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1、关于细菌学检验基本技术1第1页，讲稿共30张，创作于星期二2主要内容主要内容第一节第一节 样本的采集与送检原则样本的采集与送检原则第二节第二节 细菌的分离培养方法细菌的分离培养方法第三节第三节 细菌的形态结构检查法细菌的形态结构检查法第四节第四节 细菌的生化反应检查法细菌的生化反应检查法第五节第五节 细菌的血清学检验细菌的血清学检验第六节第六节 细菌毒素的检测细菌毒素的检测第七节第七节 细菌数量的测定细菌数量的测定第八节第八节 细菌细菌L型检验型检验第九节第九节 微生物菌种的保藏及保管微生物菌种的保藏及保管第2页，讲稿共30张，创作于星期二3第一节第一节 样本的采集与送检原则样本的采集与送检原
2、则 一、细菌学检验样本的类型一、细菌学检验样本的类型正常人体样本，如排泄物、血液、血清等正常人体样本，如排泄物、血液、血清等食品、水产品、化妆品、药品、消毒及卫生用品、医疗用品及环境食品、水产品、化妆品、药品、消毒及卫生用品、医疗用品及环境（水、土壤、空气，各种物品）等卫生样本，包括常规卫生评价、（水、土壤、空气，各种物品）等卫生样本，包括常规卫生评价、公共卫生事件、环境监测、委托送检等标本公共卫生事件、环境监测、委托送检等标本临床各种感染材料（试剂、样品、耗材、医疗废弃物等）临床各种感染材料（试剂、样品、耗材、医疗废弃物等）动物尸检或感染材料。动物尸检或感染材料。第3页，讲稿共30张，创作于
3、星期二4二、采样的一般原则二、采样的一般原则（1）无菌原则）无菌原则采样用具要无菌且在有效期内；采样用具要无菌且在有效期内；采样操作程序要无菌；采样操作程序要无菌；如果采样部位需要经过皮肤和粘膜时，做好外表面的消毒，防止污染。如果采样部位需要经过皮肤和粘膜时，做好外表面的消毒，防止污染。密封送检密封送检（2）选择正确的采样时间）选择正确的采样时间分离病原菌时，应早期采样；分离病原菌时，应早期采样；最好是病人发病早期、急性期或症状典型时；最好是病人发病早期、急性期或症状典型时；用药前采样，或停药用药前采样，或停药24h采样，或下一次用药前采样采样，或下一次用药前采样用于血清学诊断时，急性期及恢复
4、期采集双份血清。用于血清学诊断时，急性期及恢复期采集双份血清。第4页，讲稿共30张，创作于星期二5（3）选择正确的采样部位）选择正确的采样部位根据感染特点、病程发展及目的菌可能存在的部位，选择合适的解剖部位采样。根据感染特点、病程发展及目的菌可能存在的部位，选择合适的解剖部位采样。（4）采集足够量样本）采集足够量样本采样量不能太少，过少样品会导致假阴性结果；采样量不能太少，过少样品会导致假阴性结果；卫生样本要具有代表性，否则会影响评价的准确性。卫生样本要具有代表性，否则会影响评价的准确性。（5）多样性采集）多样性采集感染进程复杂的，应多部位或多时间段采样，以防漏检。感染进程复杂的，应多部位或多
5、时间段采样，以防漏检。（6）做好采样记录）做好采样记录记录样本类别、采样时间、地点、采样量及采样人等信息。记录样本类别、采样时间、地点、采样量及采样人等信息。第5页，讲稿共30张，创作于星期二6三、样本送运原则三、样本送运原则（1）选择适当的温度和时间）选择适当的温度和时间送检时间长或温度高，菌相将发生改变，影响结果的准确性；送检时间长或温度高，菌相将发生改变，影响结果的准确性；应遵循尽快送检的原则；应遵循尽快送检的原则；常规细菌学检查，不超过常规细菌学检查，不超过2h，最好，最好1h内，保存在内，保存在4中不超过中不超过24h。含有脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌等的样品，低温自溶，含
