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1、异硫氰酸胍 强用力的蛋白质变性剂,能迅速溶解蛋白质,导致细胞结构破碎,核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离;胍盐是破坏蛋白质三维结构的离液剂,在通常使用的蛋白质变性剂中作用最强的是异硫氰酸胍,它们可以使多数蛋白质转换成一随机的卷曲状态;含有强力的阴离子和阳离子基团,它们可以形成较强的氢键;在还原剂存在的情况下,异硫氰酸胍可以断裂氢键,而去垢剂,如 SDS 存在的情况下,可以破坏疏水作用;盐酸胍、尿素 盐酸胍是一个核酸酶的强抑制剂,它并不是一种足够强的变性剂,可以允许完整的 RNA从富含 RNase 的组织中提取出来;4-8M 可断裂氢键,有两种可能机制：1 变性蛋白和盐酸胍、尿素优先
2、结合,形成变性蛋白-变性剂复合物,当复合物被除去,从而引起 N-D 反应平衡向右移动,随着变性剂浓度增加,天然状态的蛋白不断转变为复合物,最终导致蛋白质完全变性；2 盐酸胍、尿素对氨基酸的增溶作用,能形成氢键,当浓度高时,能破坏水的氢键结构,结果盐酸胍、尿素就称为非极性残基的较好溶剂,使蛋白质内部的疏水残基伸展和溶解性加强,盐酸胍、尿素引起的变性往往是不可逆的;高浓度尿素使蛋白质变性并抑制 Rnase 活性 十二烷基肌氨酸钠 使蛋白质解体 变性 巯基试剂 1 防止蛋白质或酶等如辅酶 A 分子中 SH 基团氧化成二硫键,2 在某些酶反应过程中维持体系的还原环境;DTT,DDTE、巯基乙醇应用最广
3、,谷胱甘肽也常应用,由于他是生物体内的还原剂,同时氧化后能被谷胱甘肽还原酶原位释放;DNA 提取中,常使用巯基乙醇,维持缓冲液的还原环境,防止多酚类氧化,由于具有一定的毒性,浓度不应高于 2%;巯基乙醇 的主要作用是破坏 RNase 蛋白质中的二硫键肽和蛋白质分子中的残基中的键;1 还原蛋白质二硫键,使 Rna 酶变性 2 抑制酚类氧化,若氧化,核酸会变成灰黑色,苯酚的氧化产物苯醌等氧化物引起磷酸二酯键的断裂及导致 RNA 和 DNA 的交联 3 保护蛋白质的巯基 蛋白质提取中需要 巯基乙醇还原二硫键,使 RNA 酶失活 化学变性剂 SDS、尿素、盐酸胍能破坏疏水键、盐键、氢键、范德华力使蛋白
4、质变性但不影响肽键和二硫键,不能使蛋白质彻底变性 加上还原剂巯基乙醇或 DTT,能还原二硫键,使 RNA 彻底变性 DTT 二硫苏糖醇 刺激性气味要小很多,毒性也比巯基乙醇低很多;而且DTT比巯基乙醇的浓度低7倍时,两者效果相近,但 DTT 价格略高一些;由于容易被空气,因此 DTT 的稳定性较差；但冷冻保存或在中处理能够延长它的使用寿命;由于质子化的硫的亲核性较低,随着 pH 值的降低,DTT 的有效还原性也随之降低；DTT 或含有 DTT 的溶液不能进行高压处理;抑制 Rnase 活性 TCEP 三 2-甲酰乙基膦盐酸盐 半胱氨酸 Trizol 苯酚、异硫氰酸胍、8羟基喹啉、等;TRIzo
5、l 的主要成分是苯酚;苯酚的主要作用是裂解细胞,使细胞中的蛋白,核酸物质解聚得到释放;苯酚虽可有效地,但不能完全抑制 RNA 酶活性,因此 TRIzol 中还加入了 8羟基喹啉、异硫氰酸胍、等来抑制内源和外源 RNaseRNA 酶;%的 8羟基喹啉可以抑制 RNase,与氯仿联合使用可增强抑制作用;异硫氰酸胍属于解偶剂,是一类强力的蛋白质变性剂,可溶解蛋白质并使消失,导致细胞结构降解,核蛋白迅速与核酸分离;的主要作用是破坏 RNase 蛋白质中的二硫键;液氮 组织破碎,裂解细胞 SDS 十二烷基硫酸钠 阴离子去垢剂,高温 55-65裂解细胞,使染色体离析,蛋白变性,形成 SDS/蛋白质/多糖复
