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1、食品微生物学第六章第1页，此课件共114页哦传统食品微生物检测传统食品微生物检测：以分离、纯化、培养为：以分离、纯化、培养为 基础基础现代食品微生物检测现代食品微生物检测：新理论、新技术新理论、新技术遗传学特性、细胞组分、数值分类遗传学特性、细胞组分、数值分类 快速、灵敏、特异快速、灵敏、特异第2页，此课件共114页哦第一节第一节 食品中微生物数量的检测食品中微生物数量的检测方法方法检测食品中微生物总数的方法：检测食品中微生物总数的方法：1）活细胞的标准平板计数法）活细胞的标准平板计数法 （Standard plate count,SPC）2）最近似数测定法）最近似数测定法 （most pro
2、bable number,MPN）第3页，此课件共114页哦检测食品中检测食品中微生物总数微生物总数的方法：的方法：3）染色还原技术估算具有还原能力的）染色还原技术估算具有还原能力的 各种细胞的总数各种细胞的总数4）显微镜直接计数法（）显微镜直接计数法（DMC）第4页，此课件共114页哦一、一、传统的传统的SPC方法方法活细胞的标准平板计数法活细胞的标准平板计数法（Standard plate count,SPC）菌落总数计数法菌落总数计数法 “活菌活菌”标准方法标准方法意义：意义：判定食品被微生物污染的程度及卫生质判定食品被微生物污染的程度及卫生质量，也可观察微生物在食品中生长繁殖的动态。量
3、，也可观察微生物在食品中生长繁殖的动态。第5页，此课件共114页哦菌落总数：菌落总数：在一定条件下（需氧、温度、时在一定条件下（需氧、温度、时间、间、pH)每克（每毫升）食品检每克（每毫升）食品检验所生长出来的验所生长出来的CFU（菌落形成单（菌落形成单位）位）。第6页，此课件共114页哦国标规定：国标规定：在在需氧条件下：需氧条件下：细菌细菌 NA 37 48h 霉菌霉菌 酵母酵母 PDA 2528 5天天第7页，此课件共114页哦测定方法测定方法 检测样品的处理检测样品的处理 稀释稀释 倾注（涂布）琼脂平板倾注（涂布）琼脂平板 计数计数 报告报告第8页，此课件共114页哦（一）样品采集（一
4、）样品采集1、采样原则：采样原则：代表性代表性 防止污染防止污染2、采样的种类：、采样的种类：大样大样 一整批样品一整批样品 中样中样 200g 小样小样 分析的样品（检样）分析的样品（检样）25g第9页，此课件共114页哦3、采样方法：、采样方法：无菌操作无菌操作 采样用具必须无菌采样用具必须无菌 尽量采集有包装的食品尽量采集有包装的食品 粉末状样品粉末状样品 边取样边混合边取样边混合 液体样品液体样品 边振摇边混合边振摇边混合 冷冻食品冷冻食品 保持冷冻状态保持冷冻状态 非冷冻食品非冷冻食品 保存在保存在05 第10页，此课件共114页哦4、采样数量和部位：、采样数量和部位：200g/件件
5、 乳制品乳制品 一瓶（个、罐、听）一瓶（个、罐、听）粮粮 三层五点（表、中、下）三层五点（表、中、下）油油 重点采取表层及底层油重点采取表层及底层油5、采样标签：、采样标签：名称名称 来源来源 数量数量 编号编号 时间时间.（二）送检（二）送检 从采样到实验室越快越好从采样到实验室越快越好 不得超过不得超过3h第11页，此课件共114页哦（三）样品的处理和稀（三）样品的处理和稀释释1）取样）取样 无菌操作无菌操作 25g放入放入225mL灭菌生理盐灭菌生理盐水的无菌瓶内（水的无菌瓶内（1：10稀释液）稀释液）2）均匀混合）均匀混合 均质器均质器第12页，此课件共114页哦3）稀释）稀释 4）倾
6、）倾注注1 ml1 ml1 ml1ml9ml9ml9ml9ml1ml1 ml1 ml1ml1ml1ml第13页，此课件共114页哦5）倾注平板）倾注平板 稀释液移入平皿后，将稀释液移入平皿后，将46 的的营养琼脂培养基注入平皿约营养琼脂培养基注入平皿约15mL,转动平皿。转动平皿。空白对照空白对照第14页，此课件共114页哦6）倒置倒置 培养培养 琼脂凝固后，翻转平板琼脂凝固后，翻转平板 细菌细菌 37 48h 霉菌霉菌 2 8 5天天第15页，此课件共114页哦（四）菌落计数（四）菌落计数法法 肉眼观察肉眼观察 放大镜放大镜 TTC（氯化三苯基四氮唑（氯化三苯基四氮唑)显色显色（五）菌落计数