6、有脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌等的样品，低温自溶，应在应在25常温送检或用便携式培养箱送检常温送检或用便携式培养箱送检第6页，讲稿共30张，创作于星期二7（2）选择正确的气体环境）选择正确的气体环境针对厌氧菌样本，注意隔绝空气氧；针对厌氧菌样本，注意隔绝空气氧；如使用专门的厌氧采样瓶或试管，或人为的排出空气，或直接接如使用专门的厌氧采样瓶或试管，或人为的排出空气，或直接接种于厌氧培养基或放在厌氧袋、厌氧盒中种于厌氧培养基或放在厌氧袋、厌氧盒中（3）保持密闭状态）保持密闭状态第7页，讲稿共30张，创作于星期二8便携式恒温培养箱便携式恒温培养箱便携式冷藏保温箱便携式冷藏保温箱厌氧培养袋厌
7、氧培养袋厌氧罐厌氧罐厌氧瓶厌氧瓶第8页，讲稿共30张，创作于星期二9第二节第二节 细菌的分离培养方法细菌的分离培养方法细菌的分离培养细菌的分离培养 提供细菌生长所需的各种条件（营养、温度、湿度、酸碱度和气提供细菌生长所需的各种条件（营养、温度、湿度、酸碱度和气体），从样本中获得该种细菌活的纯化物的过程。体），从样本中获得该种细菌活的纯化物的过程。主要内容包括主要内容包括 培养基制备、培养基制备、细菌接种方法、细菌培养方法、细菌的生长现细菌接种方法、细菌培养方法、细菌的生长现象象第9页，讲稿共30张，创作于星期二10第10页，讲稿共30张，创作于星期二11一、培养基的制备一、培养基的制备培养基培
8、养基 是指经人工配制，将供细菌生长繁殖需要的各种营养物质是指经人工配制，将供细菌生长繁殖需要的各种营养物质按比例配制而成的基质，可用于细菌的分离纯化、传代、按比例配制而成的基质，可用于细菌的分离纯化、传代、鉴定、菌种保存等。鉴定、菌种保存等。第11页，讲稿共30张，创作于星期二12（一）培养基的主要成分及其作用（一）培养基的主要成分及其作用P261.营养物质：营养物质：碳源、氮源及其它营养物质（蛋白胨、肉浸液、牛肉浸膏、糖碳源、氮源及其它营养物质（蛋白胨、肉浸液、牛肉浸膏、糖类、血液、鸡蛋、动物血清、酵母粉、生长因子、无机盐类）。类、血液、鸡蛋、动物血清、酵母粉、生长因子、无机盐类）。2.水分
9、：水分：常用蒸馏水。常用蒸馏水。3.凝固物质：凝固物质：琼脂、明胶琼脂、明胶4.抑制剂和指示剂：抑制剂和指示剂：如胆盐、抗生素、酸碱指示剂、氧化还原指示剂等。如胆盐、抗生素、酸碱指示剂、氧化还原指示剂等。第12页，讲稿共30张，创作于星期二13（二）培养基制备的一般程序（二）培养基制备的一般程序调配调配矫正矫正pH过滤澄清过滤澄清分装分装灭菌灭菌检定检定保存称量、溶解称量、溶解氢氧化钠、盐酸（氢氧化钠、盐酸（0.1mol/L、1mol/L）高出所需高出所需pH0.1-0.2个单位个单位先调先调pH，沸水加热，沸水加热5-10min，冷却后过，冷却后过滤；滤纸、绒布等过滤滤；滤纸、绒布等过滤液体
