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1、关于细胞融合与单克隆抗体(2)第1页，讲稿共118张，创作于星期三引言引言 细胞融合细胞融合(cell fusion)(cell fusion)一、概念一、概念 又称又称体细胞杂交体细胞杂交（somatic hybridiazationsomatic hybridiazation）、）、细胞杂交细胞杂交(cell hybridiazation(cell hybridiazation），在离体条件下用人工的方法把不同类），在离体条件下用人工的方法把不同类型型 的细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。的细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。第2页，讲稿共118张，创作于星期三二、细胞融合的
2、发展历史二、细胞融合的发展历史(一一)“)“自发自发”细胞融合现象细胞融合现象18381838年年 Muller Muller 多核的肿瘤细胞多核的肿瘤细胞18581858年年 Virchow Virchow 正常组织、发炎组织及肿正常组织、发炎组织及肿 瘤组织瘤组织多核细胞多核细胞18731873年年 Luginbuhl Luginbuhl 天花病人天花病人多核体血细胞多核体血细胞18751875年年 Lange Lange 蛙类血液细胞发生合并蛙类血液细胞发生合并细胞融合细胞融合(cell fusion)第3页，讲稿共118张，创作于星期三细胞融合细胞融合(cell fusion)(cel
3、l fusion)第4页，讲稿共118张，创作于星期三细胞融合细胞融合(cell fusion)第5页，讲稿共118张，创作于星期三(二二)重要事件重要事件v19621962年年,(,(日日)冈田善雄冈田善雄 仙台病毒促细胞融合仙台病毒促细胞融合 70 70年代年代,(,(华裔加籍华裔加籍)高国楠高国楠 PEGPEG促植物原生促植物原生 质体的融合质体的融合 80 80年代，电融合年代，电融合细胞融合细胞融合(cell fusion)第6页，讲稿共118张，创作于星期三(三三)植物细胞融合植物细胞融合19721972年（美）年（美）P.S.CarlsonP.S.Carlson杂种烟草杂种烟草现
4、代植物细胞融合的开始现代植物细胞融合的开始19781978年（德）梅歇尔斯年（德）梅歇尔斯“pomoto”“pomoto”细胞融合细胞融合(cell fusion)第7页，讲稿共118张，创作于星期三 植物原生质体培养与细胞融合植物原生质体培养与细胞融合 (Protoplast and Cell fusion)(Protoplast and Cell fusion)植物原生质体培养植物原生质体培养植物细胞融合植物细胞融合 细胞融合细胞融合(cell fusion)第8页，讲稿共118张，创作于星期三(四四)动物细胞融合动物细胞融合 动物细胞融合是研究细胞遗动物细胞融合是研究细胞遗传信息转移，基
5、因在染色体上传信息转移，基因在染色体上的定位以及创造新细胞株的有的定位以及创造新细胞株的有效途径。效途径。细胞融合细胞融合(cell fusion)第9页，讲稿共118张，创作于星期三肿肿瘤瘤细细胞胞与与树树突突状状细细胞胞的的融融合合细胞融合细胞融合(cell fusion)第10页，讲稿共118张，创作于星期三人纤维肉瘤细胞与小鼠畸胎瘤细胞融合人纤维肉瘤细胞与小鼠畸胎瘤细胞融合1978年年(瑞士瑞士)埃勒门斯埃勒门斯(美国美国)柯路斯柯路斯细胞融合细胞融合(cell fusion)第11页，讲稿共118张，创作于星期三人人鼠细胞融合鼠细胞融合第12页，讲稿共118张，创作于星期三(五五)细
6、胞融合的诱导细胞融合的诱导诱导融合的方法诱导融合的方法:物理法物理法:电场刺激、激光、显微操作电场刺激、激光、显微操作 化学法化学法:聚乙二醇聚乙二醇(PEG)(PEG)结合高结合高pHpH、高钙离子法、高钙离子法生物法生物法:仙台病毒仙台病毒细胞融合细胞融合(cell fusion)第13页，讲稿共118张，创作于星期三不同细胞融合的条件及其主要应用不同细胞融合的条件及其主要应用来 源前处理融合方法主要应用动物细胞不需仙台病毒、PEG、电融合生产单克隆抗体植物细胞脱壁PEG、电融合创造植物新品种微生物细胞脱壁PEG高产优质新菌种细胞融合细胞融合(cell fusion)第14页，讲稿共118