7、的报告（五）菌落计数的报告 报告单位：报告单位：cfu/g(mL)1、平板菌落数的选择：平板菌落数的选择：303002、稀释度的选择：、稀释度的选择：第16页，此课件共114页哦（五）菌落计数的报（五）菌落计数的报告告3、菌落数的报告：、菌落数的报告：100以内时以内时 按实数报告按实数报告 大于大于100时时 两位有效数字两位有效数字 16400 16000第17页，此课件共114页哦涂布平板法涂布平板法 先倒平板先倒平板 待凝固后，吸取待凝固后，吸取0.1ml稀释液于平板表面上，用灭菌涂布稀释液于平板表面上，用灭菌涂布棒在整个平板上均匀涂布，培养棒在整个平板上均匀涂布，培养 观观察。察。第
8、18页，此课件共114页哦涂布法的优缺点涂布法的优缺点可检测到热敏性菌体可检测到热敏性菌体菌落形态比较明显菌落形态比较明显更适合于严格的好氧菌更适合于严格的好氧菌没有倾注法简便，易出现菌落重叠、没有倾注法简便，易出现菌落重叠、混杂现象混杂现象第19页，此课件共114页哦二、旋转接种法二、旋转接种法（Spiral plate method）1970年年 FDA原理：原理：接种针将样品液以螺旋方式从接种针将样品液以螺旋方式从平板中央往外连续接种。平板中央往外连续接种。接种量：接种量：0.05mL第20页，此课件共114页哦优点：优点：可测定可测定50500000cfu/mL的菌数的菌数样品不需事先
9、稀释样品不需事先稀释不需做不需做2个重复个重复接种速度快接种速度快结果可人工计数，也可用激光计数器计数结果可人工计数，也可用激光计数器计数人力与物力花费成本低廉人力与物力花费成本低廉测定结果与传统方法相关性高测定结果与传统方法相关性高第21页，此课件共114页哦缺点：缺点：设备投资较高设备投资较高含颗粒样品容易堵塞管道含颗粒样品容易堵塞管道如果样品的带菌量超出范围则结果准确性降如果样品的带菌量超出范围则结果准确性降低低对琼脂平板表面要求高对琼脂平板表面要求高第22页，此课件共114页哦菌落计数的其它方法菌落计数的其它方法 膜过滤膜过滤 MPN 染色还原计数法染色还原计数法 DMC第23页，此课
10、件共114页哦三、膜过滤三、膜过滤SPC方法的改良方法的改良 过滤膜的孔径过滤膜的孔径 0.45um 收集菌体收集菌体 提高检出率提高检出率 直接显微计数直接显微计数 膜过滤与荧光染色方法结合膜过滤与荧光染色方法结合第24页，此课件共114页哦 直接荧光膜技术计数法（直接荧光膜技术计数法（DEFT）Direct Epifluorescent Filter Technique第25页，此课件共114页哦DEFT微菌落计数微菌落计数 仅用于活细胞的检测仅用于活细胞的检测 原理：原理：食品匀液经食品匀液经DEFT膜过滤，膜放在膜过滤，膜放在培养基表面，恒温培养至微菌落长培养基表面，恒温培养至微菌落长
11、出，显微镜观察出，显微镜观察 G-3h G+6h第26页，此课件共114页哦快速检测技术快速检测技术 特殊滤膜（特殊滤膜（0.5um）过滤样品液）过滤样品液 滤膜经滤膜经 啶橙染色啶橙染色 紫外光显微镜观察紫外光显微镜观察 活细胞活细胞 橙色荧光橙色荧光 死细胞死细胞 绿色荧光绿色荧光 2030min第27页，此课件共114页哦四、最近似数测定法（四、最近似数测定法（MPN）选择选择3个稀释梯度个稀释梯度的稀释液，的稀释液，每种稀释每种稀释液液接种接种3管（管（5管）管）装有培养基的试管中培养，装有培养基的试管中培养，根据实验结果查根据实验结果查MPN检索表检索表，得到样品中微，得到样品中微生
