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1、外源基因的表达及其优化策略第一页，讲稿共一百三十三页哦本章重点掌握内容本章重点掌握内容基因表达的关键要素及要求基因表达的关键要素及要求影响外源基因表达的因素影响外源基因表达的因素表达产物的纯化表达产物的纯化甲醇酵母表达系统甲醇酵母表达系统第二页，讲稿共一百三十三页哦第一节影响外源基因表达的因素第一节影响外源基因表达的因素基因表达：基因表达：从从DNA分子有序地将其所承载的遗传信息，通过密码分子有序地将其所承载的遗传信息，通过密码子和反密码子系统，转变为由特定氨基酸顺序构成的多肽子和反密码子系统，转变为由特定氨基酸顺序构成的多肽或蛋白质分子过程，从而决定生物有机体遗传表型。或蛋白质分子过程，从而
2、决定生物有机体遗传表型。第三页，讲稿共一百三十三页哦 基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。有加工过程。基因工程中基因工程中，基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的，基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。第四页，讲稿共一百三十三页哦基因表达基因表达 遗传信息从遗传信息从DNA到蛋白质的传递到蛋白质的传递过程。过程。中心法
3、则中心法则central dogma第五页，讲稿共一百三十三页哦克隆基因的表达克隆基因的表达 外源基因在宿主细胞中表达外源基因在宿主细胞中表达 外源基因外源基因 表达载体表达载体 重组载体重组载体 导入宿主细胞导入宿主细胞 在宿主细胞中在宿主细胞中 表达出蛋白质表达出蛋白质 提取蛋白提取蛋白 宿主细胞：宿主细胞：原核细胞或真核细胞原核细胞或真核细胞第六页，讲稿共一百三十三页哦 一、一、影响外源基因表达的因素主要有：影响外源基因表达的因素主要有：阅读框架阅读框架 顺式作用元件顺式作用元件 翻译过程翻译过程 表达体系表达体系第七页，讲稿共一百三十三页哦（一）阅读框架一）阅读框架(open read
4、ing frame)对外源基因表达的影响对外源基因表达的影响 （二）顺式作用元件二）顺式作用元件(cis-acting element)对基因表达的影响对基因表达的影响 顺式作用元件是转录调节因子结合位点，如启动子、增强子和沉默子 1.对基因转录起始的调控对基因转录起始的调控 2.对基因转录终止的调控对基因转录终止的调控 3.对对DNA结构的影响结构的影响 第八页，讲稿共一百三十三页哦（二）顺式作用元件（二）顺式作用元件(cis-acting element)对基因表达的影响对基因表达的影响 1.对基因转录起始的调控对基因转录起始的调控 1)启动子启动子：RNA聚合酶及转录起始点周围的一组转录
5、控制组件 TATA box GC box CAAT Box 提高转录准确性与频率 2)增强子：增强子：远离转录起始点（上游或下游）、决定组织特异性表达、增强启动子转录活性的特异DNA序列 3)沉默子：沉默子：负调节元件，对基因转录起阻遏作用第九页，讲稿共一百三十三页哦 （二）（二）顺式作用元件对基因表达的影响顺式作用元件对基因表达的影响 2.对基因转录终止的调控对基因转录终止的调控 1)终止子终止子：给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列 2)衰减子：衰减子：操纵子的前导区(操纵子内开始转录到结构基因编码开始位置之间的一段DNA)内类似于终止子结构的一段DNA序列 3.对对DNA结构的影响结
6、构的影响 1)核基质结合区核基质结合区：造成一种分割作用，使每个转录单元保持相对的独立性 2)绝缘子绝缘子：阻止临近调控元件，对所界定基因的启动子起增强或者阻遏的作用 3)基因座控制区：基因座控制区：以组织特异性及拷贝数依赖的方式将相关基因的表达增强到生理学水平的异位染色质位点第十页，讲稿共一百三十三页哦 （三）（三）翻译过程对表达的影响翻译过程对表达的影响 1.翻译起始对基因表达的影响翻译起始对基因表达的影响 2.密码子偏爱性对基因表达的影响密码子偏爱性对基因表达的影响 3.翻译终止对基因表达的影响翻译终止对基因表达的影响 （四）（四）表达系统对表达产物的影响表达系统对表达产物的影响第十一页
7、，讲稿共一百三十三页哦第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达 外源基因表达系统由基因外源基因表达系统由基因表达载体表达载体和相应的和相应的受体细胞受体细胞两部两部分组成。分组成。宿主细胞分为两大类：宿主细胞分为两大类：第一类为原核细胞：第一类为原核细胞：大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；第二类为真核细胞：第二类为真核细胞：酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。目前使用最广泛的宿主菌是大肠杆菌和酿酒酵母，已建立了许多适合它们的目前使用最广泛的宿主菌是大肠杆菌和酿酒酵母，已建立了许多适合它们的克隆载体和克隆载体
