学生开放实验报告教材.pdf

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1、 化学化工与生命科学系 生物化学开放实验设计方案（一）食用植物油脂酸价、碘价的测定 专业：xxxx 班级：xxxxxx 小组长：xx 小组成员：xxxxxxx 实验地点：实验楼 A403 实验时间：2014 年 9 月 13 日 指导老师：xx 实验一 食用植物油脂酸价、碘价的测定 1.实验目的（1）掌握测定食品植物油脂的主要常规指标方法；（2）食用植物油脂的品质可由测定其酸价、碘价等理化特性来判断。2.实验原理 2.1 酸价 酸价（酸值）是指中和1.0g 油脂所含游离脂肪酸所需氢氧化钾的毫克数。R-COOH+KOH R-COOK+H20 酸价是反映油脂质量的主要技术指标之一，同一种植物油酸价

2、越高，说明其质量越差越不新鲜。测定酸价可以评定油脂品质的好坏和贮藏方法是否恰当。2.2 碘价 碘价是指在一定条件下与100g油脂起加成反应所需碘的克数。测定碘价可以了解油脂脂肪酸的组成是否正常有无掺杂等。最常用的是氯化碘乙酸溶液法（韦氏法）。其原理：在溶剂中溶解试样并加入韦氏碘液，氯化碘则与油脂中的不饱和脂肪酸起加成反应：CH3CH=CHCOOH+ICl CH3CHI-CHClCOOH 再加入过量的碘化钾与剩余的氯化碘作用，生成游离碘：KI+ICl KCl+I2 游离的碘可用硫代硫酸钠溶液滴定:I2+2Na2S2O3 Na2S4O6+2NaI 同时做空白试验，空白与试样消耗硫代硫酸钠标准溶液之

3、差，从而计算出被测样品所吸收的氯化碘（以碘计）的克数，求出碘价。碘价大的油脂，说明其组成中不饱和脂肪酸含量高或不饱和程度高。3.仪器及材料 3.1 仪器 碘量瓶 250mL；各种分析天平；碱式滴定管；锥形瓶 250mL；常用玻璃仪器。3.2 试剂（1）酚酞指示剂（10g/L）：溶解1g 酚酞于90 mL（95%）乙醇与10 mL 水中。（2）氢氧化钾标准溶液C（KOH）=0.05mol/L。（3）碘化钾溶液（150g/L）：称取15.0g 碘化钾,加水溶解至100 mL,贮于棕色瓶中。（4）硫代硫酸钠标准溶液（0.1mol/L）：按GB601 配制与标定。（5）韦氏碘液试剂：分别在两个烧杯内称

4、入三氯化碘7.9g 和碘8.9g，加入冰醋酸，稍微加热，使其溶解，冷却后将两溶液充分混合，然后加冰醋酸并定容至 1000mL。（6）环己烷（分析纯）。（7）冰乙酸（分析纯）。（8）可溶性淀粉（分析纯）。（9）氢氧化钾标准溶液（0.05mol/L）的标定：（按 GB601 标定或用标准酸标定）。（10）中性乙醚乙醇（2+1）混合液：按乙醚乙醇（2+1）混合，以酚酞为指示剂，用所配的KOH 溶液中和至刚呈淡红色，且30s 内不退色为止。（11）淀粉指示剂（10g/L）配制：称取可溶性淀粉0.50g，加少许水，调成糊状，倒入50ml 沸水中调匀，煮沸至透明，冷却。3.3 材料 食用植物油 3.4 注