12、物数量。生物数量。第28页，此课件共114页哦 1915年年 McCrady发明发明MPN的优点：的优点：方法相对简单方法相对简单与与SPC相比，相似率较高相比，相似率较高用选择性培养基可检测特殊的微生物用选择性培养基可检测特殊的微生物类群类群测定大肠菌群数量的方法测定大肠菌群数量的方法第29页，此课件共114页哦 MPN的缺点：的缺点：需要大量的玻璃器皿（特别是需要大量的玻璃器皿（特别是5试管试管实验）实验）不能观察微生物菌落的形态不能观察微生物菌落的形态准确性不高准确性不高第30页，此课件共114页哦1、大肠菌群（、大肠菌群（coliform group）领域用语领域用语 与粪便污染有关的
13、细菌与粪便污染有关的细菌 定义：定义：一群需氧及兼性厌氧，在一群需氧及兼性厌氧，在37 经经24h能分能分解乳糖产酸、产气的革兰氏阴性无芽胞杆解乳糖产酸、产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。菌。第31页，此课件共114页哦主要包括：主要包括：l 大肠埃希氏菌属大肠埃希氏菌属 （Escherichia）l 柠檬酸杆菌属柠檬酸杆菌属 （Citrobacter）l 克雷氏菌属克雷氏菌属 （Klebsiella）l 产气肠杆菌属产气肠杆菌属 （Enterobacter）非典型大肠杆菌非典型大肠杆菌典型大肠杆菌典型大肠杆菌第32页，此课件共114页哦 目前，大肠菌群已被我国和许多国家用作目前，大肠菌群已被我国和
14、许多国家用作食品食品质量评价质量评价的指示菌。一般认为，大肠菌群的指示菌。一般认为，大肠菌群都是直接或间接来自人与温血动物的都是直接或间接来自人与温血动物的粪便粪便。第33页，此课件共114页哦2、检测大肠菌群的意义、检测大肠菌群的意义 粪便污染食品的指示菌粪便污染食品的指示菌 大肠菌群数的高低，表明粪便污染的程度大肠菌群数的高低，表明粪便污染的程度和对人体健康危害性的大小和对人体健康危害性的大小 肠道致病菌污染食品的指示菌肠道致病菌污染食品的指示菌 大肠菌群数的高低，表明肠道致病菌存在的大肠菌群数的高低，表明肠道致病菌存在的可能性大小（并非一定平行！）可能性大小（并非一定平行！）第34页，此
15、课件共114页哦3、大肠菌群检测方法与检验结果、大肠菌群检测方法与检验结果 检验结果检验结果：用每用每100mL（g）样品中）样品中 大肠菌群最近似数来表示，大肠菌群最近似数来表示，简称大肠菌群简称大肠菌群MPN.检测方法：乳糖发酵试验、分离培养、检测方法：乳糖发酵试验、分离培养、证实试验证实试验 见见GB4789.3-1994第35页，此课件共114页哦五、染色还原计数法五、染色还原计数法一种估计一种估计活性微生物活性微生物数量的方法。数量的方法。原理：原理：活细胞内含有还原酶，可把特定的活细胞内含有还原酶，可把特定的染料从一种颜色还原为另外一种颜色。染料从一种颜色还原为另外一种颜色。第36
16、页，此课件共114页哦亚甲基蓝（兰色）亚甲基蓝（兰色）白色白色刃天青（暗兰色）刃天青（暗兰色）粉红色或粉红色或 白色白色染色还原的时间与样品中微生物浓度染色还原的时间与样品中微生物浓度成成反比反比两种染料：两种染料：第37页，此课件共114页哦应用：应用：乳品工业上原料乳中的微生物检测乳品工业上原料乳中的微生物检测优点：优点：简便、快捷和经济简便、快捷和经济缺点：缺点：不同的微生物还原能力不同，给估算带来不同的微生物还原能力不同，给估算带来了一定的困难。了一定的困难。不适用于含有还原酶的食品不适用于含有还原酶的食品应用及优、缺点应用及优、缺点第38页，此课件共114页哦六、显微直接计数法六、显
17、微直接计数法（Direct microscope count,DMC）一定量的食品（一定量的食品（0.001mL）显微镜载玻片（显微镜载玻片（1cm2）烘干、固定、脱脂、染色烘干、固定、脱脂、染色复式显微镜计数复式显微镜计数 换算换算第39页，此课件共114页哦DMC方法的优方法的优点点 快捷快捷、简便、简便 能对细胞形态进行分析能对细胞形态进行分析 载玻片易保存，作参考载玻片易保存，作参考可使用荧光技术增强效果可使用荧光技术增强效果第40页，此课件共114页哦DMC方法的缺点方法的缺点 仅适于检含大量菌体的样品仅适于检含大量菌体的样品 准确性差准确性差 易造成操作人员的疲劳易造成操作人员的疲