8、和DNADNA导入方法。许多外源基因已获得成功表达。导入方法。许多外源基因已获得成功表达。第十二页，讲稿共一百三十三页哦用原核生物作宿主。用原核生物作宿主。A dividing E.coli 原核或噬菌体启动子原核或噬菌体启动子 MCS SD序列序列 终止子终止子 第十三页，讲稿共一百三十三页哦大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的大肠杆菌表达外源基因的优势优势 全基因组测序，共有全基因组测序，共有44054405个开放型阅读框架个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定繁
9、殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国被美国FDAFDA批准为安全的基因工程受体生物批准为安全的基因工程受体生物第十四页，讲稿共一百三十三页哦大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的大肠杆菌表达外源基因的劣势劣势 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白真核与原核生物结构上存在差别真核与原核生物结构上存在差别第十五页，讲稿共一百三十三页哦一、原核生物细胞表达的特点
10、一、原核生物细胞表达的特点 1.原核生物只有原核生物只有一种一种RNA聚合酶聚合酶识别原核细胞的启动子，识别原核细胞的启动子，催化所有催化所有RNA的合成。的合成。2.原核生物的表达是以原核生物的表达是以操纵子操纵子为单位的。为单位的。Z Z编码编码-半乳糖苷酶；半乳糖苷酶；Y Y编码编码-半乳糖苷透过酶；半乳糖苷透过酶；A A编码编码-半乳糖苷乙酰基半乳糖苷乙酰基转移酶。转移酶。第十六页，讲稿共一百三十三页哦一、原核生物细胞表达的特点一、原核生物细胞表达的特点 3.原核生物的转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。原核生物的转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。4.原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加
11、工系统。原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。5.原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产物直接控制要慢。因产物直接控制要慢。第十七页，讲稿共一百三十三页哦转录和翻译偶联、连续进行转录和翻译偶联、连续进行第十八页，讲稿共一百三十三页哦一、原核生物细胞表达的特点一、原核生物细胞表达的特点 6.在大肠杆菌在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个翻译起始的核糖体结合位点上，含有一个翻译起始密码子及同密码子及同16S RNA 3末端碱基互补的序列，即末端碱基互补的序列，即SD序列序列。Shine-Dalgarno（S-D）sequ
12、ence:含有一个启始密码子和一段同含有一个启始密码子和一段同核糖体核糖体16SRNA3末端碱基互补的序列，叫末端碱基互补的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列。序列。第十九页，讲稿共一百三十三页哦二、外源基因在原核细胞中表达具备条件二、外源基因在原核细胞中表达具备条件 1.通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白。通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白。2.外源基因不能带有间隔顺序外源基因不能带有间隔顺序(内含子内含子)，因而必须用，因而必须用cDNA或全化学合成基因，而或全化学合成基因，而不能用基因组不能用基因组DNA。3
13、.必须利用原核细胞的强启动子和必须利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控元件控制外源基因的表达。序列等调控元件控制外源基因的表达。4.外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架(ORF)。5.利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。产物对宿主菌的毒害。第二十页，讲稿共一百三十三页哦 原核生物基因表达载体的组成特征原核生物基因表达载体的组成特征 启动子启动子 核糖体结合位点核糖体结合位点(SD序列序列)终止子终止子 选择标记基因选择标记
