提高破碎率，需增加更多的破碎时间。因后期破碎率提高并不明显，且增加时间和能耗，更重要的是目的产物会因失活而不明显，且增加时间和能耗，更重要的是目的产物会因失活而使产物收率反而下降。从回收目的产物的角度看是不经济的。使产物收率反而下降。从回收目的产物的角度看是不经济的。因此有必要通过破碎时间与破碎率和生物活性产物收率关系曲因此有必要通过破碎时间与破碎率和生物活性产物收率关系曲线确定最佳破碎时间。线确定最佳破碎时间。第34页，讲稿共127张，创作于星期二大规模应用的对策大规

38、模应用的对策大规模连续破碎细胞的超声破碎系统示意图大规模连续破碎细胞的超声破碎系统示意图 A 超声波转换器，超声波转换器，B 细胞破碎腔，细胞破碎腔，C 细胞悬浮液储存器，细胞悬浮液储存器，D 冷冻系统，冷冻系统，E 高频高频电发生器电发生器 关键是破碎腔的设计。关键是破碎腔的设计。腔的大小及深度要能够被超腔的大小及深度要能够被超声波覆盖，且料液无流动死声波覆盖，且料液无流动死角。操作要求严格控制细胞角。操作要求严格控制细胞悬浮液和冷冻液的流速，以悬浮液和冷冻液的流速，以保证破碎流出物料的温度不保证破碎流出物料的温度不超过控制水平。采用批式多超过控制水平。采用批式多次单循环或连续混合循环方次单

39、循环或连续混合循环方式均可达到破碎细胞的目的。式均可达到破碎细胞的目的。第35页，讲稿共127张，创作于星期二高压释放匀浆法高压释放匀浆法第36页，讲稿共127张，创作于星期二设备与机理设备与机理 高压释放匀浆法是一种有效的大规模破碎细胞技术。有各种类高压释放匀浆法是一种有效的大规模破碎细胞技术。有各种类型的工业产品可供选择，主要由高压泵和释放阀两部分组成。高压型的工业产品可供选择，主要由高压泵和释放阀两部分组成。高压泵一般是一级或二级的正向柱塞泵，细胞悬浮液在泵一般是一级或二级的正向柱塞泵，细胞悬浮液在40-350 Mpa的高的高压下通过阀座中心孔高速喷出，因针状调节阀的阻挡而改变方压下通过

40、阀座中心孔高速喷出，因针状调节阀的阻挡而改变方向，喷射在碰撞环上，细胞在高速喷射，湍流碰撞和急剧降压向，喷射在碰撞环上，细胞在高速喷射，湍流碰撞和急剧降压中，由于各种剪切力的作用致使细胞破碎。中，由于各种剪切力的作用致使细胞破碎。高压释放阀示意图高压释放阀示意图A.控制卸压的手柄控制卸压的手柄,B.控制杆控制杆,C.针针阀阀,D.阀座阀座,E.碰撞环碰撞环第37页，讲稿共127张，创作于星期二设备与机理设备与机理 释放阀的结构，特别是阀座的形状对细胞破碎率有明显释放阀的结构，特别是阀座的形状对细胞破碎率有明显影响。在相同的操作压力下破碎啤酒母细胞时，刃式结构要影响。在相同的操作压力下破碎啤酒母

41、细胞时，刃式结构要比平式结构的破碎率高比平式结构的破碎率高20-25%。.两种阀座结构的示意图两种阀座结构的示意图 a.平式结构平式结构,b.刃式结构刃式结构第38页，讲稿共127张，创作于星期二设备与机理设备与机理 高压释放破碎细胞机理的研究表明，致使细胞破碎的高压释放破碎细胞机理的研究表明，致使细胞破碎的原因比较复杂。对产元假丝酵母和啤酒酵母细胞破碎机原因比较复杂。对产元假丝酵母和啤酒酵母细胞破碎机理的研究发现由于高速流动造成的碰撞是细胞破碎的主理的研究发现由于高速流动造成的碰撞是细胞破碎的主要原因，而一般的应力切变造成的细胞破碎约只占总破要原因，而一般的应力切变造成的细胞破碎约只占总破碎