5、意事项（1）测酸价，当样液颜色较深时，可减少试样用量，或适当增加混合溶剂的用量。（2）侧碘价时，光线和水分对氯化钾起作用，影响很大，要求所用仪器必须清洁，干燥，碘液试剂必须用棕色瓶盛装且放于暗处。4.实验步骤 4.1 酸价的测定 1）称取 3.00g5.00g 混匀的试样，置于锥形瓶中，加入50mL 中性乙醚乙醇混合液，振摇使油溶解，必要时可置于热水中，温热使其溶解；2）冷至室温，加入酚酞指示剂2-3 滴，以氢氧化钾标准滴定溶液滴定，至初现微红色，且0.5min 内部退色为终点；3）平行2次，空白1次，记录实验数据。4.2 碘价的测定 1）试样的量根据估计的碘价而异（碘价高，油样少；碘价低，油

6、样多），本实验在0.120g-1.130g左右；2）将称好的试样放入250mL 锥形瓶中，加入10mL 环己烷冰乙酸等体积混合液，溶解试样；3）准确加入12.50mL 韦氏试剂，盖好塞子，摇匀后放于暗处30min 以上（碘价低于150 的样品，应放1h；碘价高于150 的样品，应放2h）；4）反应时间结束后，加入10mL 碘化钾溶液(150/L)和75mL 水，用0.1mol/L 硫代硫酸钠滴定至浅黄色，加几滴淀粉指示剂继续滴定至剧烈摇动后蓝色刚好消失；5）在相同条件下，平行2次，空白1次。5.结果与分析 5.1 酸价 5.1.1 计算公式 式中：X试样的酸价（以氢氧化钾计），单位为毫克每克（

7、mg/g）；V试样消耗氢氧化钾标准溶液体积，单位毫升（mL）；C氢氧化钾标准溶液实际浓度（mol/L）；m试样质量，单位为克（g）；56.11与1.0mL 氢氧化钾标准溶液C（KOH）=1.000mol/L相当的氢氧化钾毫克数。计算结果保留两位有效数字。5.1.2 实验数据及处理 数据 组号 试样质量/g 滴定前刻度/ml 滴定后刻度/ml 消耗 KOH 标准液体积/ml 1 3.9680 0.00 1.10 1.10 2 4.0434 1.10 2.35 1.25 3（空白）0 2.35 3.00 0.65 由第一组与空白组数据可计算酸价如下：mg/g32.09680.311.5605.0）

8、65.010.1（1X 由第二组与空白组数据可计算酸价如下：mg/g42.00434.411.5605.0）65.025.1（2X 计算 X1和 X2平均值得此实验样品的酸价为 0.37mg/g。5.2 碘价 5.2.1 计算公式 式中：V1试样消耗的硫代硫酸钠标准溶液的体积，mL；V2空白试剂消耗硫代硫酸钠的体积，mL；C硫代硫酸钠的实际浓度，mol/L；m试样的质量，g；0.12691/2 I2的毫摩尔质量，g/mmol。5.2.2 实验数据及处理 数据 组号 试样质量/g 滴定前刻度/ml 滴定后刻度/ml 试样消耗硫代硫酸钠标准液体积/ml 1 0.16 1.00 7.95 6.95

9、2 0.13 9.10 16.1 7.00 3（空白）0 16.50 38.15 21.65 由第一组与空白组数据可计算碘价如下：mg/100g59.116100160.01269.010.0）95.665.21（1X 由第二组与空白组数据可计算碘价如下：mg/100g01.143100130.01269.010.0）00.765.21（2X 计算 X1和 X2平均值得此实验样品的碘价为 129.8mg/100g。5.2.3 实验图片 使油脂溶解 滴加药液 6.讨论与心得 6.1 思考题 6.1.1 油脂中游离的脂肪酸与酸价有何关系？答：油脂酸价的定义是中和 1g 油脂中的游离脂肪酸所需 KO