14、基因 复制子复制子 原核生物基因表达的受体系统原核生物基因表达的受体系统 大肠杆菌受体系统、芽孢杆菌受体系统大肠杆菌受体系统、芽孢杆菌受体系统 链霉菌受体系统、蓝藻受体系统链霉菌受体系统、蓝藻受体系统第二十一页，讲稿共一百三十三页哦大肠杆菌表达载体的基本成分大肠杆菌表达载体的基本成分第二十二页，讲稿共一百三十三页哦三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控 1.启动子启动子 是是DNA上的能与上的能与RNA聚合酶结合并能起始聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。合成的序列。（1）启动子序列）启动子序列 大大肠肠杆杆菌菌的的所所有有启启动动子子中中都都有有两两段段一一致致顺顺序序（co
15、nsensus sequence）。）。-35 Box 和和-10 Box 第二十三页，讲稿共一百三十三页哦不同启动子的不同启动子的consensus sequences 第二十四页，讲稿共一百三十三页哦三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控 1.启动子启动子（1）启动子序列）启动子序列 -35box：RNA聚合酶聚合酶 亚基的识别位点亚基的识别位点。5-TTGACA-3 -10box（Pribnow Box）：）：5-TATAAT-3 TTGACATTGACA TATAAT TATAAT 转录起始位点转录起始位点 17bp17bp 5 5 核糖体结合位点核糖体结合位点 第二十五
16、页，讲稿共一百三十三页哦原核启动子共有序列的功能 三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控 1.启动子启动子（1）启动子序列）启动子序列第二十六页，讲稿共一百三十三页哦三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控 1.启动子启动子 （2）翻译的起始位点）翻译的起始位点 a)核糖体结合位点（核糖体结合位点（ribosome binding site,RBS）Shine-Dalgarno（SD）sequence：mRNA上与核糖体上与核糖体16sRNA结合的序列。结合的序列。S-D序列距离序列距离AUG的距离也影响翻译的距离也影响翻译 b)起始密码：位于起始密码：位于SD序列下
17、游序列下游 AUG（91%）、）、GUG（8%）、）、UUG（1%）第二十七页，讲稿共一百三十三页哦三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控 2.RNA多聚酶多聚酶 大肠杆菌只有一种类型的大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录多聚酶转录tRNA，rRNA和和mRNA。第二十八页，讲稿共一百三十三页哦三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控 3.转录终止子转录终止子 在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。启动子启动子 操纵区操纵区S-D序列序列 目的基因目的基因 终止子终止子 第二十九页，讲稿共一百三十三页哦三、原
18、核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控 3.转录终止子转录终止子 原理：原理：茎环结构茎环结构 反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了板之间配对的碱基数降低，整个减弱了RNA 与与DNA的互作的互作 多聚多聚A/U 由于茎环由于茎环3段紧接一串段紧接一串A/U的配对，稳定性比较差，有利于的配对，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。转录物脱落而不利于转录延续。第三十页，讲稿共一百三十三页哦三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控 3.转录终止子转录终止子第三
19、十一页，讲稿共一百三十三页哦三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控 3.转录终止子转录终止子第三十二页，讲稿共一百三十三页哦三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控 4.翻译终止密码翻译终止密码 大肠杆菌偏爱大肠杆菌偏爱UAAU。一般安置上。一般安置上全部的三个终止密码全部的三个终止密码防止核防止核糖体跳跃（糖体跳跃（skipping）。）。5.翻译增强子（翻译增强子（Translation enhancer）能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列。能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列。T7噬菌体基因噬菌体基因10前导序列（简称前
