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1、食品酶学课件本第四章固定化酶4/3/20234/3/20231 1第1页，本讲稿共32页一、固定化酶的概念一、固定化酶的概念n n固固固固定定定定化化化化酶酶酶酶是是是是指指指指固固固固定定定定在在在在载载载载体体体体上上上上并并并并在在在在一一一一定定定定空空空空间间间间范范范范围围围围内内内内进进进进行行行行催催催催化化化化反反反反应应应应的的的的酶。酶。酶。酶。示意图示意图示意图示意图n n酶酶酶酶的的的的固固固固定定定定化化化化是是是是指指指指通通通通过过过过某某某某种种种种方方方方式式式式将将将将酶酶酶酶和和和和水水水水不不不不溶溶溶溶性性性性载载载载体体体体相相相相结结结结合合合合
2、，使使使使酶酶酶酶被被被被集集集集中中中中和和和和限限限限制制制制，从从从从而而而而在在在在使使使使用用用用时时时时不不不不再再再再扩扩扩扩散散散散。固固固固定定定定化化化化酶酶酶酶具具具具有有有有稳稳稳稳定定定定性性性性增增增增加加加加、可可可可反反反反复使用并易于和产物分开等优点，克服了游离酶的不足之处。复使用并易于和产物分开等优点，克服了游离酶的不足之处。复使用并易于和产物分开等优点，克服了游离酶的不足之处。复使用并易于和产物分开等优点，克服了游离酶的不足之处。n n固固固固定定定定化化化化所所所所用用用用的的的的酶酶酶酶可可可可以以以以是是是是经经经经提提提提取取取取分分分分离离离离后
3、后后后得得得得到到到到的的的的一一一一定定定定纯纯纯纯度度度度的的的的酶酶酶酶，也也也也可可可可以以以以是是是是结结结结合合合合在在在在菌菌菌菌体体体体（死死死死细细细细胞胞胞胞）或或或或细细细细胞胞胞胞碎碎碎碎片片片片上上上上的的的的酶酶酶酶或或或或酶酶酶酶系系系系。相相相相应应应应地地地地，前前前前者者者者称称称称为为为为固固固固定定定定化化化化酶酶酶酶，后后后后者者者者称称称称为为为为固固固固定定定定化化化化菌菌菌菌体体体体或或或或固固固固定定定定化化化化死死死死细细细细胞胞胞胞。可可可可见见见见，固固固固定定定定化化化化菌菌菌菌体体体体是是是是固固固固定定定定化化化化酶酶酶酶的的的的一
4、一一一种种种种形形形形式式式式，它它它它不不不不像像像像固固固固定定定定化化化化活活活活细细细细胞胞胞胞（或或或或称称称称固固固固定定定定化化化化增增增增殖殖殖殖细细细细胞胞胞胞）那那那那样样样样，固固固固定定定定化化化化菌菌菌菌体体体体的的的的细细细细胞胞胞胞为为为为死死死死细细细细胞胞胞胞，死细胞可以部分地起到载体的作用。死细胞可以部分地起到载体的作用。死细胞可以部分地起到载体的作用。死细胞可以部分地起到载体的作用。4/3/20234/3/20232 2第2页，本讲稿共32页固定化酶示意图固定化酶示意图水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定
5、化技术固定化技术4/3/20234/3/20233 3第3页，本讲稿共32页二、固定化技术的兴起与发展二、固定化技术的兴起与发展n n（一）生物催化剂（一）生物催化剂酶的显著优点酶的显著优点n n（二）游离酶的不足之处（二）游离酶的不足之处n n（三）固定化酶的发展简史（三）固定化酶的发展简史4/3/20234/3/20234 4第4页，本讲稿共32页（一）生物催化剂（一）生物催化剂酶的显著优点酶的显著优点n n酶酶是是生生物物催催化化剂剂，它它具具有有特特特特异异异异、高高高高效效效效、反反反反应应应应条条条条件件件件温温温温和和和和、副副副副反反反反应应应应少少少少等等等等显显显显著著著著
6、优优优优点点点点，因因因因而而而而随随随随着着着着酶酶酶酶学学学学研研研研究究究究的的的的不不不不断断断断深深深深入入入入和和和和酶酶酶酶工工工工程程程程的的的的发发发发展展展展，工工工工业业业业化化化化生生生生产产产产的的的的酶酶酶酶越越越越来来来来越越越越多多多多，酶酶酶酶的的的的应应应应用用用用也也也也越越越越来来来来越越越越广广广广泛泛泛泛。现现现现在在在在酶酶酶酶在在在在食食食食品品品品、化化化化工工工工、医医医医药药药药、农农农农业业业业、环环环环保保保保、能能能能源源源源和和和和科科科科研研研研等等等等各各各各个个个个领领领领域域域域已已已已取取取取得得得得了了了了显显显显著著著
7、著的的的的成成成成效效效效。酶酶酶酶作作作作为为为为生生生生物催化剂的许多优点是任何无机催化剂无法比拟的。物催化剂的许多优点是任何无机催化剂无法比拟的。物催化剂的许多优点是任何无机催化剂无法比拟的。物催化剂的许多优点是任何无机催化剂无法比拟的。4/3/20234/3/20235 5第5页，本讲稿共32页（二）游离酶的不足之处（二）游离酶的不足之处n n（1 1 1 1）酶酶酶酶的的的的稳稳稳稳定定定定性性性性差差差差，这这这这是是是是酶酶酶酶的的的的最最最最大大大大的的的的弱弱弱弱点点点点。酶酶酶酶的的的的化化化化学学学学本本本本质质质质是是是是蛋蛋蛋蛋白质，对酸、碱、热、有机溶剂等条件易变性