10、H 的毫克数。油脂酸价越高，说明样品质量越差，越不新鲜。故酸价是反应油脂质量的主要指标之一。其中，游离脂肪酸（%）=酸价f（f：不同脂肪酸的换算系数，以食品中的主要脂肪酸计）。一般样品以油酸计 0.503 棕榈油以软脂酸计 0.456，椰子油以月桂酸计0.356 菜子油以芥酸计 0.602。6.1.2 哪些指标可以表明油脂的特点？他们表明了油脂哪些方面的特点？答：油脂酸价：酸价（酸值）是指中和 1.0g 油脂所含游离脂肪酸所需氢氧化钾的毫克数。酸价是反映油脂质量的主要技术指标之一，同一种植物油酸价越高，说明其质量越差越不新鲜。测定酸价可以评定油脂品质的好坏和贮藏方法是否恰当。碘价：测定碘价可以

11、了解油脂脂肪酸的组成是否正常有无掺杂等。最常用的是氯化碘乙酸溶液法（韦氏法）。其原理：在溶剂中溶解试样并加入韦氏碘液，氯化碘则与油脂中的不饱和脂肪酸起加成反应，游离的碘可用硫代硫酸钠溶液滴定，从而计算出被测样品所吸收的氯化碘（以碘计）的克数，求出碘价。过氧化值：检测油脂中是否存在过氧化值，以及含量的大小，即可判断油脂是否新鲜和酸败的程度。常用滴定法，其原理：油脂氧化过程中产生过氧化物，与碘化钾作用，生成游离碘，以硫代硫酸钠溶液滴定，计算含量。羰基价：常用比色法测定总羰基价，其原理：羰基化合物和2，4二硝基苯胺的反应产物，在碱性溶液中形成褐红色或酒红色，在 440nm 波长下，测定吸光度，可计算

12、出油样中的总羰基价。中国食用植物油卫生标准规定：羰基价20 mmol/kg。6.2 实验心得 本次实验总体来说进行的还是比较顺利的，而且我们的实验数据与实际值也相差不大，实验中遇到的一些问题也处理的较妥当。指导教师建议：1、2、化学化工与生命科学系 生物化学开放实验设计方案（二）糖类的性质实验-糖类的颜色反应和 还原作用 专业：xxxx 班级：xxxx 小组长：xx 小组成员：xxxxxx 实验地点：实验楼 A403 实验时间：2014 年 9 月 21 日 指导老师：xx 实验二 糖类的性质实验-糖类的颜色反应 一、目的 1了解糖类某些颜色反应的原理。2学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。二

13、、颜色反应（一）-萘酚反应（Molisch 反应）。1原理 糖在浓无机酸（硫酸、盐酸）作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后者能与-萘酚生成紫红色物质。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，故此反应不是糖类的特异反应。2器材 （1）试管及试管架（2）滴管 3试剂 （1）莫氏（Molisch）试剂：5-萘酚的酒精溶液1500mL 称取-萘酚 5g，溶于 95酒精中，总体 积达 100mL，贮于棕色瓶内。用前配制。（2）1葡萄糖溶液 100mL （3）1果糖溶液 100mL （4）1蔗糖溶液 100mL （5）1淀粉溶液 100mL （6）0.1糠醛溶液 100mL （7）浓硫酸 500mL 4操作

14、 取 5 支试管，分别加入 1葡萄糖溶液、1果糖溶液、1蔗糖溶液、1淀粉溶液、0.1糠醛溶液各 1mL。再向 5支试管中各加入 2 滴莫氏试剂，充分混合。斜执试管，沿管壁慢慢加入浓硫酸约 1mL，慢慢立起试管，切勿摇动。浓硫酸在 试液下形成两层。在二液分界处有紫红色环出现。观察、记录各管颜色。（二）间苯二酚反应（Seliwanoff 反应）1原理 在酸作用下，酮糖脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮糖的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应。在实验条件下蔗糖有可能水解而呈阳性反应。2器材 （1）试管及试管架 （2

