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1、关于胚胎工程实验技术第1页，讲稿共52张，创作于星期三 指对动物指对动物早期胚胎或配子早期胚胎或配子所进行的多种显微所进行的多种显微操作和处理技术。包括体外受精、胚胎移植、胚胎分操作和处理技术。包括体外受精、胚胎移植、胚胎分割移植、胚胎干细胞培养等技术。割移植、胚胎干细胞培养等技术。即即各种胚胎操作各种胚胎操作技术技术。研究对象：研究对象：胚胎工程：胚胎工程：主要是高等脊椎动物，尤其是哺乳动物主要是高等脊椎动物，尤其是哺乳动物研究水平：研究水平：细胞水平细胞水平定义：定义：操作对象：操作对象：早期胚胎或配子早期胚胎或配子第2页，讲稿共52张，创作于星期三第第2 2节节 胚胎工程实验技术胚胎工程
2、实验技术第3页，讲稿共52张，创作于星期三一、人工授精和胚胎体外培养一、人工授精和胚胎体外培养（一）人工授精：（一）人工授精：1、精子的获取、精子的获取2、卵细胞的获取、卵细胞的获取3、体外授精、体外授精第4页，讲稿共52张，创作于星期三（一）人工授精：（一）人工授精：2 2、卵细胞的获取：、卵细胞的获取：可采集部位：可采集部位：卵巢、输卵管、子宫卵巢、输卵管、子宫卵母细胞方法：方法：手术法：手术法：非手术法：非手术法：中小型动物，如鼠、兔、羊中小型动物，如鼠、兔、羊大型动物，如牛大型动物，如牛超数排卵超数排卵冲洗输卵管采卵冲洗输卵管采卵子宫冲卵子宫冲卵第6页，讲稿共52张，创作于星期三超排卵
3、技术超排卵技术 利用利用促性腺激素促性腺激素处理，使得卵处理，使得卵巢中有更多的卵泡发育，更多的巢中有更多的卵泡发育，更多的卵被排出，这个过程就称为超数卵被排出，这个过程就称为超数排卵。排卵。第7页，讲稿共52张，创作于星期三（一）人工授精：（一）人工授精：3 3、体外授精：、体外授精：获取的卵获取的卵细胞细胞培养液培养液M中卵中卵母细胞母细胞获取获取的精的精液液精子精子精浆精浆离心分离心分离离精精子子获能获能培养培养获能的获能的精子精子培养液培养液法法显微注显微注射法射法受受精精卵卵第10页，讲稿共52张，创作于星期三一、人工授精和胚胎体外培养一、人工授精和胚胎体外培养（二）体外培养（二）体
4、外培养受受精精卵卵发育培发育培养液养液由于不同时期的胚胎生理代谢不同，故需配置一系列含有由于不同时期的胚胎生理代谢不同，故需配置一系列含有不同成分的不同成分的培养液培养液（CO2、O2、AA、核苷酸、无机盐、能源、核苷酸、无机盐、能源物质、维生素、激素、动物血清等。）物质、维生素、激素、动物血清等。）早期早期胚胎胚胎冷冻保存冷冻保存植入受体植入受体第11页，讲稿共52张，创作于星期三 胚胎体外培养胚胎体外培养是胚胎工程的核心技术，但是由是胚胎工程的核心技术，但是由于哺乳动物胚胎发育条件异常复杂，因此，只能培于哺乳动物胚胎发育条件异常复杂，因此，只能培养不同阶段的胚胎，养不同阶段的胚胎，目前还无
5、从受精卵培养到新生目前还无从受精卵培养到新生儿的全体外培养儿的全体外培养。第12页，讲稿共52张，创作于星期三 指将雌性动物指将雌性动物体内的体内的早期胚胎早期胚胎，或者通，或者通过过体外受精及其他方式体外受精及其他方式获得的获得的胚胎胚胎，移植到，移植到同种的、同种的、生理状态相同生理状态相同的其他雌性动物体内，使之继续发育的其他雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。为新个体的技术。二、胚胎移植技术二、胚胎移植技术1、定义：、定义：第13页，讲稿共52张，创作于星期三1、定义：、定义：良种雌性动物良种雌性动物体内体内的早期胚胎的早期胚胎体外体外授精或其他方授精或其他方式获得的胚胎式获得的