6、合物,释放核酸,提高盐 KAc 或 NaAc 浓度并降低温度冰浴,使 SDS/蛋白质/复合物转变为溶解度更小的钾盐酸形式,使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全、离心后除去沉淀,上清液中的DNA 用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀水相中的 DNA 操作简单,温和,可提取到高分子量的 DNA,但产物多糖类杂质较多 阳离子强表面活性剂,通常与蛋白酶 K 和抗氧化剂、螯合剂一起使用 可破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白与 DNA 分离 溶解膜类蛋白 SDS 能裂解细胞;使细胞中的蛋白质和核酸之间常借着静电引力或配位键结合,阴离子去污剂能够破坏这种价键,使染色体离析,蛋白变性,释放核酸;1SDS 是一种,能使蛋白质的和疏水
7、键打开,并结合到蛋白质的疏水部位;2SDS 可引起蛋白质构象改变 3SDS 是一种良好的解离剂,可使蛋白质溶解,变性 4 形成 SDS-蛋白质复合物,并使复合物带负电 质粒方面：在 1的 SDS 溶液中慢慢加入 5 N 的 NaCl,你会发现 SDS 在高盐浓度下是会产生沉淀的;因此高浓度的盐导致了 SDS 的沉淀;但如果你加入的不是 NaCl 而是 KCl,你会发现沉淀的量要多的多;这其实是 sodium dodecylsulfate 遇到后变成了基 potassium dodecylsulfate,PDS,而 PDS 是水不溶的,因此发生了沉淀;如此看来,溶液 III 加入后的沉淀实际上是
8、置换了 SDS 中的纳离子形成了不溶性的 PDS,而高浓度的盐,使得沉淀更完全;大家知道 SDS 专门喜欢和蛋白质结合,平均两个氨基酸上结合一个 SDS 分子,钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了,让人高兴的是大肠杆菌的 DNA 也一起被了;基因组 DNA 一旦发生断裂,只要是 50100 kb 大小的片断,就没有办法再被 PDS 了 CTAB CTAB：十六烷基三甲基溴乙胺,低温时易沉淀 阳离子去污剂 一种在高盐下能和核酸结合形成可溶、稳定的复合物,低盐浓度下可沉淀的表面活性剂 是一种,低离子强度 NaCl,沉淀核酸与酸性多聚糖,而蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液中;在高离子
9、强度的溶液中L NaCl,CTAB 与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸;通过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质后加入沉淀即可使核酸分离出来;CTAB 可从大量产生黏多糖的植物及某些革兰氏阴性菌制备纯化的 DNA,这种去污剂加入调节至高离子强度的细菌和细胞裂解液中 NaCl,经过连续的酚/氯仿抽提,去除 CTAB/黏多糖/蛋白质复合体,异丙醇/无水乙醇沉淀上清即可将 DNA 分离出来 CTAB 还有提高 DNA 互补链复性速率及稳定已形成的 DNA 双螺旋的作用 CTAB 法的主要特点是用用较广 CTAB 溶液在低于 15 度会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的植物材料时,必须预
10、热,且离心温度不低于 15 度 EDTA 酶抑制剂,螯合二价金属,抑制金属依赖性的酶 螯合 Mg2+或 Mn2+离子,抑制细胞中 DNase 的活性,该酶可降解 DNA EDTA 是去垢剂,结合离子用,而它结合的部分离子是能够诱发或者促进 RNA 酶活性的,比如Ca2+;EDTA 是一种二价离子熬合剂,能熬合 Mg2+和 Ca2+等二价阳离子,而多种 RNA 酶的活性是需要依赖二价阳离子的,所以 EDTA 能通过熬合二价阳离子来抑制 RNA 酶的活性 碱性条件下才能够溶解,要和 NaOH 粉末混合后,再加水,然后用 NaOH 水溶液调节 pH;,DNase 酶基本失活;BSA 酶抑制剂,使一些