20、导序列（简称g10-L序列）序列）;大肠杆菌大肠杆菌atpE基因基因mRNA5-UTR中富含中富含U的区段的区段第三十三页，讲稿共一百三十三页哦四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体1.非融合型表达载体非融合型表达载体载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。融合在一起。S-D序列序列 ATG-外源基因外源基因-TAG 优点：优点：产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。缺点：缺点：容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。第三十四页，讲稿共一百三十三页哦四、常用大肠杆
21、菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体 1.非融合型表达载体非融合型表达载体 pKK223-3 载体：载体：结构组成：结构组成：1）强启动子）强启动子:tac（trp-lac）2）操纵基因：乳糖操纵子系统。）操纵基因：乳糖操纵子系统。trp的的-35区区 lacUV5的的-10区区 laclac操纵基因操纵基因 第三十五页，讲稿共一百三十三页哦四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体 1.非融合型表达载体非融合型表达载体 pKK223-3 载体：载体：结构组成：结构组成：3）调节基因：宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。）调节基因：宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。如如JM105菌。菌。4）终止
22、子：）终止子：rrnB的强终止子的强终止子 S-D序列和插入位点区：序列和插入位点区：S-DS-D 插入位点区插入位点区 Lac I 第三十六页，讲稿共一百三十三页哦四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体 1.非融合型表达载体非融合型表达载体 pKK223-3 载体：载体：结构组成：结构组成：6）载体的其余部分：来自）载体的其余部分：来自pBR322质粒。质粒。7）表达诱导物：）表达诱导物：IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）（乳糖的类似物，不会被降解）tac P Lac O S-D 插入位点区插入位点区 rrnB T 宿主宿主lac I 阻遏物阻遏物 IPTG 第三十七页，讲稿共一
23、百三十三页哦四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体 1.非融合型表达载体非融合型表达载体 pKK223-3 载体：载体：条件：条件：必须选择一个有必须选择一个有lacI的宿主菌。的宿主菌。第三十八页，讲稿共一百三十三页哦四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体 2.分泌型表达载体分泌型表达载体 载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。主菌分泌到细胞周质中。如：如：pIN III系列：系列：pIN III-comA1,pIN III-comA2,pIN III-comA3,第三十九页，
24、讲稿共一百三十三页哦四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体 2.分泌型表达载体分泌型表达载体 pIN III系列系列 组成结构组成结构 1）强启动子：）强启动子：Ipp（脂蛋白基因启动子）和（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子。启动子。2）调节基因：）调节基因：lac I。3）S-D序列和起始密码序列和起始密码ATG。4）分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因）分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。5）插入位点区（多克隆位点）。）插入位点区（多克隆位点）。IppIpp lac Plac P lac Olac O S-D/ATGS-D/ATG ompaompa 插入位点插入位点 第四