6、胚胎（超数排卵获得（超数排卵获得多个胚胎）多个胚胎）植入植入其他雌性动物其他雌性动物供体供体发育发育个体个体受体受体二、胚胎移植技术二、胚胎移植技术条件：生产价值条件：生产价值高、性状优良高、性状优良条件：同种、条件：同种、同期发情、健同期发情、健康康胚胎来源胚胎来源第14页，讲稿共52张，创作于星期三培养培养体内体内授精授精超数超数排卵排卵2、胚胎的来源：、胚胎的来源：二、胚胎移植技术二、胚胎移植技术体外体外授精授精供体供体多个卵多个卵细胞细胞多个早多个早期胚胎期胚胎取取出出手术法手术法非手术法非手术法多个受多个受精卵精卵早期胚胎早期胚胎第16页，讲稿共52张，创作于星期三3、胚胎植入：、胚
7、胎植入：二、胚胎移植技术二、胚胎移植技术手术法：手术法：非手术法：非手术法：取出输卵管和子宫，注入胚胎取出输卵管和子宫，注入胚胎通过一定的器械，注入胚胎通过一定的器械，注入胚胎第17页，讲稿共52张，创作于星期三4、基本程、基本程序：序：以牛为例以牛为例第19页，讲稿共52张，创作于星期三供体母牛供体母牛良良种种公公牛牛受体母牛受体母牛同期发情处理同期发情处理超数排卵超数排卵精子精子受精卵受精卵早期胚胎早期胚胎收集胚胎收集胚胎冲胚冲胚发育发育检测检测健康胚健康胚胎胎胚胎移胚胎移植植保存保存手术法手术法非手术法非手术法分娩分娩胚胎移植后代胚胎移植后代体体内内授授精精多个卵细胞多个卵细胞第20页，
8、讲稿共52张，创作于星期三良种母牛良种母牛卵母细胞的体外培养卵母细胞的体外培养良种公牛良种公牛精子体外获能精子体外获能体外受精体外受精良种牛体外受精胚胎良种牛体外受精胚胎胚胎移植胚胎移植受体牛受体牛良种犊牛良种犊牛成熟期牛成熟期牛屠宰加工厂屠宰加工厂市场市场采集卵巢中的卵采集卵巢中的卵母细胞母细胞“试试管管牛牛”工工厂厂化化生生产产的的技技术术流流程程图图超数排卵超数排卵有有性性生生殖殖第21页，讲稿共52张，创作于星期三5 5、胚胎移植的现状和意义、胚胎移植的现状和意义1)1)保持供体优良特性保持供体优良特性(加速育种工作和品种改良加速育种工作和品种改良)2)2)节约成本节约成本费用费用(大
9、量节省购买种畜的费用大量节省购买种畜的费用)；3)3)大规模繁殖大规模繁殖(一胎多产一胎多产)；4)4)保存品种资源和保存品种资源和保护保护濒危物种；濒危物种；5)5)充分发挥雌性个体的繁殖潜力充分发挥雌性个体的繁殖潜力,缩短供体本身的繁殖缩短供体本身的繁殖周期周期。第23页，讲稿共52张，创作于星期三第24页，讲稿共52张，创作于星期三三、胚胎分割三、胚胎分割优势优势:可成倍增加胚胎数量，可以快速繁殖良种畜。可成倍增加胚胎数量，可以快速繁殖良种畜。概念概念:将早期胚胎切割成将早期胚胎切割成2等份，等份，4等份或等份或8等份等，等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。经移植获得同卵双胎或多胎的
10、技术。第25页，讲稿共52张，创作于星期三一）胚胎分割技术研究概况 胚胎分割技术开始于Nicholas（1942）对大鼠2-细胞卵裂球的分离和培养。其后，Tarkowski等研究了小鼠1/4,2/4,3/4卵裂球的发展规律,得到了世界上首例半胚来源的活体动物。20世纪70年代以来,随着胚胎培养及移植技术的发展和提高,哺乳动物胚胎分割技术取得了突破性进展。目前胚胎分割的研究方向也正向着简单化和实用化发展。我国1986年张涌等首次利用胚胎分割方法获得同卵双生小鼠，1987年又获得同卵双生山羊。1986年窦忠英等获得分割胚牛犊，1990年又获得奶牛四分胚后代。1987年谭丽玲等获得同卵双生犊。第26