7、张，创作于星期三1 1、仙台病毒诱导、仙台病毒诱导仙台病毒仙台病毒(Sendal virus)(Sendal virus)也称日本血凝病毒也称日本血凝病毒HVJHVJ，属粘病毒副流感类群，是，属粘病毒副流感类群，是RNARNA病毒，病毒，多型颗粒状，易在小鼠中蔓延。多型颗粒状，易在小鼠中蔓延。细胞融合细胞融合(cell fusion)第15页，讲稿共118张，创作于星期三融合的可能机制：融合的可能机制：病毒被膜含有糖蛋白，其表面还分布有许多具有神经氨酸酶和凝血病毒被膜含有糖蛋白，其表面还分布有许多具有神经氨酸酶和凝血活性的突起，神经氨酸酶可降解细胞膜上的糖蛋白，使细胞膜局部活性的突起，神经氨酸
8、酶可降解细胞膜上的糖蛋白，使细胞膜局部凝集，再通过膜上蛋白质分子的重新分布，使膜中的脂类分子重排，凝集，再通过膜上蛋白质分子的重新分布，使膜中的脂类分子重排，而打开质膜，导致细胞融合。而打开质膜，导致细胞融合。细胞融合细胞融合(cell fusion)第16页，讲稿共118张，创作于星期三融合过程：融合过程：1.1.病毒颗粒附着细胞膜上起搭桥作用，使细胞粘着成堆，在病毒颗粒附着细胞膜上起搭桥作用，使细胞粘着成堆，在44冰浴中冰浴中细胞紧密靠近，但不发生融合。细胞紧密靠近，但不发生融合。2.37 2.37 温浴后，粘结部位的细胞膜破坏，形成通道，细胞质流通、温浴后，粘结部位的细胞膜破坏，形成通道
9、，细胞质流通、融汇。融汇。3.3.病毒颗粒进入细胞质，此时两个细胞合并、变圆，完成融合，全过病毒颗粒进入细胞质，此时两个细胞合并、变圆，完成融合，全过程约程约15153030分钟。分钟。4.4.细胞核也相互合并细胞核也相互合并,完成细胞融合完成细胞融合细胞融合细胞融合(cell fusion)第17页，讲稿共118张，创作于星期三2 2、PEGPEG诱导诱导PEGPEG聚乙二醇聚乙二醇(polyethylene glycol)(polyethylene glycol)商品名：卡波蜡商品名：卡波蜡(carbowax)(carbowax)多聚化合物，分子式多聚化合物，分子式H(OCH2H(OCH2
10、CH2)nOHCH2)nOH实验室用实验室用PEGPEG平均分子量在平均分子量在20020020,00020,000一般：一般：1,0001,0001,000固体固体常用分子量：常用分子量：4000600040006000细胞融合细胞融合(cell fusion)第18页，讲稿共118张，创作于星期三聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程）法细胞融合过程第19页，讲稿共118张，创作于星期三融合的可能机制融合的可能机制？脱水作用能使细胞凝聚，并使膜结构发生变化脱水作用能使细胞凝聚，并使膜结构发生变化？改变膜表面电荷或膜电位，而导致膜上蛋白质颗粒聚集及膜改变膜表面电荷或膜电位，而导致膜上蛋白
11、质颗粒聚集及膜脂分子随之发生重排之故。脂分子随之发生重排之故。？细胞融合细胞融合(cell fusion)第20页，讲稿共118张，创作于星期三 融合机制种种融合机制种种1）“脂无序脂无序”模型模型 Lucy，1970-19752）Ca2+诱导的侧向诱导的侧向“相分离相分离”模型模型 Papahadjopoulos 19783）六角形）六角形HII构象与膜融合构象与膜融合 Cullis and Hope19784）Ca2+诱导局部脱水与膜融合诱导局部脱水与膜融合 Wilschut and Hoekstra 19845）渗透模型与膜融合）渗透模型与膜融合 Lucy 19866）质子泵驱动膜融合）
12、质子泵驱动膜融合 刘树森1986 膜融合过程大体概括为两大阶段：首先是两膜脂相互聚合和接膜融合过程大体概括为两大阶段：首先是两膜脂相互聚合和接触，其次是接触部位的局部脱水，形成不稳定中间结构，使膜脂触，其次是接触部位的局部脱水，形成不稳定中间结构，使膜脂发生混合而最终导致膜的融合。发生混合而最终导致膜的融合。第21页，讲稿共118张，创作于星期三显微镜下细胞融显微镜下细胞融合过程合过程第22页，讲稿共118张，创作于星期三细胞融合细胞融合(cell fusion)第23页，讲稿共118张，创作于星期三初步分析初步分析 可能是由于带有大量负电荷的可能是由于带有大量负电荷的PEGPEG分子和原生质
13、体表面的负电荷间，分子和原生质体表面的负电荷间，在钙离子的连接下形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着和结合，在钙离子的连接下形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着和结合，在高在高pHpH、高钙离子溶液的作用下，将钙离子和与质膜结合的、高钙离子溶液的作用下，将钙离子和与质膜结合的PEGPEG分子洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上的正分子洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。细胞融合细胞融合(cell fusion)第24页，讲稿共118张，创作于星期三PEGPEG诱导过程