8、失活。白质，对酸、碱、热、有机溶剂等条件易变性失活。白质，对酸、碱、热、有机溶剂等条件易变性失活。白质，对酸、碱、热、有机溶剂等条件易变性失活。n n（2 2 2 2）难难难难于于于于连连连连续续续续化化化化生生生生产产产产。酶酶酶酶一一一一般般般般都都都都是是是是在在在在水水水水溶溶溶溶液液液液中中中中催催催催化化化化反反反反应应应应，与与与与底底底底物物物物和和和和产产产产物物物物混混混混合合合合在在在在反反反反应应应应系系系系统统统统中中中中，反反反反应应应应后后后后酶酶酶酶仍仍仍仍有有有有较较较较高高高高的的的的活活活活力力力力却却却却不不不不易易易易回回回回收收收收利利利利用。这种一
9、次性使用酶的方式，导致成本较高和难以连续化生产。用。这种一次性使用酶的方式，导致成本较高和难以连续化生产。用。这种一次性使用酶的方式，导致成本较高和难以连续化生产。用。这种一次性使用酶的方式，导致成本较高和难以连续化生产。n n（3 3 3 3）终终终终产产产产品品品品的的的的分分分分离离离离提提提提纯纯纯纯困困困困难难难难。由由由由于于于于酶酶酶酶反反反反应应应应后后后后成成成成为为为为杂杂杂杂质质质质与与与与产产产产物物物物混混混混在在在在一一一一起起起起，无无无无疑疑疑疑给给给给进进进进一一一一步步步步的的的的分分分分离离离离纯纯纯纯化化化化带带带带来来来来一一一一定定定定的的的的困困困
10、困难难难难。针针针针对对对对酶酶酶酶的的的的以上不足，改善的方法之一就是固定化技术的应用。以上不足，改善的方法之一就是固定化技术的应用。以上不足，改善的方法之一就是固定化技术的应用。以上不足，改善的方法之一就是固定化技术的应用。4/3/20234/3/20236 6第6页，本讲稿共32页（三）固定化酶的发展简史（三）固定化酶的发展简史n n1916191619161916年年年年NelsonNelsonNelsonNelson和和和和GriffinGriffinGriffinGriffin就曾经将转化酶吸附在炭和氧化铝上，并且就曾经将转化酶吸附在炭和氧化铝上，并且就曾经将转化酶吸附在炭和氧化铝
11、上，并且就曾经将转化酶吸附在炭和氧化铝上，并且证明这种吸附的酶（即固定化酶）具有活性。证明这种吸附的酶（即固定化酶）具有活性。证明这种吸附的酶（即固定化酶）具有活性。证明这种吸附的酶（即固定化酶）具有活性。n n1953195319531953年年年年，GrubhoferGrubhoferGrubhoferGrubhofer和和和和SchleithSchleithSchleithSchleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体，经采用聚氨基苯乙烯树脂为载体，经采用聚氨基苯乙烯树脂为载体，经采用聚氨基苯乙烯树脂为载体，经重氮化法活化后，分别与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶重氮化法活化后，分别与羧
12、肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶重氮化法活化后，分别与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶重氮化法活化后，分别与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成了固定化酶。等结合，制成了固定化酶。等结合，制成了固定化酶。等结合，制成了固定化酶。n n1969196919691969年年年年，日本的千畑一郎首次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶，日本的千畑一郎首次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶，日本的千畑一郎首次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶，日本的千畑一郎首次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶从从从从DLDLDLDL氨基酸连续生产氨基酸连续生产氨基酸连续生产氨基酸连续生产LLLL氨基