11、降解酶的活性的表面变性 精胺或其他多胺 酶抑制剂,降低核酸酶的影响 氰化物 酶抑制剂,降低重金属氧化酶的影响 PVP 减少酚类、醌类、单宁类物质的影响,抗氧化作用,络合多酚和萜类物质,防止多酚类褐变而氧化,去除多糖和色素,色素是 PCR 强抑制剂,必须去除 样品液氮研磨及提取缓冲液中加入 PVP 或 PVPP 等能络合多酚和萜类物质,离心或氯仿抽提出去,有效防止多酚氧化成醌类,避免溶液变褐色而具有抗氧化能力 提取液中加入适量的 PVP 或 PVPP能提高 DNA 的纯度,用量根据杂质而定1-6%,PVP同时能去除多糖,因此将 PVP 和巯基乙醇配合使用并调整用量,能有效防止多酚污染 PVP 聚
12、乙烯吡咯烷酮是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA 中酚的污染；同时它也能和多糖结合,有效去除多糖;Triton-x100 TritonX100 之类的去垢剂有苯环结构,所以在 280nm 有很强的吸收;蛋白酶 K 蛋白酶 K：切割活性较广的丝氨酸蛋白酶,切割脂族和芳香族氨基酸的羧基端肽键,将蛋白质降解成小肽或氨基酸,使 DNA 分子完整地分离出来;蛋白酶 K 在较广的 pH 范围内均有活性 pH 温度范围 37-60 度 盐浓度 3M GuHCl 或 4M尿素中均有活性 在一些去污剂：Tween205%、Triton X-100 1%和 SDS1%条件下也有活
13、性;蛋白酶 K 消化裂解法适用于所有标本的消化处理,尤以 DNA 样品为佳.如组 织细胞包括石蜡包埋组织绒毛、毛发、精斑、血液血清、血浆、全血局部分泌 物、尿,粪便等.蛋白酶K 的一般工作浓度是 50100g/ml 蛋白酶蛋白酶 K 或链酶蛋白酶 可以降解蛋白质,灭活核酸酶 DNase 和 RNase,DNase 和 RNase 也用于去除不需要的核酸,有人使用蛋白酶替代 DEPC 处理水的,但有些人说效果不好;蛋白酶 K,威力巨大的广谱蛋白酶,95C 加热 10 分钟,则完全失活;数年前首次使用它替代 DEPC 处理 RNA 抽提用的离心管和枪头,效果不错；后来又用于处理 RNase-Fre
14、e 的水,效果也是一级棒;从此就再也不用 DEPC 了;配制 RNA 裂解试剂时,直接用灭菌的双蒸水配制,最后,加入蛋白酶 K 至终浓度 1ug/ml;轻轻混匀,室温放置 15 分钟后即可;枪头及离心管去除 RNase：先将枪头及离心管清洗干净后,移入预先混好的含 1ug/ml 蛋白酶 K 的双蒸水,彻底浸入;室温放置 30 分钟后,连水一起高压灭菌;弃水后,烘干即可;RNase-Free 水的获得：直接在灭菌的双蒸馏水中加入蛋白酶 K 至终浓度 1ug/ml;轻轻混匀,室温放置 15 分钟后,灭菌处理即可;该蛋白质的残留对后续实验没有可见的影响;无蛋白质残留的 RNase-Free 水的获得
15、：这比较麻烦;直接在灭菌的双蒸馏水中加入蛋白酶 K 至终浓度 1ug/ml;轻轻混匀后,倒入专用的蒸馏器中;放置 15 分钟后,加热蒸馏,流出的就是无蛋白质残留的 RNase-Free 水;要提醒的是,该专用蒸馏器头几次流出来的水,只能当普通蒸馏水用,因为通道中难确保 RNase-Free 的环境；另外,一定要主要密闭性,否则,流出的水又被污染了;DNA 裂解液的作用是破坏细胞膜、,并使组织蛋白与 DNA 分离,抑制细胞中 Dnase 的活性,而的作用是将蛋白质降解成小肽或氨基酸,使完整地分离出来 溶菌酶 溶壁酶 Dnase Rnase 多糖水解酶：水解多糖 饱和酚 酚是一种有机溶剂,预先要用
16、 STE 缓冲液饱和,因未饱和的酚会吸收水相而带走一部分核酸;酚也易氧化发黄,而氧化的酚可引起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交联：故在制备酚饱和液时要加入 82 羟基喹咛,以防止酚氧化;苯酚 非极性分子 水为极性分子 使蛋白质变性,同时抑制了 DNase 的降解作用;用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与 DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶;蛋白分子溶于酚相,而 DNA 溶于水相;使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2.抑制了 DNase 的降解作用;能有效使蛋白质变性而出去,酚形成的有机相破坏蛋白质的胶体稳定性,从而蛋白质不会分布在水相中,避免核酸污染 缺点：1.能溶解