18、劳第41页，此课件共114页哦七、棉拭子涂抹法七、棉拭子涂抹法 表层微生物的检测表层微生物的检测 应用于食品、应用于食品、公共场所公共场所第42页，此课件共114页哦方法：方法：1）无菌棉拭子蘸取灭菌生理盐水）无菌棉拭子蘸取灭菌生理盐水（10mL试管）均匀涂抹样品表面一定试管）均匀涂抹样品表面一定面积（面积（5cmX5cm，1cmX1cm）后，）后，放回试管中，及时送检；放回试管中，及时送检；第43页，此课件共114页哦2）试管振荡，使微生物悬浮于稀释液）试管振荡，使微生物悬浮于稀释液中；中；3）按）按SPC方法进行梯度稀释、培养、计方法进行梯度稀释、培养、计数。数。此外，纸片法此外，纸片法第
19、44页，此课件共114页哦第二节第二节 物理、化学、分子和免疫物理、化学、分子和免疫方法方法第45页，此课件共114页哦一、物理方法一、物理方法 阻抗测定法阻抗测定法 微量量热法微量量热法第46页，此课件共114页哦（一）阻抗测定法（一）阻抗测定法（impedance）1899年年 G.N,Stewart 估算估算 20世纪世纪70年代应用年代应用 阻抗：交流电路中导电物质对电流所阻抗：交流电路中导电物质对电流所起的阻碍和抵抗作用，可由电导和电容起的阻碍和抵抗作用，可由电导和电容计算。计算。第47页，此课件共114页哦原理：原理：微生物可使培养基中电惰性底物，如碳水微生物可使培养基中电惰性底物
20、，如碳水化合物、蛋白质等营养物质代谢成为电活性化合物、蛋白质等营养物质代谢成为电活性产物（乳酸盐或氨等）当微生物生长繁殖时，产物（乳酸盐或氨等）当微生物生长繁殖时，培养基中的电惰性分子即为许多电活性分子培养基中的电惰性分子即为许多电活性分子所取代，从而使培养基的电导性增大，培养所取代，从而使培养基的电导性增大，培养基的阻抗降低。基的阻抗降低。第48页，此课件共114页哦检测时间（检测时间（detection time)样品接种后从开始培养到阻抗值发生样品接种后从开始培养到阻抗值发生急剧变化的时间。急剧变化的时间。与原始菌数成反比与原始菌数成反比 Bactomer细菌计数器细菌计数器 准确率准确
21、率 93%10100个个 5h第49页，此课件共114页哦（二）微量量热法（二）微量量热法 （Microcalorimetry）细菌生长时产生热量细菌生长时产生热量测定微小温度变化的仪器测定微小温度变化的仪器量热计量热计 批次型：早期应用批次型：早期应用 流动型：流动型：灵敏、快速灵敏、快速第50页，此课件共114页哦二、化学方法二、化学方法（一）热稳定性核酸酶（一）热稳定性核酸酶（DNAse）S.aureus G（+）凝固酶（凝固酶（+）产肠毒素菌株产肠毒素菌株 95%产热稳定性核酸酶产热稳定性核酸酶 耐高温耐高温第51页，此课件共114页哦原理：原理：检测食品中热稳定性核酸酶的含检测食品中
22、热稳定性核酸酶的含量，可以精确计算出金黄色葡萄球菌量，可以精确计算出金黄色葡萄球菌的数量。的数量。第52页，此课件共114页哦 分光光度法分光光度法 热稳定性核酸酶是热稳定性核酸酶是S.aureus生长的标志生长的标志 凝固酵素是产肠毒素菌株的标志凝固酵素是产肠毒素菌株的标志第53页，此课件共114页哦（二）（二）ATP的测的测定定生命体的主要能源细胞中ATP含量恒定ATP测定计数法的原理测定计数法的原理 根据ATP可与从荧火虫中提取的荧光素酶作用发光，发光的总光量与ATP的量成正比。第54页，此课件共114页哦 光强度推算出细菌细胞数光强度推算出细菌细胞数 液体发光分光计液体发光分光计 照度
23、计照度计 结果与结果与SPC法一致法一致 1025min 第55页，此课件共114页哦ATP检测法的应检测法的应用：用：检测微生物数量的快速方法检测微生物数量的快速方法 医学：医学：尿样的检验尿样的检验环境卫生：表面微生物的测定环境卫生：表面微生物的测定第56页，此课件共114页哦（三）辐射测量法（三）辐射测量法（Radiometric）原理原理 利用细菌在代谢碳水化合物时产生利用细菌在代谢碳水化合物时产生CO2 2的原理，把微量元素标记到葡萄的原理，把微量元素标记到葡萄糖或其他糖类分子中。糖或其他糖类分子中。放射能计数器放射能计数器第57页，此课件共114页哦放射物的种类放射物的种类 C-1