25、十页，讲稿共一百三十三页哦pIN III-comA1 四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体 2.分泌型表达载体分泌型表达载体第四十一页，讲稿共一百三十三页哦四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合蛋白表达载体系统融合蛋白表达载体系统 表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。如：如：pGEX系列系列 优点：便于融合蛋白的分离和纯化。优点：便于融合蛋白的分离和纯化。组成结构：组成结构：1）启动子：）启动子：tac 2）操纵基因：）操纵基因：lacP 3）调节基因：）调节基因：lacI
26、4）S-D序列序列 5）ori：pBR322 ori 6）融合肽：）融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）谷胱甘肽巯基转移酶）第四十二页，讲稿共一百三十三页哦 四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合蛋白表达载体系统融合蛋白表达载体系统 pGEX系列系列lacIlacI tac tac lac Olac O S-D/ATGS-D/ATG GSTGST 插入位点插入位点 TGATGA lacPlacP GST融合蛋白用融合蛋白用Glutathione Sepharose亲和层析柱分离亲和层析柱分离纯化。纯化。产物提纯产物提纯:第四十三页，讲稿共一百三十三页哦 四、常用大肠杆菌表达
27、载体四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合蛋白表达载体系统融合蛋白表达载体系统 pGEX系列系列 产物分离产物分离:用凝血酶或用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从因子可以把外源蛋白从GST上切下来。上切下来。第四十四页，讲稿共一百三十三页哦pGEX-2XpGEX-2X的插入区的插入区pGEX-1XpGEX-1X的插入区的插入区pGEX-3XpGEX-3X的插入区的插入区四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合蛋白表达载体系统融合蛋白表达载体系统 pGEX系列插入区系列插入区第四十五页，讲稿共一百三十三页哦四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体 4.其他融合蛋白系统其他融合
28、蛋白系统 His-tag（组氨酸标签）（组氨酸标签）在外源多肽的在外源多肽的N端或端或C端接上端接上6个组氨酸（个组氨酸（His）。）。His-tag能与能与Ni2+柱结合，但很容易被柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。洗脱下来，可以纯化蛋白质。第四十六页，讲稿共一百三十三页哦五、外源基因在大肠杆菌中的表达形式五、外源基因在大肠杆菌中的表达形式位于位于细胞质细胞质细胞周质细胞周质细胞外细胞外表达产物表达产物形式形式包涵体蛋白包涵体蛋白融合蛋白融合蛋白整合型外源蛋白整合型外源蛋白分泌型外源蛋白分泌型外源蛋白第四十七页，讲稿共一百三十三页哦细胞质中表达细
29、胞质中表达:外源基因在大肠杆菌寄主细胞质中高效表达时，常会外源基因在大肠杆菌寄主细胞质中高效表达时，常会发生一种特殊的生理现象，形成包涵体。发生一种特殊的生理现象，形成包涵体。包涵体：存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚包涵体：存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。集折叠而成的晶体结构物。第四十八页，讲稿共一百三十三页哦蛋白质的合成是在细胞之中进行的蛋白质的合成是在细胞之中进行的 目标蛋白在细胞质中表达的主要优点是：目标蛋白在细胞质中表达的主要优点是：表达质粒的构建比较简单；表达质粒的构建比较简单；能够达到很高的目标蛋白表达量，一般可以达到占细胞总能够达到很高的目标蛋
30、白表达量，一般可以达到占细胞总 蛋白的蛋白的20%20%40%40%。目标蛋白在大肠杆菌系统表达的形式有二种：目标蛋白在大肠杆菌系统表达的形式有二种：在细胞内表现为不溶性的包涵体颗粒在细胞内表现为不溶性的包涵体颗粒 包涵体存在于大肠杆菌细胞质中包涵体存在于大肠杆菌细胞质中 在细胞内表现为可溶性的蛋白质在细胞内表现为可溶性的蛋白质 可溶性的目标蛋白质除可存在于细胞质中外，还可借助于可溶性的目标蛋白质除可存在于细胞质中外，还可借助于 本身的功能序列和大肠杆菌蛋白质加工、运输体系，最终分本身的功能序列和大肠杆菌蛋白质加工、运输体系，最终分 泌到周质空间，或外泌到培养液中。泌到周质空间，或外泌到培养液