42、力的碎力的20%，其它的作用力较难估计。，其它的作用力较难估计。碰撞和一般应力对细胞破碎的影响碰撞和一般应力对细胞破碎的影响碰撞碰撞,一般应力一般应力 第39页，讲稿共127张，创作于星期二影响破碎的因素影响破碎的因素 所有微生物细胞只有施加的压力达到某一水平时才开始破所有微生物细胞只有施加的压力达到某一水平时才开始破碎，继之细胞破碎率随着压力的增加而迅速增加。破碎为一级碎，继之细胞破碎率随着压力的增加而迅速增加。破碎为一级动力学过程：动力学过程：ln1/(1-R)=kNPa N为通过匀浆器阀门的次数，为通过匀浆器阀门的次数，P为操作压力，为操作压力，k为与温度有关的速度常数，为与温度有关的速

43、度常数，a为功率值，为功率值，它与细胞破碎时需要克服的压力范围有关。它与细胞破碎时需要克服的压力范围有关。利用高压匀浆器破碎面包酵母的破碎曲线温度为30,温度为5第40页，讲稿共127张，创作于星期二影响破碎的因素影响破碎的因素 破碎过程中，在很宽的范围内破碎与细胞浓度破碎过程中，在很宽的范围内破碎与细胞浓度(29-224 g/L的干细胞的干细胞)无关。面包酵母破碎时，不同酶的释放速度无关。面包酵母破碎时，不同酶的释放速度不同，集积在细胞壁和胞间质的酶的释放要比可溶性蛋白不同，集积在细胞壁和胞间质的酶的释放要比可溶性蛋白质快些，而在线粒体上的酶的释放与可溶性蛋白质具有相质快些，而在线粒体上的酶

44、的释放与可溶性蛋白质具有相同的速度，在亚细胞颗粒上的酶的释放速度要慢些。同的速度，在亚细胞颗粒上的酶的释放速度要慢些。蛋白与酶释放的相互关系A.酸性磷酸酯酶,B.蔗糖酶,C.葡萄糖-5-磷酸,D.醇脱氢酶,E.碱性磷酸酯酶,F.富马酸酶.第41页，讲稿共127张，创作于星期二影响破碎的因素影响破碎的因素 酵母细胞在酵母细胞在30破碎的破碎率大约比破碎的破碎率大约比5的破碎率高的破碎率高1.5倍。因此倍。因此,在不影响酶活力回收的前题下，适当提高破碎在不影响酶活力回收的前题下，适当提高破碎温度对破碎是有利的。温度对破碎是有利的。高压消耗的能量大部分转化为热量。在高压消耗的能量大部分转化为热量。在

45、200 MPa下压缩下压缩1 ml菌悬液释放热量菌悬液释放热量47卡，可提高温度卡，可提高温度47。因此，在实。因此，在实际操作时，为防止温度过高，需要冷却控制破碎操作际操作时，为防止温度过高，需要冷却控制破碎操作温度。温度。不同微生物细胞因其形态，大小，细胞壁结构不不同微生物细胞因其形态，大小，细胞壁结构不同，在破碎时需要的压力不同。下表列出了不同微生同，在破碎时需要的压力不同。下表列出了不同微生物细胞达到物细胞达到50%破碎率所需要的压力。破碎率所需要的压力。第42页，讲稿共127张，创作于星期二影响破碎的因素影响破碎的因素微生物微生物格兰氏菌格兰氏菌大小大小(m)破碎破碎50%所需压力所