24、4葡萄糖葡萄糖 C-14甲酸盐甲酸盐 C14-谷氨酸盐谷氨酸盐放射量与菌数成正比放射量与菌数成正比 检测检测C-14所需的时间与食品中微生物所需的时间与食品中微生物的含量成反比。的含量成反比。第58页，此课件共114页哦应用应用 医学：医学：“吹口气，查胃病吹口气，查胃病”30min 食品：食品：微生物含量高微生物含量高 56h 微生物含量低微生物含量低 更厂更厂第59页，此课件共114页哦三、食品微生物的指纹识别和鉴三、食品微生物的指纹识别和鉴定定“指纹指纹”概念概念 由于每种微生物的化学组分由于每种微生物的化学组分（DNA、蛋白质）结构、性能有差别及、蛋白质）结构、性能有差别及其特异性代谢
25、产物等通过分析技术出现其特异性代谢产物等通过分析技术出现的特征性的图谱的特征性的图谱第60页，此课件共114页哦（一）血清学方（一）血清学方法法特殊的抗体鉴定同源抗原特殊的抗体鉴定同源抗原 G-菌体（菌体（O）抗原）抗原 鞭毛（鞭毛（H）抗原）抗原热稳定性好热稳定性好 热稳定性差热稳定性差第61页，此课件共114页哦抗原（抗原（Antigen，Ag）Antigens are macromolecules that elicit an immune response in the body.Antigens can be proteins polysaccharides conjugates o
26、f lipids with proteins(lipoproteins)and polysaccharides(glycolipids).第62页，此课件共114页哦Antibodies are immune system-related proteins called immunoglobulins（Ig）.Each antibody consists of four polypeptides two heavy chains and two light chains joined to form a Y shaped molecule.抗体（抗体（Antibody，Ab）第63页，此课件共
27、114页哦（二）噬菌体（二）噬菌体（phage）类型类型原理：原理：根据噬菌体和它的宿主细菌之间的根据噬菌体和它的宿主细菌之间的特殊关系，用已知的噬菌体鉴定其特特殊关系，用已知的噬菌体鉴定其特定的宿主细菌。定的宿主细菌。第64页，此课件共114页哦（三）分子生物学方（三）分子生物学方法法 基因探针技术基因探针技术 DNA扩增法扩增法 限制性片段长度多态性技术限制性片段长度多态性技术 脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳第65页，此课件共114页哦1.基因探针技术基因探针技术探针（探针（Probe）：经过）：经过标记标记的一段的一段短核苷酸短核苷酸，用于检测与之，用于检测与之同源同源的核的核苷酸序列。苷
28、酸序列。Probe is a short labelled nucleotide used to detect homologous nucleotide sequence.第66页，此课件共114页哦Length of probe：20-1000bpType of probe：Oligonucleotide probes（20-40 bp）Single stranded DNA probes（200-500 bp）Double stranded DNA probes RNA probes or Riboprobes第67页，此课件共114页哦 Radioactive：32P、35S、3H、1