31、中。第四十九页，讲稿共一百三十三页哦周质中表达：周质中表达：周质：在大肠杆菌一类革兰氏阴性菌中，位于内周质：在大肠杆菌一类革兰氏阴性菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。膜和外膜之间的细胞结构部分。在周质中表达的蛋白，需要信号肽序列才能从细在周质中表达的蛋白，需要信号肽序列才能从细胞质中穿过细胞质内膜进入周质胞质中穿过细胞质内膜进入周质。第五十页，讲稿共一百三十三页哦胞外表达：胞外表达：使克隆在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白质，使克隆在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白质，分泌到胞外培养基中进行分离纯化。分泌到胞外培养基中进行分离纯化。途径：途径：1.1.用大肠杆菌细胞固有的途径，使真正属于分用大肠
32、杆菌细胞固有的途径，使真正属于分泌型的蛋白质直接分泌到胞外培养基中。（不是特泌型的蛋白质直接分泌到胞外培养基中。（不是特别有效的程序）别有效的程序）2.2.诱导大肠杆菌细胞的外膜发生有限的渗漏，诱导大肠杆菌细胞的外膜发生有限的渗漏，导致胞内的蛋白质向胞外培养基方向分泌。导致胞内的蛋白质向胞外培养基方向分泌。（可以分离到中等产量的蛋白质）（可以分离到中等产量的蛋白质）第五十一页，讲稿共一百三十三页哦五、外源基因在大肠杆菌中的表达形式五、外源基因在大肠杆菌中的表达形式 1.包涵体蛋白包涵体蛋白 本质：本质：细胞内蛋白质的不断聚集细胞内蛋白质的不断聚集 包括：包括：1.1.折叠状态的蛋白质的聚集作用
33、；折叠状态的蛋白质的聚集作用；2.2.非折叠状态的蛋白质的聚集作用；非折叠状态的蛋白质的聚集作用；3.3.蛋白质的中间体结构。蛋白质的中间体结构。优点：优点：易于分离纯化易于分离纯化第五十二页，讲稿共一百三十三页哦包涵体及其性质包涵体及其性质 在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体涵体（Inclusion Bodies，IB）。）。包涵体基本由蛋白质组成，其中大部分是
34、外源基因的表达产物，具有正确的包涵体基本由蛋白质组成，其中大部分是外源基因的表达产物，具有正确的AA序列，但序列，但空间构想往往是错误的，因而没有活性，此外，它还含有受体细胞本身高效表达的蛋白产物空间构想往往是错误的，因而没有活性，此外，它还含有受体细胞本身高效表达的蛋白产物（如（如RNA聚合酶、外膜蛋白等），以及质粒的编码蛋白，其第三种组分是聚合酶、外膜蛋白等），以及质粒的编码蛋白，其第三种组分是DNA、RNA、脂多、脂多糖等非蛋白分子。糖等非蛋白分子。第五十三页，讲稿共一百三十三页哦包涵体表达形式的优点包涵体表达形式的优点 在一定程度上保持表达产物的结构稳定在一定程度上保持表达产物的结构稳
35、定 能够避免细胞内蛋白水解酶的作用，有利于目标蛋白的富集能够避免细胞内蛋白水解酶的作用，有利于目标蛋白的富集 简化外源基因表达产物的分离操作简化外源基因表达产物的分离操作 包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌 体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细 菌裂解物中分离出来菌裂解物中分离出来 能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白。第五十四页，讲稿共一百三十三页哦包涵体表达形式的缺点包涵体表达形
36、式的缺点 以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过 有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生 物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收 率至关重要。率至关重要。经过复性处理的目标蛋白不一定能完全恢复原来的生物学活性，经过复性处理的目标蛋白不一定能完全恢复原来的生物学活性，有时甚至完全得不到有活性的蛋白蛋，尤其当目标蛋白分子中的有时甚至完全得不到有活性的蛋白蛋，尤其当
37、目标蛋白分子中的Cys 残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过 30%复性处理工艺可使目标蛋白的制备成本上升。复性处理工艺可使目标蛋白的制备成本上升。第五十五页，讲稿共一百三十三页哦形成包涵体的原因：形成包涵体的原因：缺少真核生物中翻译后修饰所需的酶，使中间体大量积累。缺少真核生物中翻译后修饰所需的酶，使中间体大量积累。缺乏蛋白质折叠过程中需要的某些酶和辅因子，或环境不适无法缺乏蛋白质折叠过程中需要的某些酶和辅因子，或环境不适无法 形成正确的次级键。形成正确的次级键。表达水平（重组异源蛋白过量表达）。表达水平（重组异源蛋