13、酸，生产成本仅为游离酶生产成氨基酸，生产成本仅为游离酶生产成氨基酸，生产成本仅为游离酶生产成氨基酸，生产成本仅为游离酶生产成本的本的本的本的60%60%60%60%左右，他开创了左右，他开创了左右，他开创了左右，他开创了固定化酶应用于连续化工业生产的先例固定化酶应用于连续化工业生产的先例固定化酶应用于连续化工业生产的先例固定化酶应用于连续化工业生产的先例，是，是，是，是酶应用史上的伟大变革。酶应用史上的伟大变革。酶应用史上的伟大变革。酶应用史上的伟大变革。n n1971197119711971年年年年，召开第一次国际酶工程学术会议，确定了固定化酶的统一英召开第一次国际酶工程学术会议，确定了固定
14、化酶的统一英召开第一次国际酶工程学术会议，确定了固定化酶的统一英召开第一次国际酶工程学术会议，确定了固定化酶的统一英文名为文名为文名为文名为Immobilized EnzymeImmobilized EnzymeImmobilized EnzymeImmobilized Enzyme。n n1973197319731973年年年年，千畑一郎等人又采用，千畑一郎等人又采用，千畑一郎等人又采用，千畑一郎等人又采用固定化微生物细胞固定化微生物细胞固定化微生物细胞固定化微生物细胞连续化生产连续化生产连续化生产连续化生产LLLL天天天天冬氨酸，后来又发展到冬氨酸，后来又发展到冬氨酸，后来又发展到冬氨酸，
15、后来又发展到固定化增殖细胞固定化增殖细胞固定化增殖细胞固定化增殖细胞即固定化活细胞。即固定化活细胞。即固定化活细胞。即固定化活细胞。4/3/20234/3/20237 7第7页，本讲稿共32页三、酶和菌体的固定化方法三、酶和菌体的固定化方法n n（一）吸附法（一）吸附法 n n（二）包埋法（二）包埋法 n n（三）结合法（三）结合法 n n（四）交联法（四）交联法 n n（五）热处理法（五）热处理法 n n各固定方法的特点与比较各固定方法的特点与比较n n酶固定化方法示意图酶固定化方法示意图酶固定化方法示意图酶固定化方法示意图4/3/20234/3/20238 8第8页，本讲稿共32页酶固定化
16、方法示意图酶固定化方法示意图酶固定化方法示意图酶固定化方法示意图4/3/20234/3/20239 9第9页，本讲稿共32页（一）吸附法（一）吸附法n n概念概念：吸附法吸附法是指利用各种是指利用各种固体吸附剂固体吸附剂固体吸附剂固体吸附剂将酶或含酶菌体将酶或含酶菌体将酶或含酶菌体将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定化的方法。吸附在其表面上而使酶固定化的方法。吸附在其表面上而使酶固定化的方法。吸附在其表面上而使酶固定化的方法。n n吸附剂吸附剂吸附剂吸附剂：常用有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、：常用有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、：常用有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、：常用有活性
17、炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。n n特点特点特点特点：最大的优点是廉价简便、条件温和酶活损失少；：最大的优点是廉价简便、条件温和酶活损失少；：最大的优点是廉价简便、条件温和酶活损失少；：最大的优点是廉价简便、条件温和酶活损失少；最大的缺点是酶易从载体上解吸附。最大的缺点是酶易从载体上解吸附。最大的缺点是酶易从载体上解吸附。最大的缺点是酶易从载体上解吸附。4/3/20234/3/20231010第10页，本讲稿共32页（二）包埋法（二）包埋法n n概概概概念念念念：包包包包埋埋
18、埋埋法法法法是是是是指指指指将将将将酶酶酶酶或或或或含含含含酶酶酶酶菌菌菌菌体体体体包包包包埋埋埋埋在在在在各各各各种种种种多多多多孔孔孔孔载载载载体体体体中中中中而使酶固定化的方法。而使酶固定化的方法。而使酶固定化的方法。而使酶固定化的方法。n n分类分类分类分类：据包埋剂和包埋方法不同，又可分为：据包埋剂和包埋方法不同，又可分为：n n凝胶包埋法凝胶包埋法凝胶包埋法凝胶包埋法n n半透膜包埋法半透膜包埋法半透膜包埋法半透膜包埋法n n特特特特点点点点：优优优优点点点点是是是是条条条条件件件件温温温温和和和和，缺缺缺缺点点点点是是是是只只只只适适适适于于于于底底底底物物物物和和和和产产产产物
19、物物物都都都都是是是是小小小小分分分分子的子的子的子的酶酶酶酶的固定化。的固定化。的固定化。的固定化。4/3/20234/3/20231111第11页，本讲稿共32页凝胶包埋法凝胶包埋法n n概念概念：凝胶包埋法凝胶包埋法凝胶包埋法凝胶包埋法是指将酶或含酶菌体包埋在凝胶内部是指将酶或含酶菌体包埋在凝胶内部的微孔中而使酶固定化的方法。由于该方法是将酶截的微孔中而使酶固定化的方法。由于该方法是将酶截留在凝胶颗粒内部的网格内，所以也称为留在凝胶颗粒内部的网格内，所以也称为截留法截留法。n n凝胶种类凝胶种类凝胶种类凝胶种类：所用的凝胶可分为：所用的凝胶可分为：所用的凝胶可分为：所用的凝胶可分为天然凝