11、页，讲稿共52张，创作于星期三第27页，讲稿共52张，创作于星期三特点：特点：后代具有相同的遗传物质，克隆后代具有相同的遗传物质，克隆选择的胚胎：选择的胚胎：发育良好的，形态正常的桑椹胚或囊胚发育良好的，形态正常的桑椹胚或囊胚使用的主要仪器：使用的主要仪器：体视显微镜、显微操作仪、切割刀、切割针体视显微镜、显微操作仪、切割刀、切割针注意注意:将内细胞团均等分裂将内细胞团均等分裂第28页，讲稿共52张，创作于星期三 二）胚胎分割的基本程序二）胚胎分割的基本程序 切割器具的准备；切割器具的准备；胚胎的预处理；胚胎的预处理；胚胎的分割；胚胎的分割；分割胚的培养；分割胚的培养；分割胚的移植；分割胚的移
12、植；第29页，讲稿共52张，创作于星期三1.切割器具切割器具体视显微镜；显微操作仪；胚胎固定管；胚胎分割针；第30页，讲稿共52张，创作于星期三2.胚胎的预处理胚胎的预处理用链霉蛋白酶处理 链霉蛋白酶的作用：使透明带软化、变薄或去除第31页，讲稿共52张，创作于星期三3.胚胎的分割方法胚胎的分割方法酶解法：用链霉蛋白酶处理机械法：用分割针切开透明带第32页，讲稿共52张，创作于星期三胚胎分割的基本操作胚胎分割的基本操作选择良好的桑椹胚或选择良好的桑椹胚或囊胚移入培养皿中，囊胚移入培养皿中，用分割针或分割刀片用分割针或分割刀片将其切开，吸出其中将其切开，吸出其中的半个胚胎注入透明的半个胚胎注入透
13、明带中或直接移植给受带中或直接移植给受体。体。第33页，讲稿共52张，创作于星期三第34页，讲稿共52张，创作于星期三4.分割胚的培养；分割胚的培养；原因：早期胚胎切割后发育能力低，一般是经包埋后移植到中间受体的输卵管中培养几天至囊胚，再从输卵管中回收胚胎，最后移植给受体。方法：体外培养 体内培养（需琼脂包埋）第35页，讲稿共52张，创作于星期三琼脂包埋的作用固定胚胎便于回收第36页，讲稿共52张，创作于星期三分割胚的移植分割胚的移植要求：胚胎分割后可以直接移植给受体，也可以进行超低温冷冻保存。为提高冷冻胚胎移植后的受胎率，分割的胚胎需要在体内或体外培养到桑椹或囊胚阶段，再进行冷冻。第37页，
14、讲稿共52张，创作于星期三受精卵受精卵分裂分裂 早期胚胎胚胎分割基本过程胚胎分割基本过程代孕母牛植入植入分割第38页，讲稿共52张，创作于星期三胚胎分割的基本过程胚胎分割的基本过程胚胎移入培养液胚胎移入培养液分割胚胎（机械法、酶处理）分割胚胎（机械法、酶处理）移植胚胎给受体移植胚胎给受体着床产仔着床产仔第39页，讲稿共52张，创作于星期三三）胚胎分割技术的应用应用：在畜牧方面：扩大优良家畜的数量 在研究方面：培养遗传特性相同的实验动物 性别鉴定存在问题：如：早期胚胎细胞的分化和定位的发育机制 不同阶段胚胎细胞的分化时间和发育潜力第40页，讲稿共52张，创作于星期三第41页，讲稿共52张，创作于
15、星期三四、胚胎干细胞核移植技术四、胚胎干细胞核移植技术1.1.概念：概念：（胚胎干细胞）胚胎干细胞）：简称：简称ESES或或EKEK细胞，是由细胞，是由早期早期胚胎胚胎或或原始性腺原始性腺中分离出来的一类细胞。中分离出来的一类细胞。第42页，讲稿共52张，创作于星期三2.2.特点特点:1)1)形态：形态：体积小、细胞核大、核仁明显。体积小、细胞核大、核仁明显。2)2)功能：功能：具有发育的具有发育的全能性全能性；是一种高度；是一种高度未分化未分化的细胞，的细胞，可分化为成年动物体内任何一种组织和器官。可分化为成年动物体内任何一种组织和器官。3 3）应用：）应用：在在体外体外培养的条件下，可以培