38、白过量表达）。细菌的遗传性状。细菌的遗传性状。异源蛋白氨基酸序列（含硫氨基酸越多越容易）。异源蛋白氨基酸序列（含硫氨基酸越多越容易）。第五十六页，讲稿共一百三十三页哦减少形成包涵体的策略：减少形成包涵体的策略：降低重组菌的生长温度降低重组菌的生长温度 添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂（高浓度多醇类、蔗糖）添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂（高浓度多醇类、蔗糖）供给丰富的培养基，创造最佳培养基（供氧、供给丰富的培养基，创造最佳培养基（供氧、pH等）等）第五十七页，讲稿共一百三十三页哦包涵体的分离：包涵体的分离：菌体破碎（高压匀浆、高速碾磨、低温反复冻融等）菌体破碎（高压匀浆、高
39、速碾磨、低温反复冻融等）离心收集（高速离心）离心收集（高速离心）清洗（去污剂和低浓度变性剂洗涤以除去脂类和膜蛋白）清洗（去污剂和低浓度变性剂洗涤以除去脂类和膜蛋白）第五十八页，讲稿共一百三十三页哦包涵体的变性与复性操作包涵体的变性与复性操作 包涵体的溶解与变性包涵体的溶解与变性 包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的二硫键二硫键和和次级键。次级键。在在 人工条件下，使包涵体溶解并重新进入复性途径中。人工条件下，使包涵体溶解并重新进入复性途径中。能有效促进包涵体溶解变性的试剂和条件包括：能有效促进包涵体溶解变性的试剂和条件包括：清清 洗洗 剂剂 SDS、
40、正十二醇肌氨酸、正十二醇肌氨酸 促促 溶溶 剂剂 盐酸胍、尿素盐酸胍、尿素 混混 合合 溶溶 剂剂 如尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，如尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解力增强溶解力增强 极极 端端 pH 廉价，但许多蛋白质在极端廉价，但许多蛋白质在极端pH条件下发生修饰反应条件下发生修饰反应第五十九页，讲稿共一百三十三页哦包涵体的变性与复性操作包涵体的变性与复性操作 包涵体的复性与重折叠包涵体的复性与重折叠 包涵体的复性与重折叠的主要任务：包涵体的复性与重折叠的主要任务：将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠 通过次级键的形成使蛋白质复性通过次级键的形成使蛋白
41、质复性第六十页，讲稿共一百三十三页哦伸展态后期中间体中间体聚集体（聚集过程）天然态（复性过程）快慢慢 包涵体蛋白质的折叠复性效率取决于正确折叠过程与聚集过程之间的竞包涵体蛋白质的折叠复性效率取决于正确折叠过程与聚集过程之间的竞争，涉及两种疏水作用：争，涉及两种疏水作用：分子内疏水相互作用，可促进正确折叠；分子内疏水相互作用，可促进正确折叠；部分折叠肽链分子间的疏水相互作用，会导致蛋白质聚集。部分折叠肽链分子间的疏水相互作用，会导致蛋白质聚集。第六十一页，讲稿共一百三十三页哦一个有效、理想的折叠复性方法应具备的特点：一个有效、理想的折叠复性方法应具备的特点：活性蛋白质的回收率高活性蛋白质的回收率
42、高 正确复性的产物易于与错误折叠的蛋白质分离正确复性的产物易于与错误折叠的蛋白质分离 折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品 折叠复性方法易于放大折叠复性方法易于放大 复性过程耗时较少复性过程耗时较少第六十二页，讲稿共一百三十三页哦 五、外源基因在大肠杆菌中的表达形式五、外源基因在大肠杆菌中的表达形式 2.融合蛋白融合蛋白 将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因的阅读框，这种方式表达的蛋白因的阅读框，这种方式表达的蛋白.优点：优点：稳定性加强；具有较高的水溶性和一定的生物活性；
43、能高效稳定性加强；具有较高的水溶性和一定的生物活性；能高效表达；易于分离纯化表达；易于分离纯化.第六十三页，讲稿共一百三十三页哦融合基因：通常是指通过自发突变事件形成的或是应用融合基因：通常是指通过自发突变事件形成的或是应用DNADNA重组技术构建的一类具有来自两个或两个以上不同基因的重组技术构建的一类具有来自两个或两个以上不同基因的核苷酸序列的新型基因。核苷酸序列的新型基因。融合蛋白质：由克隆在一起的两个或数个不同基因的编码序融合蛋白质：由克隆在一起的两个或数个不同基因的编码序列组成的融合基因，转译产生的单一的多肽序列。其中通常列组成的融合基因，转译产生的单一的多肽序列。其中通常受体细菌蛋白