20、胶天然凝胶天然凝胶天然凝胶和和和和合成凝胶合成凝胶合成凝胶合成凝胶两类。两类。两类。两类。前者常有的有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、卡拉胶、明胶前者常有的有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、卡拉胶、明胶前者常有的有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、卡拉胶、明胶前者常有的有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、卡拉胶、明胶等；后者包括聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等。等；后者包括聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等。等；后者包括聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等。等；后者包括聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等。4/3/20234/3/20231212第12页，本讲稿共32页半透膜包埋法半透膜包埋法n n半透膜包埋法半透膜包埋法是指将酶包埋在由各种高分子是指将
21、酶包埋在由各种高分子聚合形成的小球内的方法。由于半透膜包埋聚合形成的小球内的方法。由于半透膜包埋法所形成的固定化酶小球的直径一般只有法所形成的固定化酶小球的直径一般只有几几微米到几百微米微米到几百微米，称为，称为微胶囊微胶囊，所以，半透，所以，半透膜包埋法也称为膜包埋法也称为微胶囊包埋法微胶囊包埋法。4/3/20234/3/20231313第13页，本讲稿共32页（三）结合法（三）结合法n n概概念念：结结合合法法是是指指通通过过离离子子键键或或共共价价键键将将酶酶与载体结合在一起而使酶固定化的方法。与载体结合在一起而使酶固定化的方法。n n分类分类：离子离子键结键结合法合法 n n 共价共价
22、键结键结合法合法 4/3/20234/3/20231414第14页，本讲稿共32页离子离子键结键结合法合法n n载载 体体：常常 用用 的的 载载 体体 有有 DEAEDEAE纤纤 维维 素素、TEAETEAE纤纤维维素素、DEAEDEAE葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶等等离离子子交交换剂。换剂。n n特特点点：与与吸吸附附法法相相似似，具具有有酶酶活活损损失失少少、结结合合力力弱弱等等特特点点，在在pHpH值值和和离离子子强强度度等等条条件件改改变变时时，酶酶易易解解吸吸，所所以以使使用用时时需需要要严严格格控控制制pHpH值和离子强度等条件。值和离子强度等条件。4/3/20234/3/2023151
23、5第15页，本讲稿共32页共价共价键结键结合法合法n n载载载载体体体体：常常常常用用用用的的的的载载载载体体体体有有有有纤纤纤纤维维维维素素素素、琼琼琼琼脂脂脂脂糖糖糖糖凝凝凝凝胶胶胶胶、葡葡葡葡聚聚聚聚糖糖糖糖凝凝凝凝胶胶胶胶、甲甲甲甲壳壳壳壳质、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物等。质、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物等。质、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物等。质、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物等。n n主主主主要要要要步步步步骤骤骤骤：首首首首先先先先在在在在载载载载体体体体上上上上引引引引入入入入一一一一活活活活泼泼泼泼基基基基团团团团使使使使载载载载体体体体活活活活化化化化，然然然然后后后