46、需压力(Pa)大肠杆菌阴性2-40.51.5107枯草芽孢杆菌阳性1.5-30.5-0.82.4107干酪乳杆菌阳性40.4-0.73.1107粪链球菌阳性1.021.5108金黄葡萄球菌阳性1.01.9108酿酒酵母阳性7-125-81.5108破碎不同微生物细胞需要的压力破碎不同微生物细胞需要的压力 第43页，讲稿共127张，创作于星期二影响破碎的因素影响破碎的因素细胞破碎率与培养条件和生长期有关。生长在合成培养基细胞破碎率与培养条件和生长期有关。生长在合成培养基上的大肠杆菌要比生长在复杂培养基上的易破碎；对数生长上的大肠杆菌要比生长在复杂培养基上的易破碎；对数生长期中期收获的细胞要比对数

47、生长期后期收获的细胞易破碎。期中期收获的细胞要比对数生长期后期收获的细胞易破碎。细胞类型和培养条件对破碎的影响细胞类型和培养条件对破碎的影响 1.批式培养的产元假丝酵母批式培养的产元假丝酵母 2.连续培养的产元连续培养的产元假丝酵母假丝酵母 3.好气培养的啤酒酵母好气培养的啤酒酵母4.厌气培养厌气培养的面包酵母的面包酵母 5.连续培养的枯草芽孢杆菌连续培养的枯草芽孢杆菌第44页，讲稿共127张，创作于星期二影响破碎的因素影响破碎的因素 高压释放破碎细胞虽然也存在细胞破碎释放原生质高压释放破碎细胞虽然也存在细胞破碎释放原生质物质使破碎物粘度不断增加，改变流变学性质的问题，物质使破碎物粘度不断增加

48、，改变流变学性质的问题，但因不会发生细胞壁降解而形成更小的碎片和释放细胞但因不会发生细胞壁降解而形成更小的碎片和释放细胞壁糖原，避免了破碎物粘度的进一步增加，因此对后序壁糖原，避免了破碎物粘度的进一步增加，因此对后序工艺的影响较小工艺的影响较小。细胞破碎率与细胞悬浮液通过匀浆器的次数成正比，细胞破碎率与细胞悬浮液通过匀浆器的次数成正比，因每次破碎率有限，在实际操作中可以采用批式循环或因每次破碎率有限，在实际操作中可以采用批式循环或混合循环方式。为控制破碎温度，需在细胞悬浮液储罐混合循环方式。为控制破碎温度，需在细胞悬浮液储罐进行冷却降温。进行冷却降温。在细胞悬浮液中加入细玻璃珠，或冷冻细胞悬浮

49、液在细胞悬浮液中加入细玻璃珠，或冷冻细胞悬浮液形成适当量的冰晶，可提高细胞破碎率。形成适当量的冰晶，可提高细胞破碎率。第45页，讲稿共127张，创作于星期二冰冻压缩释放破碎法冰冻压缩释放破碎法第46页，讲稿共127张，创作于星期二设备与机理设备与机理冷冻的细胞悬浮液在低温低压力下不能流动，但提高压力冷冻的细胞悬浮液在低温低压力下不能流动，但提高压力时，水的结晶结构会发生相变，随着压力的增高，水的结晶内时，水的结晶结构会发生相变，随着压力的增高，水的结晶内聚性降低，从不能流动的固相变成可流动的液相；在高压下发聚性降低，从不能流动的固相变成可流动的液相；在高压下发生流动喷射，使细胞破碎生流动喷射，

50、使细胞破碎。压力与温度对水的相图的影响压力与温度对水的相图的影响 第47页，讲稿共127张，创作于星期二设备与机理设备与机理冷压释放破碎器结构示意图冷压释放破碎器结构示意图 1.活塞，活塞，2.尼龙壳，尼龙壳，3.园桶环，园桶环，4.柱塞，柱塞，5.压缩压缩腔内的细胞悬浮液，腔内的细胞悬浮液，6.O-型环，型环，7.园盘，园盘，8.园盘支架，园盘支架，9.固定栓，固定栓，10.空气阀，空气阀，11.螺旋弹簧，螺旋弹簧，12.网网.第48页，讲稿共127张，创作于星期二设备与机理设备与机理 破碎细胞操作中，物料从小孔喷射由压力控制。只有破碎细胞操作中，物料从小孔喷射由压力控制。只有压力高于相变临