44、部分位于受体细菌蛋白部分位于N N端，异源蛋白位于端，异源蛋白位于C C端。端。第六十四页，讲稿共一百三十三页哦 融合蛋白质配偶体：指融合蛋白质中与目标融合蛋白质配偶体：指融合蛋白质中与目标蛋白质连接的别种蛋白质组分。蛋白质连接的别种蛋白质组分。常见的配偶体：葡萄球菌蛋白质常见的配偶体：葡萄球菌蛋白质A(SPA)、链、链球菌蛋白质球菌蛋白质G(SPG)、谷胱甘肽、谷胱甘肽-S-转移酶转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白麦芽糖结合蛋白(MBP)和硫氧还蛋白和硫氧还蛋白(Trx)。第六十五页，讲稿共一百三十三页哦融合蛋白表达系统的构建的三个原则：融合蛋白表达系统的构建的三个原则：首先，受体细菌结构基因
45、应能高效表达，且其首先，受体细菌结构基因应能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化。表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化。其次，外源基因应插在受体菌结构基因的下游其次，外源基因应插在受体菌结构基因的下游区域，并为融合蛋白提供终止密码子。另外，两个区域，并为融合蛋白提供终止密码子。另外，两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决定了融合蛋白的裂解方法。决定了融合蛋白的裂解方法。最后，当两个蛋白编码序列融合在一起时，外最后，当两个蛋白编码序列融合在一起时，外源基因的表达取决于其正确的翻译阅读框架。源基因的表达取决于其正确的
46、翻译阅读框架。第六十六页，讲稿共一百三十三页哦生命科学学院生命科学学院第六十七页，讲稿共一百三十三页哦用融合载体组合表达融合蛋白质：用融合载体组合表达融合蛋白质：以以Ecoli.lacZ为靶基因的组合最典型，含三个不同为靶基因的组合最典型，含三个不同载体，每个载体都有一个载体，每个载体都有一个lacZ启动子和启动子和SD序列，且在序列，且在lacZ基因下游部位具有一基因下游部位具有一EcoR识别序列识别序列(GAATTC)5上游存在着不同数量的上游存在着不同数量的G-C碱基对。三种情况必有一碱基对。三种情况必有一个保持着正确的读码结构，产生出真实的融合蛋白质。个保持着正确的读码结构，产生出真实
47、的融合蛋白质。第六十八页，讲稿共一百三十三页哦生命科学学院生命科学学院第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达第六十九页，讲稿共一百三十三页哦第七十页，讲稿共一百三十三页哦第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达第七十一页，讲稿共一百三十三页哦大肠杆菌甘露醇大肠杆菌甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因磷酸脱氢酶基因(mtld)引物引物引物引物1：5GTTGGATCCATGAAAGCATTACATTTTGGCG 3引入引入BamHI酶切位点酶切位点引物引物2：5TGGGAGCTCATTATTGCATTGCTTTATAAGCG3引入引入SacI酶切位点酶切
48、位点全长全长1149bp，382个氨基酸，个氨基酸，45kD第七十二页，讲稿共一百三十三页哦融合蛋白质表达系统的优点：融合蛋白质表达系统的优点：第一个显著特点是稳定性大大增加。第一个显著特点是稳定性大大增加。第二个特点是融合蛋白质的多肽片段有可能构成第二个特点是融合蛋白质的多肽片段有可能构成信号肽序列指导蛋白质分配到细胞的正确部位。信号肽序列指导蛋白质分配到细胞的正确部位。第三个特点是分离纯化简单。可根据受体细菌蛋第三个特点是分离纯化简单。可根据受体细菌蛋白的特异性抗体、配体底物等迅速纯化融合蛋白质。白的特异性抗体、配体底物等迅速纯化融合蛋白质。第七十三页，讲稿共一百三十三页哦融合蛋白质的纯化
49、融合蛋白质的纯化 基本原理：基本原理：利用与融合蛋白质配偶体相对应的配利用与融合蛋白质配偶体相对应的配体作为吸附剂，制备亲和层析柱，通过配偶体与配体体作为吸附剂，制备亲和层析柱，通过配偶体与配体之间的相互作用，过柱的融合蛋白质被滞留下来，其之间的相互作用，过柱的融合蛋白质被滞留下来，其它蛋白质则流出柱外，经洗脱处理，便可回收到纯化它蛋白质则流出柱外，经洗脱处理，便可回收到纯化的融合蛋白质。的融合蛋白质。第七十四页，讲稿共一百三十三页哦 异源蛋白质的回收：异源蛋白质的回收：将其中大肠杆菌多肽组分切除掉。融合蛋白的位点专一性断裂将其中大肠杆菌多肽组分切除掉。融合蛋白的位点专一性断裂方法有两种。方法
50、有两种。化学断裂法：最佳试剂为溴化氰，作用于甲硫氨酸侧链进行硫醚基反应，化学断裂法：最佳试剂为溴化氰，作用于甲硫氨酸侧链进行硫醚基反应，后水解断裂。后水解断裂。蛋白质酶法：每种蛋白酶均具有相应的断裂位点决定簇。蛋白质酶法：每种蛋白酶均具有相应的断裂位点决定簇。试剂试剂识别位点识别位点酶酶识别位点识别位点溴化氰溴化氰Met-XXa因子因子Ile-Glu-Gly-Arg-X甲酸甲酸Asp-Pro凝血酶凝血酶Gly-Pro-Arg-X羟胺羟胺Asn-Gly胰蛋白酶胰蛋白酶Arg-X枯草蛋白酶枯草蛋白酶Gly-Ala-His-Arg-X第七十五页，讲稿共一百三十三页哦第二节第二节 外源基因在原核细胞中