24、后使使使使该该该该活活活活泼泼泼泼基基基基团团团团与与与与酶酶酶酶分分分分子子子子中中中中的的的的某某某某一一一一基基基基团团团团反反反反应应应应，形形形形成成成成共共共共价价价价键键键键。酶酶酶酶分分分分子子子子中中中中可可可可以以以以形形形形成成成成共共共共价价价价键键键键的基团有氨基、羧基、巯基、羟基、酚基和咪唑基等。的基团有氨基、羧基、巯基、羟基、酚基和咪唑基等。的基团有氨基、羧基、巯基、羟基、酚基和咪唑基等。的基团有氨基、羧基、巯基、羟基、酚基和咪唑基等。n n特特特特点点点点：最最最最大大大大优优优优点点点点是是是是酶酶酶酶结结结结合合合合牢牢牢牢固固固固，但但但但成成成成本本本本
25、较较较较高高高高，而而而而且且且且需需需需要要要要注注注注意意意意避避避避免免免免酶酶酶酶活活活活性性性性中中中中心心心心上上上上的的的的基基基基团团团团被被被被偶偶偶偶联联联联而而而而引引引引起起起起酶酶酶酶的的的的失失失失活活活活，或或或或酶酶酶酶在在在在与与与与载载载载体体体体偶偶偶偶联联联联后后后后可可可可能能能能发发发发生生生生活活活活性性性性中中中中心心心心构构构构象象象象的的的的变变变变化化化化而而而而影影影影响响响响催催催催化化化化能能能能力力力力（酶酶活活回回收收率一般为率一般为30%30%左右）左右）。4/3/20234/3/20231616第16页，本讲稿共32页（四）交
26、联法（四）交联法n n概概概概念念念念：采采采采用用用用双双双双官官官官能能能能试试试试剂剂剂剂将将将将酶酶酶酶分分分分子子子子连连连连接接接接起起起起来来来来，从从从从而而而而使使使使酶酶酶酶固固固固定定定定化化化化的的的的方方方方法法法法，称为称为称为称为交联法交联法交联法交联法。n n双双双双官官官官能能能能试试试试剂剂剂剂：常常常常用用用用的的的的有有有有戊戊戊戊二二二二醛醛醛醛、己己己己二二二二胺胺胺胺、顺顺顺顺丁丁丁丁烯烯烯烯二二二二酸酸酸酸酐酐酐酐和和和和双双双双偶偶偶偶氮氮氮氮苯苯苯苯等等等等。双双双双官官官官能能能能试试试试剂剂剂剂分分分分子子子子中中中中含含含含有有有有两两
27、两两个个个个官官官官能能能能团团团团，这这这这两两两两个个个个官官官官能能能能团团团团可可可可与与与与酶酶酶酶或或或或蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的某某某某些些些些基基基基团团团团反反反反应应应应，从从从从而而而而使使使使酶酶酶酶分分分分子子子子之之之之间间间间或或或或蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质分分分分子子子子之之之之间间间间发发发发生交联。生交联。生交联。生交联。n n应用范围应用范围应用范围应用范围：不仅适用固定化酶，也可用于固定化菌体。：不仅适用固定化酶，也可用于固定化菌体。：不仅适用固定化酶，也可用于固定化菌体。：不仅适用固定化酶，也可用于固定化菌体。n n特特特特点点点点：用用用用交
28、交交交联联联联法法法法制制制制备备备备的的的的固固固固定定定定化化化化酶酶酶酶或或或或固固固固定定定定化化化化菌菌菌菌体体体体，其其其其最最最最突突突突出出出出的的的的特特特特点点点点是是是是结结结结合合合合牢牢牢牢固固固固而而而而酶酶酶酶活活活活损损损损失失失失大大大大。但但但但是是是是尽尽尽尽可可可可能能能能地地地地降降降降低低低低交交交交联联联联剂剂剂剂浓浓浓浓度度度度和和和和缩短反应时间将有利于固定化酶活力的提高。缩短反应时间将有利于固定化酶活力的提高。缩短反应时间将有利于固定化酶活力的提高。缩短反应时间将有利于固定化酶活力的提高。n n双双双双重重重重固固固固定定定定法法法法：为为为
29、为了了了了各各各各方方方方法法法法之之之之间间间间可可可可以以以以取取取取长长长长补补补补短短短短，常常常常采采采采用用用用双双双双重重重重固固固固定定定定法法法法，例例例例如如如如可可可可将将将将交交交交联联联联法法法法与与与与一一一一些些些些物物物物理理理理性性性性的的的的方方方方法法法法（如如如如吸吸吸吸附附附附法法法法、包包包包埋埋埋埋法法法法）联联联联合合合合使使使使用用用用，从从从从而而而而制制制制备备备备出出出出酶酶酶酶活活活活损损损损失失失失少少少少、结结结结合合合合牢牢牢牢固固固固的的的的固固固固定定定定化化化化酶酶酶酶或或或或固固固固定定定定化菌体。化菌体。化菌体。化菌体。
30、4/3/20234/3/20231717第17页，本讲稿共32页（五）热处理法（五）热处理法n n概概概概念念念念：此此此此法法法法是是是是用用用用于于于于菌菌菌菌体体体体固固固固定定定定化化化化的的的的一一一一种种种种方方方方法法法法。它它它它是是是是将将将将含含含含酶酶酶酶的的的的细细细细胞胞胞胞直直直直接接接接进进进进行行行行热热热热处处处处理理理理将将将将酶酶酶酶固固固固定定定定在在在在菌菌菌菌体体体体内内内内从从从从而而而而获获获获得得得得固固固固定定定定化菌体的方法。化菌体的方法。化菌体的方法。化菌体的方法。n n特特特特点点点点：菌菌菌菌体体体体本本本本身身身身既既既既是是是是酶