15、）水浴锅 3试剂 （1）塞氏（Seliwanoff）试剂 0.05间苯二酚-盐酸溶液 1000 mL 称取间苯二酚 0.05 g 溶于 30 mL 浓盐酸中，再用蒸馏水稀释至 100 mL （2）1葡萄糖溶液 100mL （3）1果糖溶液 100mL （4）1蔗糖溶液 100mL 4操作 取 3 支试管，分别加入 1葡萄糖溶液、1果糖溶液、1蔗糖溶液各 0.5 mL。再向各管分别加入塞氏试剂 5 mL，混匀。将 3 支试管同时放入沸水浴中，注意观察、记录各管颜色的变化及变化时间。实验结果：（1）-萘酚反应：试剂 现象 1%葡萄糖溶液 分层；无色 1%果糖溶液 分层；维紫红 1%蔗糖溶液 分层；

16、颜色不分明 1%淀粉溶液 分层 0.1%糖醛溶液 分层；紫红（2）间苯二酚反应：试剂 水浴 5min；5ml 塞氏试剂 水浴10min；5ml 塞氏试剂 水浴5min；10ml 塞氏试剂 1%葡萄糖溶液 无 无 无 1%果糖溶液 微红 砖红 无 1%蔗糖溶液 无 无 无 思考题 可用何种颜色反应鉴别酮糖的存在？多羟基酮称为酮糖，如二羟丙酮、赤藓酮糖、木酮糖、果糖、景天庚酮糖等都是天然存在的酮糖，酮糖都是 碳上有羟基的酮。醛糖和酮糖具有醇羟基和羰基的性质，都是还原糖，因为酮糖分子内虽然无醛基，但其羰基受相邻 碳原子上羟基的影响，而呈现出还原活性。两者的鉴别：(1)西利万诺夫试验(Seliwano

17、fs test)，间苯二酚于盐酸中与酮糖反应呈红色，而醛糖呈色很浅；(2)弱氧化剂，如溴水可将醛糖氧化成相应的糖酸，而对酮糖则无氧化作用。糖类的性质实验-糖类的还原作用 一、目的 学习几种常用的鉴定糖类还原性的方法及其原理。二、原理 许多糖类由于其分子中含有自由的或潜在的醛基或酮基，故在碱性溶液中能将铜、铋、汞、铁、银等金属离子还原，同时糖类本身被氧化成糖酸及其他产物。糖类这种性质常被利用于检测糖的还原性及还原糖的定量测定。本实验进行糖类的还原作用所用的试剂为斐林试剂和本尼迪克特试剂。它们都是含 Cu2+的碱性溶液，能使还原糖氧化而本身被还原成红色或黄色的 Cu2O 沉淀。生成 Cu2O 沉淀

18、的颜色之所以不同是由于在不同条件下产生的沉淀颗粒大小不同引起的，颗粒越小呈黄色，越大则呈红色。如有保护性胶体存在时，常生成黄色沉淀。三、器材 1试管及试管架 2竹试管夹 3水浴锅 4电炉 四、试剂 1斐林（Fehling）试剂 1000mL 甲液（硫酸酮溶液）：称取 34.5 g 硫酸铜（CuSO45H2O）溶于 500 mL 蒸馏水中。乙液（碱性酒石酸盐溶液）：称取 125 g 氢氧化钠和 137 g 洒石酸钾钠溶于 500 mL 蒸馏水中。为了避免变质，甲、乙二液分开保存。用前，将甲、乙二液等量混合即可。2本尼迪克特（Benedict）试剂 1000 mL 称取柠檬酸钠 173 g 及碳酸

19、钠（Na2CO3H2O）100 g 加入600 mL 蒸馏水中，加热使其溶解，冷却，稀释至 850 mL。另称取 17.3 g 硫酸铜溶解于 100 mL 热蒸馏水中，冷却，稀释至 150mL。最后，将硫酸铜溶液徐徐地加入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅拌，混匀，如有沉淀，过滤后贮于试剂瓶中可长期使用。五、操作 先取 1 支试管加入斐林试剂约 1mL，再加入 4 mL 蒸馏水，加热煮沸，如有沉淀生成，说明此试剂已不能使用。经检验，试剂合格后，再进行下述实验。取 5 支试管，分别加入 2 mL 斐林试剂，再向各试管分别加入 1葡萄糖溶液、1果糖溶液、1蔗糖溶液、1麦芽糖溶液、1淀粉溶液各 1mL