10、：不超过容器液体：不超过容器2/3；斜面：；斜面：1/管；半固体培养基：管；半固体培养基：1/3管管；高层；高层斜面：斜面：1/41/3管管；平板：；平板：1315ml耐高压：耐高压：121，15min含糖：含糖：115，15min鸡蛋、牛奶等：间歇灭菌鸡蛋、牛奶等：间歇灭菌3天天3次次不耐高温的血清、尿素等：滤过除菌不耐高温的血清、尿素等：滤过除菌外观：完整性、水分浸入、色泽异常、培养基外溢、干裂等弃去。外观：完整性、水分浸入、色泽异常、培养基外溢、干裂等弃去。外观：完整性、水分浸入、色泽异常、培养基外溢、干裂等弃去。外观：完整性、水分浸入、色泽异常、培养基外溢、干裂等弃去。无菌试验：放入无
11、菌试验：放入无菌试验：放入无菌试验：放入361361过夜，有菌生长弃去。过夜，有菌生长弃去。过夜，有菌生长弃去。过夜，有菌生长弃去。功能检查：标准菌株培养功能检查：标准菌株培养功能检查：标准菌株培养功能检查：标准菌株培养242448h48h，无菌或生长不好。重复接种结果仍同前，无菌或生长不好。重复接种结果仍同前，无菌或生长不好。重复接种结果仍同前，无菌或生长不好。重复接种结果仍同前，弃去。弃去。弃去。弃去。冷藏，不宜过久。冷藏，不宜过久。防止干涸、变质和污染。防止干涸、变质和污染。第13页，讲稿共30张，创作于星期二14所用器材及所用器材及过过程程 培养基培养基、玻璃器皿天、玻璃器皿天平、平、
12、药药匙匙 第14页，讲稿共30张，创作于星期二151.以量筒量筒装取适当量蒸蒸馏馏水水于玻璃容器中 2.于玻璃容器上标示培养基名称 第15页，讲稿共30张，创作于星期二161.放上秤药纸並归归零零 2.以秤药匙舀出适当量药品(请看培养基配方上说明)第16页，讲稿共30张，创作于星期二17倾倒培养基时小心不要沾到玻璃壁上 第17页，讲稿共30张，创作于星期二181.清理配药桌面与天平 2.清洗秤药匙，擦干放回 3.药品放回药品柜 第18页，讲稿共30张，创作于星期二191.按物理性状分类按物理性状分类液体培养基液体培养基半固体培养基（琼脂含量半固体培养基（琼脂含量0.51%）固体培养基（琼脂含量
13、固体培养基（琼脂含量22.5%）（三）培养基的种类（三）培养基的种类第19页，讲稿共30张，创作于星期二20液体培养基液体培养基液体培养基液体培养基 主要用于增菌培养、生化试验等主要用于增菌培养、生化试验等主要用于增菌培养、生化试验等主要用于增菌培养、生化试验等沉沉淀淀生生长长混混浊浊生生长长表表面面生生长长液体培养基中生长液体培养基中生长第20页，讲稿共30张，创作于星期二21 制备平板、斜面、高层及高层斜面，用于细菌制备平板、斜面、高层及高层斜面，用于细菌分离培养、鉴定和保存、増菌等。分离培养、鉴定和保存、増菌等。固体培养基固体培养基固体培养基固体培养基 第21页，讲稿共30张，创作于星期
14、二22 观察微生物的动力，分类鉴定、保存菌种观察微生物的动力，分类鉴定、保存菌种以及噬菌体效价滴定等。以及噬菌体效价滴定等。有鞭有鞭毛，毛，混浊混浊生长生长无鞭无鞭毛，毛，沿穿沿穿刺线刺线生长生长半固体培养基半固体培养基半固体培养基半固体培养基 第22页，讲稿共30张，创作于星期二232.按成分分类按成分分类合成培养基合成培养基由化学物质和成分已知的各种物质所组成，可以是无机由化学物质和成分已知的各种物质所组成，可以是无机盐类，或无机盐类加有机物质。盐类，或无机盐类加有机物质。各批次性质稳定，用于细菌代谢、分类、菌种选育、遗各批次性质稳定，用于细菌代谢、分类、菌种选育、遗传分析等情况使用。传分