31、酶酶酶供供供供体体体体同同同同时时时时也也也也是是是是载载载载体体体体，所所所所以以以以方方方方法法法法简简简简便便便便。但但但但需需需需注注注注意意意意的的的的是是是是，热热热热处处处处理理理理会会会会引引引引起起起起酶酶酶酶的的的的热热热热变变变变性性性性失失失失活活活活，因因因因此此此此，该该该该法法法法只只只只适适适适用用用用于于于于目目目目标标标标酶酶酶酶热热热热稳稳稳稳定定定定性性性性较较较较好好好好时时时时，而而而而且且且且进进进进行行行行热热热热处处处处理理理理时时时时还还还还需需需需严严严严格格格格控控控控制制制制好好好好热热热热处处处处理理理理强强强强度度度度，即即即即严严
32、严严格格格格把把把把握握握握加加加加热热热热温温温温度度度度和和和和时时时时间间间间。热热热热处理法也可与其它固定化方法配合使用，进行双重固定化。处理法也可与其它固定化方法配合使用，进行双重固定化。处理法也可与其它固定化方法配合使用，进行双重固定化。处理法也可与其它固定化方法配合使用，进行双重固定化。4/3/20234/3/20231818第18页，本讲稿共32页以以以以上上上上四四四四种种种种固固固固定定定定化化化化酶酶酶酶方方方方法法法法各各各各有有有有其其其其优优优优缺缺缺缺点点点点（见见见见表表表表4-14-1）。往往往往往往往往一一一一种种种种酶酶酶酶可可可可以以以以用用用用不不不不
33、同同同同方方方方法法法法固固固固定定定定化化化化，但但但但没没没没有有有有一一一一种种种种固固固固定定定定化化化化方方方方法法法法可可可可以以以以普普普普遍遍遍遍地地地地适适适适用用用用于于于于每每每每一一一一种种种种酶酶酶酶。在在在在实实实实际际际际应应应应用用用用时时时时，常常常常将将将将两两两两种种种种或或或或数数数数种种种种固固固固定定定定化化化化方方方方法法法法并并并并用用用用，以取长补短。以取长补短。以取长补短。以取长补短。各固定方法的特点与比较各固定方法的特点与比较4/3/20234/3/20231919第19页，本讲稿共32页四、四、固定化酶的特性固定化酶的特性（一）固定化酶的
34、形状（一）固定化酶的形状（二）固定化酶的性质（二）固定化酶的性质（三）酶活力（三）酶活力（四）固定化酶的稳定性（四）固定化酶的稳定性（五）固定化酶的反应特性（五）固定化酶的反应特性4/3/20234/3/20232020第20页，本讲稿共32页（一）固定化酶的形状（一）固定化酶的形状n n固固定定化化酶酶的的形形式式多多样样，依依不不同同用用途途有有颗颗粒粒、线线条条、薄薄膜膜和酶管等形状。其中和酶管等形状。其中颗粒占绝大多数颗粒占绝大多数。n n颗颗粒粒和和线线条条主主要要用用于于工工业业发发酵酵生生产产，如如装装成成酶酶柱柱用用于于连连续生产，或在反应器中进行批式搅拌反应；续生产，或在反应
35、器中进行批式搅拌反应；n n薄膜薄膜主要用于酶电极，应用于分析化学；n n酶管机械强度较大，亦宜用于工业生产。机械强度较大，亦宜用于工业生产。4/3/20234/3/20232121第21页，本讲稿共32页（二）固定化酶的性质（二）固定化酶的性质n n酶酶在在水水溶溶液液中中以以自自由由的的游游离离状状态态存存在在，但但是是固固定定后后酶酶分分子子便便从从游游离离的的状状态态变变为为牢牢固固地地结结合合于于载载体体的的状状态态，其其结结果果往往往往引引起起酶酶的的性性质质的的改改变变。为为此此，在在固固定定化化酶酶的的应应用用过过程程中中，必必须须了了解解固固定定化化酶酶的的性性质质与与游游离
36、离酶酶之之间间的差别，并对操作条件加以适当调整。的差别，并对操作条件加以适当调整。n n由于固定化的方法不同，固定化酶的活力和性质也有所不同。4/3/20234/3/20232222第22页，本讲稿共32页（三）酶活力（三）酶活力n n固定化酶的活力在多数情况下比天然酶的活力低固定化酶的活力在多数情况下比天然酶的活力低固定化酶的活力在多数情况下比天然酶的活力低固定化酶的活力在多数情况下比天然酶的活力低，其原因可能是：，其原因可能是：，其原因可能是：，其原因可能是：酶活性中心的重要氨基酸残基与水不溶性载体相结合；酶活性中心的重要氨基酸残基与水不溶性载体相结合；酶活性中心的重要氨基酸残基与水不溶性
37、载体相结合；酶活性中心的重要氨基酸残基与水不溶性载体相结合；酶酶酶酶与与与与载载载载体体体体结结结结合合合合时时时时，其其其其高高高高级级级级结结结结构构构构发发发发生生生生了了了了变变变变化化化化，其其其其构构构构象象象象的的的的改改改改变变变变导导导导致致致致了了了了酶酶酶酶与底物结合能力或催化底物转化能力的改变；与底物结合能力或催化底物转化能力的改变；与底物结合能力或催化底物转化能力的改变；与底物结合能力或催化底物转化能力的改变；酶酶酶酶被被被被固固固固定定定定化化化化后后后后，虽虽虽虽不不不不失失失失活活活活，但但但但酶酶酶酶与与与与底底底底物物物物间间间间的的的的相相相相互互互互作作