14、注意事项：诱导过程注意事项：控制与分子量、浓度和处理时间控制与分子量、浓度和处理时间悬浮法：将细胞悬于悬浮法：将细胞悬于40405050的的PEG4000PEG4000进行进行融合融合，处理，处理1 12 2分钟为宜。分钟为宜。离心法离心法：先将细胞混合物悬于先将细胞混合物悬于30304040的的PEG4000PEG4000，再离心，再离心进行融合，则可适当延长融合时间，以进行融合，则可适当延长融合时间，以5 58 8分钟为宜。分钟为宜。细胞融合细胞融合(cell fusion)pHpH值以值以pH7.4pH7.48.08.0为宜，或略偏碱性为宜，或略偏碱性pH8.0pH8.08.28.2。辅
15、以辅以5 51515的的DMSODMSO或在融合前用或在融合前用PHAPHA处理一下，效处理一下，效 果更好。果更好。第25页，讲稿共118张，创作于星期三PEGPEG融合法优点融合法优点 效率高效率高 材料方便，操作简易材料方便，操作简易 效果稳定效果稳定PEGPEG融合法缺点融合法缺点 对细胞有毒性对细胞有毒性细胞融合细胞融合(cell fusion)第26页，讲稿共118张，创作于星期三3 3、物理电融合诱导、物理电融合诱导机制机制在直流电脉冲的诱导下在直流电脉冲的诱导下,原生质体质膜表面的电荷原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位变化和氧化还原电位变化,使原生质体粘合并发生质使原生质体粘
16、合并发生质膜瞬间破裂膜瞬间破裂,进而质膜开始连接进而质膜开始连接,直到闭合成完整直到闭合成完整的细胞融合体的细胞融合体细胞融合细胞融合(cell fusion)第27页，讲稿共118张，创作于星期三电融合诱导法原理示意图电融合诱导法原理示意图细胞融合细胞融合(cell fusion)第28页，讲稿共118张，创作于星期三电融合优点：电融合优点：融合效率高，可达融合效率高，可达50508080产生杂交细胞的频率高，是产生杂交细胞的频率高，是PEGPEG法的法的100100倍。倍。操作简便、稳定，但需设备。操作简便、稳定，但需设备。对细胞无毒害作用。对细胞无毒害作用。可在显微镜下观察操作。可在显微
17、镜下观察操作。细胞融合细胞融合(cell fusion)第29页，讲稿共118张，创作于星期三融合率融合率融合细胞的细胞核总数融合细胞的细胞核总数视野内全部细胞的细胞核总数视野内全部细胞的细胞核总数 100100融合率融合率=细胞融合细胞融合(cell fusion)第30页，讲稿共118张，创作于星期三4 4、植物细胞融合基本过程、植物细胞融合基本过程1.1.去除细胞壁以获得大量的原生质体去除细胞壁以获得大量的原生质体2.2.诱导细胞融合形成杂种细胞诱导细胞融合形成杂种细胞 细胞相互靠近细胞相互靠近 形成细胞桥形成细胞桥 最关键的一步最关键的一步 胞质渗透胞质渗透 细胞核融合细胞核融合3.3
18、.筛选筛选,培养培养,促进细胞分裂促进细胞分裂,分化分化,4.4.从细胞团从细胞团,愈伤组织到最后成株愈伤组织到最后成株细胞融合细胞融合(cell fusion)第31页，讲稿共118张，创作于星期三5 5、动物细胞融合基本过程、动物细胞融合基本过程动物单个细胞的获得动物单个细胞的获得组织的获得组织的获得组织的消化组织的消化诱导细胞融合形成杂种细胞诱导细胞融合形成杂种细胞 筛选，培养筛选，培养细胞融合细胞融合(cell fusion)第32页，讲稿共118张，创作于星期三细胞融合细胞融合(cell fusion)第33页，讲稿共118张，创作于星期三植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较植物体细胞
19、杂交和动物细胞融合的比较比较项目植物体细胞杂交动物细胞融合细胞融合的原理细胞膜的流动性、植物细胞全能性细胞膜的流动性细胞融合的方法去处细胞壁后诱导原生质体融合使细胞分散后诱导细胞融合诱导方法物理（显微操作、电融合）化学（聚乙二醇）物理、化学方法（同左）灭活的病毒用途获得杂种植株制备单克隆抗体细胞融合细胞融合(cell fusion)第34页，讲稿共118张，创作于星期三6 6、影响细胞融合的因素、影响细胞融合的因素(1)(1)亲本细胞表面性质，表面覆盖绒毛而不规则者较易融合；亲本细胞表面性质，表面覆盖绒毛而不规则者较易融合；(2)(2)表面光滑者较难融合。表面光滑者较难融合。(2)(2)细胞种