16、养的条件下，可以增殖而不发生分化增殖而不发生分化；对它可以进行冷冻保存，也可以进行遗传改造。对它可以进行冷冻保存，也可以进行遗传改造。3.3.主要用途：主要用途：(1)(1)治疗人类的某些顽症治疗人类的某些顽症 (2)(2)培育出人造组织器官，用于器官移植培育出人造组织器官，用于器官移植 (3)(3)是研究体外细胞分化的理想材料是研究体外细胞分化的理想材料第43页，讲稿共52张，创作于星期三1.饲养层细胞培养体系的建立饲养层细胞培养体系的建立饲养层培养体系的构成 胚胎成纤维细胞 作用：抑制细胞分化成纤维细胞（fibroblast）：是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞(mese
17、nchymal cell)分化而来。细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，细胞核卵圆形，核仁大而明显。细胞功能活动旺盛，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动。成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分重要的作用。饲养层细胞（feeder layer）：在正常机体内，细胞除了获得一些血液来的营养外，还在细胞与细胞之间互换特殊的物质，用于分裂分化和营养等。因而，在细胞体外培养中，除了正常的培养基外，先培养一层特殊的细胞，然后再在其上接种要实验的细胞，这样更能模拟体内环境。这些特殊的细胞就是饲养层细胞，通常是成纤维类细胞，这些细胞可以提供实验细胞
18、更好的营养，有的分化研究则是必须有饲养层细胞。第44页，讲稿共52张，创作于星期三2.胚胎干细胞的获得胚胎干细胞的获得时期：囊胚或囊胚期以前 如小鼠：桑椹胚、囊胚 人体：囊胚、原始生殖细胞培养：置于含饲养层的培养液中培养 方法：原代培养和传代培养 传代培养的作用：抑制胚胎干细胞分化胚胎干细胞分化第45页，讲稿共52张，创作于星期三一）胚胎干细胞核移植程序胚胎干细胞核移植程序饲养层细胞培养体系的建立饲养层细胞培养体系的建立胚胎干细胞的获得胚胎干细胞的获得胚胎干细胞的核移植胚胎干细胞的核移植第46页，讲稿共52张，创作于星期三胚胚胎胎干干细细胞胞培培养养第47页，讲稿共52张，创作于星期三3.胚胎
19、干细胞的核移植胚胎干细胞的核移植指把胚胎干细胞核移植到去核的卵细胞中，指把胚胎干细胞核移植到去核的卵细胞中，经过胚激活、胚胎培养、胚胎移植后直接经过胚激活、胚胎培养、胚胎移植后直接由受体完成克隆动物的技术。由受体完成克隆动物的技术。第48页，讲稿共52张，创作于星期三胚胚胎胎干干细细胞胞核核移移植植：第49页，讲稿共52张，创作于星期三二）胚胎干细胞的应用二）胚胎干细胞的应用培养克隆动物的核供体获得基因敲除动物治疗性克隆第50页，讲稿共52张，创作于星期三1.1.下列有关动物胚胎移植的叙述中，错误的是下列有关动物胚胎移植的叙述中，错误的是A.A.受孕母畜体内的受精卵或胚胎均能移植受孕母畜体内的
20、受精卵或胚胎均能移植B.B.受体母畜必须处于与供体母畜同步发情的状态受体母畜必须处于与供体母畜同步发情的状态C.C.超数排卵技术要使用一定的激素超数排卵技术要使用一定的激素D.D.试管婴儿只是受精及早期卵裂过程在试管中进行试管婴儿只是受精及早期卵裂过程在试管中进行2.2.下列对于优良种畜的胚胎移植的说法不正确的是下列对于优良种畜的胚胎移植的说法不正确的是A.A.供体母牛必须是同一物种的良种供体母牛必须是同一物种的良种B.B.受体母牛必须是同一物种的良种受体母牛必须是同一物种的良种C.C.供体公牛必须是同一物种的良种供体公牛必须是同一物种的良种D.D.受体母牛可以是同一物种的一般健康牛受体母牛可以是同一物种的一般健康牛练习练习:第51页，讲稿共52张，创作于星期三感谢大家观看第52页，讲稿共52张，创作于星期三