29、4CDigoxigenin（Dig）BiotinFluorescent dyeChoice of Labelling：Non-radioactive：第68页，此课件共114页哦 可检测的细胞数量：可检测的细胞数量：10106 6-10107 7 必须进行细胞富集必须进行细胞富集！探针检测的灵敏度与检测时间探针检测的灵敏度与检测时间细胞数量为细胞数量为 10108 8，检测需要，检测需要10-12h第69页，此课件共114页哦 2.DNA扩增法扩增法（1）多聚酶链反应）多聚酶链反应 Polymerase Chain Reaction，PCR 1985年，美国年，美国PE-Cetus 公司人类遗
30、传公司人类遗传学研究室的学研究室的Kary Mullis 发明发明 1993年，年，Mullis 获得诺贝尔获得诺贝尔化学奖化学奖第70页，此课件共114页哦第71页，此课件共114页哦三步曲：三步曲：变性（变性（DenaturationDenaturation）退火（退火（AnneallingAnnealling）延伸（延伸（ExtensionExtension）一个循环一个循环（cyclecycle）一般进行一般进行25-30个循环个循环PCRPCR反应的三步曲与五要素反应的三步曲与五要素 第72页，此课件共114页哦S St te ep p 1 1：双双 链链D DN NA A热热 变变
31、性（性（9494）；）；S St te ep p 2 2：引引物物与与模模板板单单链链D DN NA A退退 火火（5 55 5）；S St te ep p 3 3：D DN NA A的的聚聚合合延延伸反应（伸反应（7272）；）；S St te ep p 4 4：扩扩增增的的双双链链D DN NA A再再 次次 热热 变变 性性（返返 回回Step 1Step 1）。）。第73页，此课件共114页哦五要素：五要素：模板模板DNADNA（template）引物引物（Primer）DNADNA聚合酶聚合酶（Polymerase）缓冲液缓冲液（Buffer，Mg+）脱氧核糖核苷三磷酸脱氧核糖核苷三
32、磷酸（dNTPs）第74页，此课件共114页哦第75页，此课件共114页哦循环次数与产物的量循环次数与产物的量实际：实际：Nf=N0（1+Y）N其中其中Y Y为扩增效率为扩增效率理论：理论：Nf=N0 X 2 N 其中其中N为循环次数，为循环次数，N0为起始拷贝数，为起始拷贝数，Nf为最终拷贝数为最终拷贝数第76页，此课件共114页哦Denaturing94 oCTemperature100055T i m e5335第77页，此课件共114页哦PCRDenaturing94 oCTemperature100055T i m e3553Heat第78页，此课件共114页哦Denaturing9
33、4 oCAnnealingPrimers55 oCExtension72 oCTemperature100055T i m e355355Denaturing94 oC第79页，此课件共114页哦Denaturing94 oCDenaturingng94 oCAnnealingPrimers55 oCExtension72 oCTemperature100055T i m e30 x3553HeatHeat555第80页，此课件共114页哦Denaturing94 oCDenaturing94 oCAnnealingPrimers55 oCExtension72 oCTemperature10
34、0055T i m e30 x3553555555第81页，此课件共114页哦（2）随机扩增的多态性）随机扩增的多态性DNA Random Amplified Polymorphic DNA（RAPD）Developed by Williams et al.(1990)using 10 base primers to generate random fragments from template DNAsRAPD fragments can be separated and used as genetic markers or a kind of DNA fingerprint第82页，此课件