15、析等情况使用。天然培养基天然培养基化学成分不完全清楚，各批物质的成分很难一致，如蛋化学成分不完全清楚，各批物质的成分很难一致，如蛋白胨、牛肉膏、血液、鸡蛋。白胨、牛肉膏、血液、鸡蛋。成本较低，在细菌学研究中常用。成本较低，在细菌学研究中常用。第23页，讲稿共30张，创作于星期二243.按用途分类按用途分类（1）基础培养基）基础培养基含有大部分细菌生长繁殖所需的最基本的营养成分。含有大部分细菌生长繁殖所需的最基本的营养成分。普通肉汤、营养琼脂、蛋白胨水等普通肉汤、营养琼脂、蛋白胨水等（2）营养培养基）营养培养基在基础培养基上加入葡萄糖、血液、血清等营养成分，以满足在基础培养基上加入葡萄糖、血液、
16、血清等营养成分，以满足对营养要求较高和需要特殊生长因子的细菌生长繁殖。对营养要求较高和需要特殊生长因子的细菌生长繁殖。血液琼脂培养基、血清肉汤培养基、巧克力血琼脂培养基。血液琼脂培养基、血清肉汤培养基、巧克力血琼脂培养基。（3）增菌培养基）增菌培养基在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物。加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物。加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微
17、生物。加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物。多为液体培养基，一般具有选择性抑制作用的抑制剂。多为液体培养基，一般具有选择性抑制作用的抑制剂。有助于目的菌的增殖有助于目的菌的增殖第24页，讲稿共30张，创作于星期二25常用増菌培养基常用増菌培养基 胆盐乳糖培养基（胆盐乳糖培养基（BL）大肠杆菌增菌大肠杆菌增菌 亚硒酸盐增菌培养基亚硒酸盐增菌培养基沙门氏菌增菌沙门氏菌增菌亚硒酸盐半胱氨酸增菌培养基亚硒酸盐半胱氨酸增菌培养基食品中沙门氏菌增菌食品中沙门氏菌增菌四硫磺酸钠亮绿基础培养基四硫磺酸钠亮绿基础培养基沙门氏菌增菌沙门氏菌增菌GN肉汤培养基肉汤培养基志贺氏菌增菌志贺氏菌增菌碱性蛋白胨水培养
18、基碱性蛋白胨水培养基霍乱弧菌增菌霍乱弧菌增菌7.5%氯化钠肉汤培养基氯化钠肉汤培养基金黄色葡萄球菌增菌金黄色葡萄球菌增菌缓冲蛋白胨水培养基缓冲蛋白胨水培养基沙门氏菌增菌沙门氏菌增菌血液增菌培养基血液中细菌增菌血液中细菌增菌SCDLP液体基础培养基液体基础培养基化妆品中细菌增菌化妆品中细菌增菌第25页，讲稿共30张，创作于星期二26（4）选择性培养基）选择性培养基多为固体培养基，加有抑制物质，抑制其它多为固体培养基，加有抑制物质，抑制其它非目的菌的生长或使其生长不佳。非目的菌的生长或使其生长不佳。第26页，讲稿共30张，创作于星期二27常用的选择培养基常用的选择培养基 名名名名 称称称称 用用用
19、用 途途途途SSSS琼脂培养基琼脂培养基琼脂培养基琼脂培养基 沙门氏和志贺氏菌属分离沙门氏和志贺氏菌属分离沙门氏和志贺氏菌属分离沙门氏和志贺氏菌属分离HEHE琼脂培养基琼脂培养基琼脂培养基琼脂培养基志贺氏菌分离鉴别志贺氏菌分离鉴别志贺氏菌分离鉴别志贺氏菌分离鉴别伊红美蓝琼脂培养基伊红美蓝琼脂培养基伊红美蓝琼脂培养基伊红美蓝琼脂培养基 大肠杆菌、产气杆菌分离鉴别大肠杆菌、产气杆菌分离鉴别大肠杆菌、产气杆菌分离鉴别大肠杆菌、产气杆菌分离鉴别麦康凯琼脂培养基（麦康凯琼脂培养基（麦康凯琼脂培养基（麦康凯琼脂培养基（MacCMacC）肠道致病菌分离肠道致病菌分离肠道致病菌分离肠道致病菌分离甘露醇高盐琼脂