20、。置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却。观察各管溶液的变化。实验结果：斐林试剂是一种弱氧化剂，如果是还原性糖就可以和斐林试剂发生氧化还原反应，会看到砖红色氧化亚铜 沉淀生成，本尼迪克特试剂，就是班氏试剂，实验现象和斐林试剂一样，二者的主要成分都是氢氧化铜，前者不稳定，后者稳定性好。实验图片：对实验材料进行提取 实验颜色鉴定 称量实验材料 加入本尼迪克特试剂后颜色对照 实验三 考马斯亮蓝 G250 法测定的蛋白质含量 一、试验目的 1.学习分光光度计的原理及操作 2.学习利用染色方法提高蛋白质消光系数，以提高分光光度法检测灵敏度 二、基本原理 1.根据物质的吸收光谱进行定性或定量分析的方法称为吸收光

21、谱法或分光光度法。该法所用的仪器称为分光光度计或吸收光谱仪。该法所使用的光谱范围包括可见光和紫外光，即包括波长在200-800 nm 之间的光。2.分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广，其中的紫外/可见分光光度技术更是生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。3.紫外区可分为紫外（近紫外）和真空紫外（远紫外）。由于吸收池（又称样品池、比色杯等）和光学元件以及氧气能吸收小于190nm 波长的光，因此常规紫外测定集中在近紫外区，即 200nm-400nm。可见光区为 400nm-800nm。4.考马斯亮蓝 G250 法 原理：考马斯亮蓝 G250 与蛋白质结合后，其最大吸收波长从465nm

22、改变为 595nm,该蛋白染料复合物吸光系数很高，所以检测灵敏度很高，可以测定 1g/mL 的蛋白质，染料和蛋白结合 只需要 2 分钟，颜色在 1 小时内稳定。操作简便，快速，是常用的蛋白含量测定方法之一。去污剂，粘多糖等严重干扰该方法的测定 三、试剂 1.标准蛋白质溶液：0.5mg/ml 牛血清白蛋白溶液 2.考马斯亮蓝 G250 蛋白染色剂：四、操作步骤 1.标准曲线的绘制：取 6 只试管，分别加入浓度为 0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mg/ml 的标准蛋白质溶液 0.1ml，然后加入 5ml 考马斯亮蓝试剂，震荡混匀，2 分钟后于 595nm 测定吸光值，以蛋白质浓度为横坐标

23、，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。2.样品测定：样品液 0.1mL,然后加入 5ml 考马斯亮蓝试剂，震荡混匀，2 分钟后于 595nm 测定吸光值。从标准曲线中查出相应的浓度。五、试验结果 1.数据记录 标准蛋白质溶液浓度 mg/ml 0 0.1 02 0.3 0.4 0.5 C 吸光度 A 0 0.021 0.037 0.056 0.070 0.107 0.017 2.标准曲线的绘制 标准曲线00.050.10.1500.10.20.30.40.50.6标准蛋白质溶液浓度mg/ml吸光度A 3.样品的测定 根据标准曲线可以找出样品对应的点（0.085，0.017），所以样品的浓度为 0.08

24、5mg/ml。实验图片：提取实验材料 实验材料 各类实验材料提取液对照 注意事项：1.分光光度计必须放置在固定而且不受震动的仪器台上，不能随意搬动。严防震动、潮湿和强光直射。2.盛待测液时，必须达到比色杯 2/3 左右，不宜过多。若不慎使溶液流出比色杯外面，必须先用滤纸吸干，再用擦镜纸或绸布擦净才能放入比色杯槽内。移动比色杯槽要轻，以防溶液溅出，腐蚀机件。3.千万不可用手、滤纸、毛刷等物摩擦比色杯光滑面。4.用完比色杯后应立即用自来水冲洗，再用蒸馏水洗净。5.每套分光光度计上的比色杯及比色槽不能随意更换。实验四 氨基酸纤维素薄层层析 一、目的 学习纤维素薄层层析的操作方法，掌握分配层析的原理。