38、作作用用用用受受受受到到到到空空空空间间间间位阻的影响。位阻的影响。位阻的影响。位阻的影响。n n也也也也有有有有在在在在个个个个别别别别情情情情况况况况下下下下，酶酶酶酶经经经经固固固固定定定定化化化化后后后后其其其其活活活活力力力力升升升升高高高高，可可可可能能能能是是是是由由由由于于于于固固固固定定定定化化化化后后后后酶酶酶酶的抗抑能力提高使得它反而比游离酶活力高。的抗抑能力提高使得它反而比游离酶活力高。的抗抑能力提高使得它反而比游离酶活力高。的抗抑能力提高使得它反而比游离酶活力高。4/3/20234/3/20232323第23页，本讲稿共32页（四）固定化酶的稳定性（四）固定化酶的稳定
39、性 n n游离酶的一个突出缺点是稳定性差，而游离酶的一个突出缺点是稳定性差，而游离酶的一个突出缺点是稳定性差，而游离酶的一个突出缺点是稳定性差，而固定化酶的稳定性一般都固定化酶的稳定性一般都比游离酶提高很多比游离酶提高很多，这对酶的应用是非常有利的。其稳定性增强主要表，这对酶的应用是非常有利的。其稳定性增强主要表，这对酶的应用是非常有利的。其稳定性增强主要表，这对酶的应用是非常有利的。其稳定性增强主要表现在如下几个方面：现在如下几个方面：现在如下几个方面：现在如下几个方面：（1 1 1 1）操作稳定性）操作稳定性）操作稳定性）操作稳定性（2 2 2 2）贮藏稳定性）贮藏稳定性）贮藏稳定性）贮藏
40、稳定性（3 3 3 3）热稳定性）热稳定性）热稳定性）热稳定性（4 4 4 4）对蛋白酶的稳定性）对蛋白酶的稳定性）对蛋白酶的稳定性）对蛋白酶的稳定性（5 5 5 5）酸碱稳定性）酸碱稳定性）酸碱稳定性）酸碱稳定性酶酶酶酶的的的的固固固固定定定定化化化化方方方方法法法法不不不不同同同同，所所所所得得得得的的的的固固固固定定定定化化化化酶酶酶酶的的的的操操操操作作作作稳稳稳稳定定定定性性性性亦亦亦亦有有有有差差差差异异异异。固固固固定定定定化化化化酶酶酶酶在在在在操操操操作作作作中中中中可可可可以以以以长长长长时时时时间间间间保保保保留留留留活活活活力力力力，一一一一般般般般情情情情况况况况下下
41、下下，半半半半衰衰衰衰期期期期在在在在一一一一个月以上，即有工业应用价值个月以上，即有工业应用价值个月以上，即有工业应用价值个月以上，即有工业应用价值。固固固固定定定定化化化化可可可可延延延延长长长长酶酶酶酶的的的的贮贮贮贮藏藏藏藏有有有有效效效效期期期期。但但但但长长长长期期期期贮贮贮贮藏藏藏藏，活活活活力力力力也也也也不不不不免免免免下下下下降降降降，最最最最好好好好能能能能立立立立即即即即使使使使用用用用。如如如如果果果果贮贮贮贮藏藏藏藏条条条条件件件件比比比比较较较较好好好好，亦亦亦亦可可可可较较较较长长长长时时时时 间间间间 保保保保 持持持持 活活活活 力力力力。例例例例 如如如如
42、，固固固固 定定定定 化化化化 胰胰胰胰 蛋蛋蛋蛋 白白白白 酶酶酶酶，在在在在0.0025mol/L0.0025mol/L磷磷磷磷酸酸酸酸缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液中中中中，于于于于2020保保保保存存存存数数数数月月月月，活力尚不损失。活力尚不损失。活力尚不损失。活力尚不损失。热稳定性对工业应用非常重要。大多数酶在固定化热稳定性对工业应用非常重要。大多数酶在固定化热稳定性对工业应用非常重要。大多数酶在固定化热稳定性对工业应用非常重要。大多数酶在固定化之后，其热稳定性都有所提高，但也有一些酶的耐之后，其热稳定性都有所提高，但也有一些酶的耐之后，其热稳定性都有所提高，但也有一些酶的耐之后，其热稳
43、定性都有所提高，但也有一些酶的耐热性反而下降。一般采用吸附法来进行酶的固定化热性反而下降。一般采用吸附法来进行酶的固定化热性反而下降。一般采用吸附法来进行酶的固定化热性反而下降。一般采用吸附法来进行酶的固定化时，有时会导致酶热稳定性的降低。时，有时会导致酶热稳定性的降低。时，有时会导致酶热稳定性的降低。时，有时会导致酶热稳定性的降低。酶经固定化后，其对蛋白酶的抵抗力提高。这可能是因为蛋白酶是大分子，由于受酶经固定化后，其对蛋白酶的抵抗力提高。这可能是因为蛋白酶是大分子，由于受酶经固定化后，其对蛋白酶的抵抗力提高。这可能是因为蛋白酶是大分子，由于受酶经固定化后，其对蛋白酶的抵抗力提高。这可能是因