20、培养基）甘露醇高盐琼脂培养基）甘露醇高盐琼脂培养基）甘露醇高盐琼脂培养基）绿脓杆菌分离鉴别绿脓杆菌分离鉴别绿脓杆菌分离鉴别绿脓杆菌分离鉴别XLDXLD琼脂培养基琼脂培养基琼脂培养基琼脂培养基志贺氏、沙门氏菌分离志贺氏、沙门氏菌分离志贺氏、沙门氏菌分离志贺氏、沙门氏菌分离中国蓝琼脂培养基中国蓝琼脂培养基中国蓝琼脂培养基中国蓝琼脂培养基肠道菌分离鉴别肠道菌分离鉴别肠道菌分离鉴别肠道菌分离鉴别碱性琼脂培养基碱性琼脂培养基碱性琼脂培养基碱性琼脂培养基霍乱弧菌分离霍乱弧菌分离霍乱弧菌分离霍乱弧菌分离高盐蔡氏琼脂培养基高盐蔡氏琼脂培养基高盐蔡氏琼脂培养基高盐蔡氏琼脂培养基真菌、酵母菌分离真菌、酵母菌分离真
21、菌、酵母菌分离真菌、酵母菌分离第27页，讲稿共30张，创作于星期二28（5）鉴别培养基）鉴别培养基利用各种细菌分解糖类和蛋白质等的能力及其代谢产物的不利用各种细菌分解糖类和蛋白质等的能力及其代谢产物的不同，在此类培养基中加入了某些特定的作用底物，用于检查同，在此类培养基中加入了某些特定的作用底物，用于检查各种细菌的生化反应，以鉴别和鉴定细菌。各种细菌的生化反应，以鉴别和鉴定细菌。名名名名 称称称称用用用用 途途途途蛋白胨水培养基蛋白胨水培养基蛋白胨水培养基蛋白胨水培养基靛基质和霍乱红试验靛基质和霍乱红试验靛基质和霍乱红试验靛基质和霍乱红试验乳糖胆盐发酵培养基乳糖胆盐发酵培养基乳糖胆盐发酵培养基
22、乳糖胆盐发酵培养基大肠杆菌发酵乳糖试验大肠杆菌发酵乳糖试验大肠杆菌发酵乳糖试验大肠杆菌发酵乳糖试验0.5%0.5%0.5%0.5%乳糖发酵培养基乳糖发酵培养基乳糖发酵培养基乳糖发酵培养基肠道菌生化试验（复发酵）肠道菌生化试验（复发酵）肠道菌生化试验（复发酵）肠道菌生化试验（复发酵）半固体培养基半固体培养基半固体培养基半固体培养基动力试验和菌种保存动力试验和菌种保存动力试验和菌种保存动力试验和菌种保存三糖铁琼脂培养基（三糖铁琼脂培养基（三糖铁琼脂培养基（三糖铁琼脂培养基（TSTTSTTSTTST）肠杆菌糖发酵及硫化氢反应肠杆菌糖发酵及硫化氢反应肠杆菌糖发酵及硫化氢反应肠杆菌糖发酵及硫化氢反应氰化
23、钾基础培养基氰化钾基础培养基氰化钾基础培养基氰化钾基础培养基沙门氏菌分离沙门氏菌分离沙门氏菌分离沙门氏菌分离脱羧酶试验对照培养基脱羧酶试验对照培养基脱羧酶试验对照培养基脱羧酶试验对照培养基细菌脱羧酶试验细菌脱羧酶试验细菌脱羧酶试验细菌脱羧酶试验第28页，讲稿共30张，创作于星期二29（6）厌氧培养基）厌氧培养基培养基氧化还原电势低，有利于厌氧菌的生长。培养基氧化还原电势低，有利于厌氧菌的生长。如庖肉培养基肉渣中含有谷胱甘肽及不饱和脂肪酸，如庖肉培养基肉渣中含有谷胱甘肽及不饱和脂肪酸，可降低氧化还原电势，吸收环境中的氧气，从而造可降低氧化还原电势，吸收环境中的氧气，从而造成缺氧状态。成缺氧状态。（7）特殊培养基）特殊培养基如培养如培养L型细菌及支原体的软琼脂培养基、孢子培型细菌及支原体的软琼脂培养基、孢子培养基等。养基等。第29页，讲稿共30张，创作于星期二感谢大家观看第30页，讲稿共30张，创作于星期二