20、类不同，融合效果不同，如腹水癌及株化细胞较易细胞种类不同，融合效果不同，如腹水癌及株化细胞较易 融合，而淋巴细胞或血球细胞几乎不融合。融合，而淋巴细胞或血球细胞几乎不融合。(3)(3)细胞融合时需要适宜温度和运动状态。如仙台病毒诱导欧细胞融合时需要适宜温度和运动状态。如仙台病毒诱导欧 利希氏腹水癌细胞融合时，于利希氏腹水癌细胞融合时，于37 37 振摇时易于融合，且振摇时易于融合，且 融合效率与病毒量呈正比。但在融合效率与病毒量呈正比。但在34 34 振摇则融合率下降。振摇则融合率下降。在在3737时不振摇则几乎不融合。时不振摇则几乎不融合。细胞融合细胞融合(cell fusion)第35页，
21、讲稿共118张，创作于星期三(4)(4)细胞融合过程中，通常耗氧量较大缺氧时经常不融合。空气中含细胞融合过程中，通常耗氧量较大缺氧时经常不融合。空气中含氧量大于氧量大于2020时有一定融合率，但有些细胞在无氧条件下也可融合。时有一定融合率，但有些细胞在无氧条件下也可融合。(5)(5)有些细胞融合时需要有些细胞融合时需要Ca2+Ca2+，否则不融合，细胞蛋白质亦发生，否则不融合，细胞蛋白质亦发生 变化。实验表明变化。实验表明Sr2+Sr2+、Ba2+Ba2+、Mg2+Mg2+、Mn2+Mn2+等离子可代替等离子可代替 Ca2+Ca2+但有效浓度较但有效浓度较Ca2+Ca2+大的多。融合时最适合的
22、离子强度大的多。融合时最适合的离子强度 一般为一般为0.1mol/L0.1mol/L(6)(6)最适合的最适合的pHpH为为7 747478 8之间，在此范围之外，融合率均较之间，在此范围之外，融合率均较 低。低。细胞融合细胞融合(cell fusion)第36页，讲稿共118张，创作于星期三7 7、融合细胞的特征及其意义、融合细胞的特征及其意义染色体组不稳染色体组不稳定，尤其种间定，尤其种间杂交细胞杂交细胞,培养培养过程中染色体过程中染色体会逐渐丢失会逐渐丢失细胞融合细胞融合(cell fusion)理论研究理论研究基因定位和基因定位和绘制基因图工作中十分有绘制基因图工作中十分有用用应用价值
23、应用价值单克隆抗体、单克隆抗体、植物育种植物育种第37页，讲稿共118张，创作于星期三细胞融合细胞融合(cell fusion)1 1 进行基因定位，绘制人类基因图进行基因定位，绘制人类基因图 家系分析法、细胞融合法、基因剂量效应法、重组家系分析法、细胞融合法、基因剂量效应法、重组DNADNA法、分子杂交法、法、分子杂交法、限制性片段长度多态性技术、脉冲电泳法（限制性片段长度多态性技术、脉冲电泳法（PEGEPEGE）2 2 诱导诱导PCPC染色体染色体3 3 体细胞杂种的致瘤性分析体细胞杂种的致瘤性分析4 4 遗传缺陷的基因互补遗传缺陷的基因互补5 5 分化功能表达调控的研究分化功能表达调控的
24、研究6 6 淋巴细胞杂交瘤技术与单克隆抗体淋巴细胞杂交瘤技术与单克隆抗体7 7 植物细胞的原生质体融合培育杂种植株植物细胞的原生质体融合培育杂种植株8 8 核质相互作用关系核质相互作用关系9 9 基因治疗基因治疗10 10 疾病诊断疾病诊断第38页，讲稿共118张，创作于星期三8 8、融合细胞类型、融合细胞类型同核体（同核体（homokaryonhomokaryon）异核体异核体(heterokaryon(heterokaryon）多核体（多核体（polykaryonpolykaryon）异胞质体异胞质体(heterocybrid)(heterocybrid)细胞融合细胞融合(cell fus
25、ion)第39页，讲稿共118张，创作于星期三 同核体同核体(homokaryon)(homokaryon)同源细胞的融合体。由于是同源细胞，它们的基因型及表现型同源细胞的融合体。由于是同源细胞，它们的基因型及表现型完全一样。完全一样。细胞融合细胞融合(cell fusion)第40页，讲稿共118张，创作于星期三异核体异核体(heterokaryon)(heterokaryon)非同源细胞的融合体。一般是亲源关系较近的细胞，这种亲非同源细胞的融合体。一般是亲源关系较近的细胞，这种亲和杂种细胞含有双亲全部细胞核和细胞质物质，其发育的和杂种细胞含有双亲全部细胞核和细胞质物质，其发育的个体也是可育