17、 10-15%的水,从而溶解一部分 polyARNA;2.不能完全抑制 RNase 的活性;酚变性大,但与水相有一定程度的互溶,大约 10-15%的水溶在酚相中,使核酸损失 酚 Phenol 对远大于氯仿,按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉,但是水的比重略比水重,碰到高浓度的盐溶液比如 4M 的,离心后酚相会跑到上层,不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重,使得酚/氯仿始终在下层,方便水相的回收；还有一点,酚与水有很大的互溶性,如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中,而酚会抑制很多酶反应比如限制性酶切反应,应此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除,而用酚/
18、氯仿的混合液进行抽提,跑到水相中的酚则少得多,微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行;至于的添加,其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰,也方便了水相的回收;氯仿 非极性分子 水为极性分子 去除脂肪,使更多蛋白质变性,从而提高提取效率 克服酚的缺点；加速有机相与液相分层;最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚;酚易溶于氯仿中 氯仿变性不如酚好,但与水不混溶,不会带走 DNA 因此混合使用最佳,经酚第一次抽提的水相有残留的酚,由于酚和氯仿互溶,可用氯仿第二次带走酚,也可在第二次抽提中混合使用,比例为 1：1 苯酚/氯仿 苯酚、氯仿抽提去除蛋白质 非极性分子 水为极
19、性分子,当蛋白水溶液与他们混合时,蛋白质分子见的水分子被挤去,使蛋白失去水合状态而变性,经离心,变性蛋白密度比对大,而与水相分离,苯酚/氯仿比重大,保留在最下层 苯酚氯仿 使蛋白质变性 量要足够,因为苯酚去除蛋白是有一定的饱和度的,超过饱和度,裂解体系中蛋白质不能被一次性去除,必须多次抽提;离心后分三层,下层中有一些的杂质,白色絮状沉淀是蛋白,中即含有；变性后的蛋白质从水相中析出,位于苯酚中或苯酚与水相之间;异戊醇 抽提 DNA,为混合均匀,容易产生气泡,气泡会阻止相互间的充分作用,加入异戊醇降低分子表面张力,一般采用氯仿：异戊醇=24：1 或酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 不必先配置,临用
20、前加入即可 减少操作过程中产生的气泡;减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡;异戊醇可以降低表面张力,从而减少气泡产生;另外,异戊醇有助于分相,使离心后的上层含 DNA 的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定;NaCl 提供一个高盐环境,使 DNA 充分溶解于液相 沉淀 DNA 时总会加入高浓度的盐,加盐的目的是破坏能使蛋白质保持稳定的两个因素,使蛋白和 DNA 分离并沉淀下来.而此时盐的阳离子会与 DNA 结合形成 DNA-阳离子盐溶于溶液中,再用无水乙醇可以将 DNA-阳离子盐沉淀下来 提取 DNA 时先加 L 氯化钠,因为在这种浓度的氯化钠溶液中,DNA 的溶解度最低,而蛋白质的溶