25、二、原理 以纤维素作为支持物，把它均匀地涂布在玻璃板上成一薄层，然后在此薄层上进行层析即为纤维素薄层层析。纤维素是一种惰性支持物，它与水有较强的亲和力而与有机溶剂亲和力较弱。层析时吸着在纤维素上的水是固定相，而展层溶剂是流动相。当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系数不同时，它们就能被分离开。三、实验材料、仪器和试剂 1实验材料 绿豆芽或萌发小麦种子 2仪器 烧杯 50mL1；玻璃板 5 cm20cm1；层析缸；毛细管；喷雾器；研钵。3试剂 标准氨基酸溶液：丝氨酸、色氨酸、亮氨酸，分别以 0.01mol/L 盐酸配成 4mg/mL 的溶液。纤维素粉（层析用）或微晶型纤维素（层析用）；羧

26、甲基纤维素钠（CMC）。层析溶剂系统：正丁醇（分析纯）冰醋酸（分析纯）水411（V/V）。显色剂：0.1茚三酮-丙酮溶液。四、操作步骤 1氨基酸的提取 取已萌发好的小麦种子 2g（或绿豆芽下胚轴 2g），放入研钵中，加 95乙醇 4mL 及少量的石英砂，研成匀浆后，倒入离心管中离心 3 000r/min、15min，上清液即为氨基酸提取液，用滴管小心吸入点样瓶中备用。2制板 取少量羧甲基纤维素钠（约 12mg），置研钵中充分研磨，再称取纤维素粉 3g 于研钵中研磨，再加入 14mL 水研磨匀浆，把纤维素匀浆倒在洗净烘干的玻璃板上，轻轻震动，使纤维素均匀分布在玻璃板上，水平放置风干，用前放入 1

27、00110烘箱中活化 30min。此处羧甲基纤维素钠是起粘合剂作用，它使纤维素粉能较牢固地粘附于玻璃板上，加入量过多会破坏纤维素薄层的毛细作用而使层析速度延缓，加的量过少则粘合不牢固，因此需要注意加量控制。3点样 用刀片将薄层板上薄层的左右各边刮削掉 0.5cm，以防止“边缘效应”。在纤维素薄板上距一端 15mm 处，用铅笔轻轻划出点样记号。样点之间距离 1.3cm。用毛细管吸 取样品，在记号处点样，样品斑点直径控制在 2mm 左右。4展层 将薄板有样品的一端浸入已存放展层溶剂的层析缸中，层析溶剂液面不能高于样品线。待展层溶剂走到距薄板顶端 0.51cm 时取出此薄板（约 12h），用铅笔在前

28、沿处作一记号后用电吹风吹干。5显色 将茚三酮显色剂喷雾在板上，用热吹风吹数分钟，（或置于 7080烘箱中烘干）即可观察到紫红色的氨基酸斑点，脯氨酸例外，为黄色斑点。用铅笔圈出氨基酸斑点，量出溶剂前沿的距离及各斑点中心与起点之间的距离，并计算各氨基酸的 Rf 值。Rf 值为迁移率（rate of flow,Rf），在恒定条件下，每种氨基酸有其一定的 Rf 值。根据已知标准氨基酸和 Rf 值，与小麦（或绿豆芽）提取液中氨基酸的 Rf 值比较，确定提取液中含有哪些种氨基酸。五、附 注 1在操作过程中，手必须洗净，只能接触薄板上层边角；不能对着薄板说话，以防唾液掉在板上。2配制展层剂时，要用纯溶剂，应