26、的，如烟草属种间的细胞杂种。个体也是可育的，如烟草属种间的细胞杂种。细胞融合细胞融合(cell fusion)第41页，讲稿共118张，创作于星期三多核体多核体(polykaryon)(polykaryon)含有双亲不同比例核物质的融合体。亲源关系较远的细含有双亲不同比例核物质的融合体。亲源关系较远的细胞间融合，融合体以一个细胞的核物质为主，只加入另胞间融合，融合体以一个细胞的核物质为主，只加入另一细胞少量遗传物质，如胡萝卜与羊角芹形成部分亲和一细胞少量遗传物质，如胡萝卜与羊角芹形成部分亲和的杂种细胞。的杂种细胞。细胞融合细胞融合(cell fusion)第42页，讲稿共118张，创作于星期三
27、异胞质体异胞质体(heterocybrid)(heterocybrid)不同胞质来源。用射线或细胞松弛素不同胞质来源。用射线或细胞松弛素B B处理一亲本细胞，处理一亲本细胞，使其选择性地丢失核基因形成一个无核的亚原生质体，使其选择性地丢失核基因形成一个无核的亚原生质体，再与一个有核的原生质体融合，获得一个完整的原生质再与一个有核的原生质体融合，获得一个完整的原生质体与另一亲本的细胞质融和的异胞质体。体与另一亲本的细胞质融和的异胞质体。细胞融合细胞融合(cell fusion)第43页，讲稿共118张，创作于星期三9 9、杂种细胞筛选方法、杂种细胞筛选方法 （1 1）遗传互补筛选法）遗传互补筛选
28、法（2 2）抗性互补筛选法）抗性互补筛选法（3 3）生长特性筛选法）生长特性筛选法（4 4）物理特性筛选法）物理特性筛选法细胞融合细胞融合(cell fusion)第44页，讲稿共118张，创作于星期三5.1.1 5.1.1 杂交瘤单克隆抗体技术的原理杂交瘤单克隆抗体技术的原理5.1.2 5.1.2 杂交瘤制备过程杂交瘤制备过程5.1.3 5.1.3 单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的大量制备5.1 单克隆抗体技术单克隆抗体技术第45页，讲稿共118张，创作于星期三免疫系统免疫系统 由淋巴器官、组织、细胞共同构成。由淋巴器官、组织、细胞共同构成。免疫器官：免疫器官：中枢免疫器官：骨髓、胸腺、（鸟
29、、禽）法氏囊中枢免疫器官：骨髓、胸腺、（鸟、禽）法氏囊 外周免疫器官：淋巴结、脾、扁桃体等外周免疫器官：淋巴结、脾、扁桃体等免疫细胞：免疫细胞：造血干细胞、淋巴细胞（造血干细胞、淋巴细胞（T T、B B、NKNK）、白细胞等。）、白细胞等。免疫分子：免疫分子：抗体、补体、细胞因子、干扰素等。抗体、补体、细胞因子、干扰素等。5.1 单克隆抗体技术单克隆抗体技术第46页，讲稿共118张，创作于星期三胸腺胸腺骨髓骨髓中枢淋巴器官中枢淋巴器官中枢淋巴器官中枢淋巴器官外周淋巴器官外周淋巴器官外周淋巴器官外周淋巴器官扁桃体，淋巴结扁桃体，淋巴结淋巴结淋巴结脾脾淋巴管淋巴管肠系膜淋巴结肠系膜淋巴结第47页，
30、讲稿共118张，创作于星期三T T细胞和细胞和B B细胞的分化细胞的分化5.1单克隆抗体技术单克隆抗体技术第48页，讲稿共118张，创作于星期三T T细胞介导的免疫应答细胞介导的免疫应答一、抗原的识别与递呈（感应阶段）一、抗原的识别与递呈（感应阶段）二、反应阶段二、反应阶段三、效应阶段三、效应阶段四、细胞免疫的生物学效应四、细胞免疫的生物学效应5.1 单克隆抗体技术单克隆抗体技术第49页，讲稿共118张，创作于星期三一、抗原的识别与递呈（感应阶段）一、抗原的识别与递呈（感应阶段）（一）（一）APCAPC对抗原的递呈对抗原的递呈（二）（二）T T细胞的双识别细胞的双识别5.1 单克隆抗体技术单克
31、隆抗体技术第50页，讲稿共118张，创作于星期三抗原呈递细胞抗原呈递细胞 (antigen-presenting cell)(antigen-presenting cell)一种特殊类型的细胞，携带细胞表面一种特殊类型的细胞，携带细胞表面MHCMHC（主要组织相容性复合体）（主要组织相容性复合体）IIII类分子，涉及抗原的加工和呈递给辅助类分子，涉及抗原的加工和呈递给辅助T T细胞。细胞。5.1 单克隆抗体技术单克隆抗体技术第51页，讲稿共118张，创作于星期三5.1 单克隆抗体技术单克隆抗体技术第52页，讲稿共118张，创作于星期三T T细胞活化的第一信号细胞活化的第一信号二、反应阶段二、反
32、应阶段由由TCR TCR 识别并结合抗原识别并结合抗原性多肽传递抗原信号；性多肽传递抗原信号；CD4CD4、CD8CD8分子分别识别分子分别识别MHC-IIMHC-II类和类和MHC-IMHC-I类分类分子。子。5.1 单克隆抗体技术单克隆抗体技术第53页，讲稿共118张，创作于星期三 T T细胞活化的第二信号细胞活化的第二信号又称协同刺激信号，又称协同刺激信号，由众多协同刺激分由众多协同刺激分子与相应受子与相应受/配体结配体结合介导，主要是合介导，主要是B7/CD28B7/CD28分子对之间分子对之间的作用。的作用。5.1 单克隆抗体技术单克隆抗体技术第54页，讲稿共118张，创作于星期三T