21、解度增加,这样通过过滤能将 DNA 分离开,以除去蛋白质;再加入 95%的酒精能使 DNA沉淀,因为在这个浓度下 DNA 溶解度最低;如果直接加酒精不先加氯化钠,DNA 和蛋白质都能被酒精所沉淀,就无法将 DNA 和蛋白质分离开;所以必须先加氯化钠后加酒精,顺序不能颠倒;DNA 溶液是 DNA 以稳定存在,当加入乙醇时,乙醇会夺去 DNA 周围的,使 DNA 失水而易于聚合;这样可以是DNA沉淀出来在pH为8左右的溶液中,是带的,加一定浓度的NaAc或NaCl,使 Na+中和上的,减少之间的同性电荷相斥力,易于互相聚合而形成 DNA 钠盐沉淀,当加入的盐溶液浓度太低时,只有部分 DNA 形成
22、DNA 钠盐而聚合,这样就造成DNA沉淀不完全,当加入的盐溶液浓度太高时,其效果也不好;在沉淀的 DNA 中,由于过多的盐杂质存在,影响 DNA 的酶切等反应,必须要进行洗涤或重沉淀;柠檬酸钠 它可以控制反应体系的,同时还有一定的缓冲作用,保证体系 PH 的相对稳定状态,总之在这里的作用类似于食物中的防腐剂;DEPC 焦碳酸二乙酯,它通过和 RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性;与肝素何用效果增强;在 Tris 中不稳定,很快会分解为二氧化碳和乙醇;强烈但不彻底的 RNA 酶抑制剂%浓度 Tris-HCl 缓冲体系,使 pH 变化不会太大 异丙醇 加入异丙醇之后
23、立即出现絮状沉淀,我一直以为这是正确的,看了帖子才知道是蛋白质污染,异丙醇的沉淀效果要比无水乙醇的沉淀效果要好,但是异丙醇沉淀有一个弊端就是会沉淀下来好多的盐和蛋白质这样会影响下一步的操作,一般我加异丙醇是等体积的效果还可以;70%乙醇 70%乙醇洗涤DNA沉淀因为在 70%乙醇里 DNA 是不溶的,而盐离子却可溶,用无水乙醇则达不到这个目的乙醇对于蛋白质、核酸的沉淀效应随分子量加大而增大,小分子的核酸和蛋白质碎片是可以溶于 75%乙醇的;漂洗 DNA,是为了去除残余的盐类,去除过量 SDS 和酚等杂物,因为 SDS 在 70%的乙醇中保持溶解状态,不与 DNA 共沉淀,从而通过弃上清液去除这
24、种去污剂,避免对以后 PCR 反应的影响;DEPC 焦碳酸二乙酯:常用RNA酶抑制剂,与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,强烈但不彻底的 RNA 酶抑制剂 甲酰胺 用高浓度甲酰胺替代苯酚从细胞裂解物的蛋白酶 K 消化物中分离抽提 DNA,甲酰胺是 一种离子化溶剂,能分离蛋白质-DNA 复合物并使蛋白变性和释放,因其不影响蛋白酶 K 的活性,特别适于分离高分子质量的 DNA,其分离物籍火棉胶袋的透析,去除变性蛋白进而纯化 DNA;聚乙二醇 PEG 有机聚合物,无毒,亲水性强,相对分子量 6-20k,沉淀效果主要与其本身的浓度和分子量有关,同时受离子强度、溶液 pH 值和温度等因素
25、的影响,采用该方法可将病毒浓缩10 倍以上;为一种非离子多聚物,多离子多聚物是六十年代发展起来的一类重要沉淀剂;基于多聚物的沉淀作用主要依赖于多聚物的浓度和被沉淀物的分子量大小,Laurent 等 1967 提出 PEG 的沉淀机理主要是通过空间位置排斥,使液体中的微粒包括生物大分子、病毒和细菌等被迫集聚在起而引起沉淀的发生;PEG 最早应用于提纯免疫球蛋白 IgG 和沉淀一些细菌病毒,今年来逐渐应用于核酸和酶的分离纯化,特别是用 PEG 分离质粒 DNA,已相当普遍;用 PEG8000代替乙醇沉淀 DNA,可以在 500ul DNA 液中加入 200ul 20PEG8000 含 12 mol
26、LNaCl,冰浴 20minLi et a1,1994;该操作的优点在于：操作条件温和,不易引起生物大分子的变性;同时具有极高的沉淀效能,少量的 PEG 可以沉淀相当多的生物大分子;乙基黄原酸钾 乙基黄原酸钾能够与多糖结合,形成可溶性复合物,使细胞壁破裂,释放出核酸;此复合物在铵离子存在的情况下可转变为水不溶性,并可通过简单的离心除去,不需要苯酚或氯仿抽提;另外,乙基黄原酸钾能够结合金属离子,抑制 DNase 的活性;Tillett 等 2000 利用该方法从蓝细菌、微生物、环境样品中提取到高质量的核酸,DNA 可以用于酶切、克隆、PCR,RNA 可以用于 RT-PCR,Southern杂交等反应,并且样品中不含核酸酶,温育 16 h 没有发生降解;