29、现用现配，以免放置过久其成分发生变化（酯化）。六、思考题 1什么是分配系数？分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂中的浓度比值。在层析条件确定后分配系数是一常数，以 K 表示 分配系数与溶剂和溶质的性质有关，同时受温度、压力的影响。所以不同物质的分配系数不同。而在恒温恒压条件下，某物质在确定的层析系统中的分配系数为一常数。2薄层层析中极性氨基酸与非极性氨基酸展层的速度哪个快一些？层析的分离是基于氨基酸的非极性性质。物质的极性越小（即非极性越大），在有机溶剂中分配就越多，迁移率就越大；反之物质的极性越大，迁移率越小。所以非极性氨基酸在有机溶剂中展层的速度快于极

30、性氨基酸 3何为“边缘效应”？如何减轻或消除？。在用多元系统进行展层时，其中极性较弱的和沸点较低的溶剂（例如氯仿-甲醇系统中的氯仿）在薄层板的两边易挥发，因此，它们在薄层两边的浓度比在中部的浓度小，也就是说在薄层的两边比中部含有更多的极性较大或沸点较高的溶剂，于是位于薄层两边的 Rf 值要比中间的高，即所谓“边缘效应”。为减轻或消除边缘效应，可在层析缸的内壁贴上浸湿了展开剂的滤纸，使层析缸内溶剂蒸汽的饱和程度增加。七、实验结果（图片）：样本薄板层析 标准氨基酸薄板层析（对照）实验五 过氧化物酶活性的测定 POD 一、原理：过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩

31、合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。本实验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，H2O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的 4-邻甲氧基苯酚红棕色的物质可用分光光度计在 470nm 处测定其消光值，即可求出该酶的活性。，二、实验准备 仪器：分光光度计、离心机、秒表、天平、研钵、磁力搅拌器 试剂：愈创木酚、30%H2O2、0.2mol/L 磷酸缓冲液（7.8）、0.1mol/L 磷酸缓冲溶液（PH6.0，见附录）反应混合液100mmol/L 磷酸缓冲溶液（PH6.0）50ml，加入愈创木酚 28l，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解、待溶液冷 却后，加入（待溶液冷

32、却后再加入，否则引起分解）30%H2O2 19l，混合均匀，保存于冰箱中。三、步骤：1、粗酶液的提取：称取植物材料 0.4-0.5g，加磷酸缓冲液（7.8）5ml（分几次加入），于研钵中研磨成匀浆，以 8000r/min 离心10min，收集上清液于冷处（冰箱 4 度保存）。2、酶活性的测定：一个试管入反应混合液 3ml，磷酸缓冲液（7.8）1ml，作为校零对照，另外加入反应混合液 3ml，上述酶液1ml（龙麦 26 酶液稀释 10 倍，克旱 16 酶液稀释 15 倍），立即开启秒表计时，于 470nm 测 OD 值，每隔 15 秒读 1 次值，读 45 秒，以为每 15 秒钟 OD 变化值测

33、酶活性的大小，以OD/min.mg 蛋白质表示。四、计算公式 Wtt01.0VVA活性POD470 A470：反应时间内吸光值的变化 W：样品重量 V：提取液总体积，即 5ml Vt：测定时所用体积,即 1ml t：反应时间 注意：一般来说，都需要稀释，如果酶液稀释了，应在计算时乘上相应的倍数。磷酸缓冲液配置 A 0.2mol/l NaH2PO4 27.8g NaH2PO4H2O 1000ml B 0.2mol/l Na2HPO4 71.7g Na2HPO412H2O 1000ml A(ml)B(ml)PH7.8 8.5 91.5 200ml PH6.0 87.7 12.3 五、实验结果：A470nm=0.003/0.01=0.3 植物叶过氧化物酶活力=6.0 六、实验图片：对植物组织进行碾磨 将碾磨后组织装进离心管中 离心操作 紫外分光光度值测定