33、 T细胞在双信号的激发下，表达细胞因子及相应受体，进一步细胞在双信号的激发下，表达细胞因子及相应受体，进一步促进促进T T细胞活化、增殖。细胞活化、增殖。若若TCRTCR特异性识别并结合抗原肽的过程中缺乏协同刺激信号，特异性识别并结合抗原肽的过程中缺乏协同刺激信号，则则T T细胞被诱导呈不应答。细胞被诱导呈不应答。5.1 单克隆抗体技术单克隆抗体技术第55页，讲稿共118张，创作于星期三（三）（三）T T细胞的增殖和分化细胞的增殖和分化CD4+TH CD4+TH 分化为：分化为：TH1 TH1 CD8+CTLCD8+CTL（TC)TC)分化为：分化为：有杀伤效应的有杀伤效应的CTL CTL（T
34、C)TC)5.1 单克隆抗体技术单克隆抗体技术第56页，讲稿共118张，创作于星期三TcTc杀伤细胞杀伤细胞5.1单克隆抗体技术单克隆抗体技术第57页，讲稿共118张，创作于星期三细细胞胞免免疫疫应应答答5.1 单克隆抗体技术单克隆抗体技术第58页，讲稿共118张，创作于星期三体体液液免免疫疫应应答答5.1 单克隆抗体技术单克隆抗体技术第59页，讲稿共118张，创作于星期三抗原：一类能够刺激动物机体的免疫系统，诱导发生免疫抗原：一类能够刺激动物机体的免疫系统，诱导发生免疫 应答，产生体液免疫的抗体和（或）细胞免疫的效应答，产生体液免疫的抗体和（或）细胞免疫的效 应淋巴细胞，并在体内外与之反应的
35、物质。应淋巴细胞，并在体内外与之反应的物质。5.1 单克隆抗体技术单克隆抗体技术第60页，讲稿共118张，创作于星期三能起抗原作用的各类物质必须具备如下特性：能起抗原作用的各类物质必须具备如下特性：(1)(1)外源性外源性 机体以往从未接触过的外源异物或异体；机体以往从未接触过的外源异物或异体；(2)(2)结构性结构性 分子量在分子量在1010，000000以上的大小，分子表面有稳定以上的大小，分子表面有稳定 的环状结构基团的环状结构基团(而非线状基团而非线状基团)作为识别点；作为识别点；(3)(3)特异性特异性 由于抗原有不同的决定簇，产生相应的抗体与由于抗原有不同的决定簇，产生相应的抗体与
36、 抗原间的反应是特异性的。抗原间的反应是特异性的。5.1 单克隆抗体技术单克隆抗体技术第61页，讲稿共118张，创作于星期三抗体：在对抗原刺激的免疫应答中，抗体：在对抗原刺激的免疫应答中，B B淋巴细胞产生的一淋巴细胞产生的一 类糖蛋白类糖蛋白,能与相应抗原特异的结合，产生各种能与相应抗原特异的结合，产生各种 免疫效应（生理效应）的球蛋白。免疫效应（生理效应）的球蛋白。5.1 单克隆抗体技术单克隆抗体技术第62页，讲稿共118张，创作于星期三抗体抗体 (Ig):(Ig):（Immunoglobulin)Immunoglobulin)抗体分类：抗体分类：IgGIgG、IgAIgA、IgMIgM、
37、IgDIgD、IgEIgE抗体结构抗体结构5.1 单克隆抗体技术单克隆抗体技术第63页，讲稿共118张，创作于星期三人体内的五种抗体人体内的五种抗体第64页，讲稿共118张，创作于星期三 抗体作用的机理抗体作用的机理中和反应中和反应 聚集反应聚集反应 沉淀反应沉淀反应 补体活化补体活化5.1 单克隆抗体技术单克隆抗体技术第65页，讲稿共118张，创作于星期三每个每个B B淋巴细胞只能产生一淋巴细胞只能产生一种针对它能够识别的特异性种针对它能够识别的特异性抗原决定簇的抗体，而由这抗原决定簇的抗体，而由这一个细胞通过有丝分裂繁殖一个细胞通过有丝分裂繁殖形成的细胞群称为形成的细胞群称为“克隆克隆”，
38、由这一个克隆系产生的抗，由这一个克隆系产生的抗体称为体称为单克隆抗体单克隆抗体(monoclonal antibody)(monoclonal antibody)。5.1 单克隆抗体技术单克隆抗体技术一种抗原通常具有多种抗原通常具有多个不同的抗原决定族，个不同的抗原决定族，因此能刺激多个因此能刺激多个B B淋巴淋巴细胞产生相应的单克隆细胞产生相应的单克隆抗体，因此血清中的抗抗体，因此血清中的抗体是针对不同抗原决定体是针对不同抗原决定族的单克隆抗体混合物，族的单克隆抗体混合物，称为称为多克隆抗体多克隆抗体。第66页，讲稿共118张，创作于星期三5.1.15.1.1单克隆抗体技术的基本原理单克隆抗