44、为蛋白酶是大分子，由于受到到到到空间位阻空间位阻空间位阻空间位阻的影响，不能有效接触固定化酶。例如，千畑一郎发现，用尼龙或聚脲膜包埋，的影响，不能有效接触固定化酶。例如，千畑一郎发现，用尼龙或聚脲膜包埋，的影响，不能有效接触固定化酶。例如，千畑一郎发现，用尼龙或聚脲膜包埋，的影响，不能有效接触固定化酶。例如，千畑一郎发现，用尼龙或聚脲膜包埋，或用聚丙烯酰胺凝胶包埋的固定化天门冬酰胺酶，对蛋白酶极为稳定，而在同一条件下，游离或用聚丙烯酰胺凝胶包埋的固定化天门冬酰胺酶，对蛋白酶极为稳定，而在同一条件下，游离或用聚丙烯酰胺凝胶包埋的固定化天门冬酰胺酶，对蛋白酶极为稳定，而在同一条件下，游离或用聚丙烯
45、酰胺凝胶包埋的固定化天门冬酰胺酶，对蛋白酶极为稳定，而在同一条件下，游离酶几乎全部失活。另外固定化后酶对有机试剂和酶抑制剂的耐受性也得到了提高。酶几乎全部失活。另外固定化后酶对有机试剂和酶抑制剂的耐受性也得到了提高。酶几乎全部失活。另外固定化后酶对有机试剂和酶抑制剂的耐受性也得到了提高。酶几乎全部失活。另外固定化后酶对有机试剂和酶抑制剂的耐受性也得到了提高。多数固定化酶的酸碱稳定性高于游离酶，稳定多数固定化酶的酸碱稳定性高于游离酶，稳定多数固定化酶的酸碱稳定性高于游离酶，稳定多数固定化酶的酸碱稳定性高于游离酶，稳定pHpH范围变宽。范围变宽。范围变宽。范围变宽。极少数酶固定化后稳定性下降，可能
46、是由于固定化过程使酶活性极少数酶固定化后稳定性下降，可能是由于固定化过程使酶活性极少数酶固定化后稳定性下降，可能是由于固定化过程使酶活性极少数酶固定化后稳定性下降，可能是由于固定化过程使酶活性构象的敏感区受到牵连而导致的。构象的敏感区受到牵连而导致的。构象的敏感区受到牵连而导致的。构象的敏感区受到牵连而导致的。4/3/20234/3/20232424第24页，本讲稿共32页（五）固定化酶的反应特性（五）固定化酶的反应特性n n固定化酶的反应特性，均与游离酶有所不同。固定化酶的反应特性，均与游离酶有所不同。1 1、底物特异性、底物特异性 固定化酶的底物特异性与底物分子量的大小有固定化酶的底物特异
47、性与底物分子量的大小有一定关系。一定关系。（1 1）酶的底物为小分子化合物）酶的底物为小分子化合物 （2 2）酶的底物为大分子化合物）酶的底物为大分子化合物 2 2、反应的最适、反应的最适pHpH 3 3、反应的最适温度、反应的最适温度 4 4、米氏常数、米氏常数 5 5、最大反应速度、最大反应速度4/3/20234/3/20232525第25页，本讲稿共32页（1）酶的底物为小分子化合物一一般般来来说说，当当酶酶的的底底物物为为小小分分子子化化合合物物时时，固固定定化化酶酶的的底底物物特特异异性性大大多多数数情情况况下下不不发发生生变变化化。例例如如，氨氨基基酰酰化化酶酶、葡葡萄萄糖糖氧氧化
48、化酶酶、葡葡萄萄糖糖异异构构酶酶等等，固固定定化化前前后后的的底底物物特特异异性性没有变化。没有变化。4/3/20234/3/20232626第26页，本讲稿共32页（2）酶的底物为大分子化合物）酶的底物为大分子化合物n n当酶的底物为大分子化合物时，如蛋白酶、当酶的底物为大分子化合物时，如蛋白酶、当酶的底物为大分子化合物时，如蛋白酶、当酶的底物为大分子化合物时，如蛋白酶、-淀粉酶、磷酸二酯酶淀粉酶、磷酸二酯酶淀粉酶、磷酸二酯酶淀粉酶、磷酸二酯酶等，固定化酶的底物特异性往往会发生变化。等，固定化酶的底物特异性往往会发生变化。等，固定化酶的底物特异性往往会发生变化。等，固定化酶的底物特异性往往会
49、发生变化。这是由于载体引起的这是由于载体引起的这是由于载体引起的这是由于载体引起的空空空空间位阻间位阻间位阻间位阻作用，使大分子底物难以与酶分子接近而无法进行催化反应，作用，使大分子底物难以与酶分子接近而无法进行催化反应，作用，使大分子底物难以与酶分子接近而无法进行催化反应，作用，使大分子底物难以与酶分子接近而无法进行催化反应，酶的催化活力难以发挥出来，催化活性大大下降；酶的催化活力难以发挥出来，催化活性大大下降；酶的催化活力难以发挥出来，催化活性大大下降；酶的催化活力难以发挥出来，催化活性大大下降；而分子量较小的而分子量较小的而分子量较小的而分子量较小的底物受到空间位阻作用的影响较小，与游离
50、酶没有显著区别。底物受到空间位阻作用的影响较小，与游离酶没有显著区别。底物受到空间位阻作用的影响较小，与游离酶没有显著区别。底物受到空间位阻作用的影响较小，与游离酶没有显著区别。n n酶底物为大分子化合物时，底物分子量不同，对固定化酶底物特异酶底物为大分子化合物时，底物分子量不同，对固定化酶底物特异酶底物为大分子化合物时，底物分子量不同，对固定化酶底物特异酶底物为大分子化合物时，底物分子量不同，对固定化酶底物特异性的影响也不同，一般随着底物分子量的增大，固定化酶的活力性的影响也不同，一般随着底物分子量的增大，固定化酶的活力性的影响也不同，一般随着底物分子量的增大，固定化酶的活力性的影响也不同，