39、体技术的基本原理 KohlerKohler和和Milstein Milstein 于于19751975年将年将正常淋巴细胞正常淋巴细胞（如小鼠脾细胞）、（如小鼠脾细胞）、瘤细胞瘤细胞（如（如骨髓瘤）两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获骨髓瘤）两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获19841984年诺贝尔奖。年诺贝尔奖。5.1 单克隆抗体技术单克隆抗体技术Georges J.F.KohlerGeorges J.F.Kohler Csar MilsteinCsar Milstein利用细胞融合技术，将已免疫过的利用细胞融合技术，将已免疫过的B细胞与骨髓细胞与骨髓瘤细胞融合，在由此形成的单个杂种细
40、胞中，瘤细胞融合，在由此形成的单个杂种细胞中，B细胞细胞提供产生单一型抗体的遗传信息，提供产生单一型抗体的遗传信息，瘤细胞瘤细胞提供连续增殖的遗传信息。提供连续增殖的遗传信息。因此这种杂种细胞既能产生抗体又能无限繁因此这种杂种细胞既能产生抗体又能无限繁殖。殖。第67页，讲稿共118张，创作于星期三1.1.单克隆抗体技术优势单克隆抗体技术优势随着在研究上应用日益广泛，对抗体的数量和质量（专一性）要求越来越随着在研究上应用日益广泛，对抗体的数量和质量（专一性）要求越来越高高数量多数量多:传统的实验动物马传统的实验动物马,兔等免疫不方便兔等免疫不方便 质量高质量高:大动物免疫难以做到单克隆大动物免疫
41、难以做到单克隆用用细胞融合细胞融合技术获得单克隆抗体综合了两方面技术获得单克隆抗体综合了两方面优势优势：淋巴细胞肿瘤淋巴细胞肿瘤:能不断增殖，没有产生专一抗体能力。能不断增殖，没有产生专一抗体能力。从脾脏得到淋巴细胞从脾脏得到淋巴细胞:能产生专一抗体，不能不断增殖。能产生专一抗体，不能不断增殖。5.1单克隆抗体技术单克隆抗体技术第68页，讲稿共118张，创作于星期三 高度均一性高度均一性：纯度很高的均一性抗体纯度很高的均一性抗体 高度专一性高度专一性：只对抗原分子上某一抗原决定簇起反应只对抗原分子上某一抗原决定簇起反应 大量产生及稳定性大量产生及稳定性：杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖之传代杂交瘤
42、细胞能在体内外无限繁殖之传代 2 2 单克隆抗体的单克隆抗体的特性特性5.1 单克隆抗体技术单克隆抗体技术第69页，讲稿共118张，创作于星期三5.1 单克隆抗体技术单克隆抗体技术单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体(monoclonal(monoclonal antibodyantibody，简称，简称，简称，简称McAb)McAb)：将能：将能：将能：将能够产生抗体的够产生抗体的够产生抗体的够产生抗体的B B淋巴细胞和具淋巴细胞和具淋巴细胞和具淋巴细胞和具有无限增殖力的骨髓瘤细胞有无限增殖力的骨髓瘤细胞有无限增殖力的骨髓瘤细胞有无限增殖力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细融合在一起，
43、形成杂交瘤细融合在一起，形成杂交瘤细融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外胞。杂交瘤细胞既能在体外胞。杂交瘤细胞既能在体外胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成快速生长，又能持续分泌成快速生长，又能持续分泌成快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种分单一的特异性抗体。这种分单一的特异性抗体。这种分单一的特异性抗体。这种单一类型单一类型单一类型单一类型的的的的只针对某一特定抗只针对某一特定抗只针对某一特定抗只针对某一特定抗原决定簇原决定簇原决定簇原决定簇的的的的抗体分子抗体分子抗体分子抗体分子，就是单，就是单，就是单，就是单克隆抗体。克隆抗体。克隆抗体。克隆抗体。第7
44、0页，讲稿共118张，创作于星期三3 3 亲本细胞的选择亲本细胞的选择 骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞：1.1.本身不能分泌抗体本身不能分泌抗体2.2.选择次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶选择次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型缺陷型（HGPRTHGPRT-）或者胸腺嘧啶核苷激酶）或者胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型缺陷型（TKTK-）的骨髓瘤细胞）的骨髓瘤细胞5.1 单克隆抗体技术单克隆抗体技术 B B淋巴细胞：淋巴细胞：1.1.经特定抗原免疫能产生目的抗体的动物淋巴细胞经特定抗原免疫能产生目的抗体的动物淋巴细胞2.2.免疫动物种系要与骨髓瘤细胞系一致或有相近亲源关系免疫动物种系要与骨髓瘤细胞系一致或有相近亲源关系
45、第71页，讲稿共118张，创作于星期三4 4 融合细胞的选择原理融合细胞的选择原理 1964 1964年年Litterlefield Litterlefield HATHAT培养基培养基 HHypoanthine HHypoanthine 次黄嘌呤次黄嘌呤 AAminopterin AAminopterin 氨基喋呤氨基喋呤 TThymidine TThymidine 胸腺嘧啶脱氧核苷胸腺嘧啶脱氧核苷5.1 单克隆抗体技术单克隆抗体技术第72页，讲稿共118张，创作于星期三原理：原理：正常及普通癌细胞不但具有利用培养液中的谷氨酰胺和尿核苷单磷酸合正常及普通癌细胞不但具有利用培养液中的谷氨酰胺和
46、尿核苷单磷酸合成成DNADNA的能力，而且当这条主要途径被氨基喋呤（的能力，而且当这条主要途径被氨基喋呤（A A）阻断时，）阻断时，还具有利用培养液中现成的次黄嘌呤（还具有利用培养液中现成的次黄嘌呤（H H）和胸腺嘧啶脱氧核苷）和胸腺嘧啶脱氧核苷（T T）在次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（）在次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRTHGPRT）的作用下，借）的作用下，借此此应急通路应急通路来合成来合成DNADNA的能力。的能力。5.1 单克隆抗体技术单克隆抗体技术第73页，讲稿共118张，创作于星期三嘌呤合成通路的阻断嘌呤合成通路的阻断第74页，讲稿共118张，创作于星期三细胞内细胞内DNADN
47、A的生物合成途径的生物合成途径主要生物合成途径主要生物合成途径应急补救途径应急补救途径氨基喋呤氨基喋呤A次黄嘌呤次黄嘌呤次黄嘌呤次黄嘌呤核苷酸核苷酸HGPRT+TK+胸腺胸腺嘧啶嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶脱氧核苷酸脱氧核苷酸DNA5.1 单克隆抗体技术单克隆抗体技术第75页，讲稿共118张，创作于星期三5.1.2 5.1.2 杂交瘤技术过程杂交瘤技术过程1.1.免疫动物免疫动物2.2.融合细胞的制备融合细胞的制备3.3.两种细胞杂交融合两种细胞杂交融合4.4.分装培养、筛选分装培养、筛选5.5.抗体检测抗体检测6.6.杂交瘤细胞的克隆杂交瘤细胞的克隆7.7.冻存及单克隆的大量生产冻存及单克隆的大量生
48、产5.1 单克隆抗体技术单克隆抗体技术第76页，讲稿共118张，创作于星期三一、免疫动物一、免疫动物一、免疫动物一、免疫动物目的：目的：在在细细胞胞融融合合后后获获得得尽尽可可能能多多的的分分泌泌针针对对于于该该目目标标抗抗原原的的特特异异性性抗抗体体的的杂交瘤细胞杂交瘤细胞.特定目标抗原特定目标抗原动物动物免疫免疫脾脏中脾脏中B B淋巴细胞淋巴细胞B B淋巴细胞大量增殖淋巴细胞大量增殖刺激刺激能分泌针对于该抗原的特能分泌针对于该抗原的特异性抗体异性抗体5.1单克隆抗体技术单克隆抗体技术第77页，讲稿共118张，创作于星期三常规免疫法常规免疫法脾内一次性免疫法脾内一次性免疫法短程免疫法短程免疫
49、法体外免疫法体外免疫法 常用免疫方法：常用免疫方法：稳妥；优势克隆稳妥；优势克隆省时；省抗原省时；省抗原省时省时操作繁琐操作繁琐 5.1 单克隆抗体技术单克隆抗体技术体外法体外法：直接提取大、小鼠淋巴直接提取大、小鼠淋巴细胞，调整为细胞，调整为107个个/ml，加适当浓，加适当浓度抗原，度抗原，34天后，收集被刺激的天后，收集被刺激的淋巴细胞。淋巴细胞。体内法体内法：对细胞或微生物抗对细胞或微生物抗原可直接注射如小鼠体内，原可直接注射如小鼠体内，可溶性蛋白抗原可与等量的可溶性蛋白抗原可与等量的福氏完全佐剂混合乳化后，福氏完全佐剂混合乳化后，注入到动物体内。注入到动物体内。34天后，天后，在无菌
50、条件下可以取出脾或淋在无菌条件下可以取出脾或淋巴结制成悬液，存活率在巴结制成悬液，存活率在95以上的可以用于融合。以上的可以用于融合。第78页，讲稿共118张，创作于星期三常规免疫法：常规免疫法：常规免疫法：常规免疫法：第第1 1次免疫：抗原次免疫：抗原+弗氏完全佐剂弗氏完全佐剂第第2 2次免疫：抗原次免疫：抗原+弗氏不完全佐剂弗氏不完全佐剂第第3 3次免疫：抗原次免疫：抗原 不加佐剂不加佐剂第第4 4次免疫：抗原次免疫：抗原 不加佐剂不加佐剂(皮下注射或静脉注射皮下注射或静脉注射)(皮下注射皮下注射)(皮下注射皮下注射)(静脉注射静脉注射)5.1 单克隆抗体技术单克隆抗体技术皮下皮下注射注射