35、共114页哦 Two related techniques:1.Arbitrary Primed PCR(AP-PCR)Welsh and McClelland(1990)longer primers(18-25 bases)2.DNA Amplification Fingerprinting(DAF)Caetano-Anolles et al.(1991)very short primers(8 bases)第83页，此课件共114页哦Components of PCR and RAPD RAPD1.Buffer(Mg+)usually high Mg+concentration2.Temp
36、late DNA3.1 short primer(10 bases)anneals to any specific part of the template DNA4.dNTPs5.Taq PCR1.1.Buffer(MgBuffer(Mg+)2.2.Template DNATemplate DNA3.3.2 Primers that flank 2 Primers that flank the fragment of DNA the fragment of DNA to be amplifiedto be amplified4.4.dNTPsdNTPs5 5.Taq.Taq第84页，此课件共
37、114页哦lTwo modifications made to typical thermal cycling when RAPD is being done:1.Annealing temperatures are generally very low,around 36 C-This allows very short primers to anneal to template DNA2.More thermal cycles are used,typically 45-This compensates for the inefficiency which results from usi
38、ng such short primers.第85页，此课件共114页哦Template DNAlPrimer binds to many locations on the template DNAlOnly when primer binding sites are close and oriented in opposite direction so the primers point toward each other will amplification take placeRAPD第86页，此课件共114页哦Template DNAPrimers point away from ea
39、ch other,so amplification wont happenRAPD第87页，此课件共114页哦Template DNAPrimers point in the same direction,so amplification wont happenRAPD第88页，此课件共114页哦Template DNAPrimers too far apart,so amplification wont happen 2,000 basesRAPD第89页，此课件共114页哦Template DNAPrimers are just the right distance apart,so fr
40、agment is amplified100-1,500 basesRAPD第90页，此课件共114页哦3.限制性片段长度多态性技术限制性片段长度多态性技术（RFLP）Restriction Fragment Length Polymorphism（1）限制性内切酶(Restriction endonuclease）保护细菌不受外来保护细菌不受外来DNA侵入侵入来自细菌的一种内切酶来自细菌的一种内切酶第91页，此课件共114页哦限制性内切酶的特点：识别识别4-8 bp特定序列特定序列(site specific)两股两股DNA上各上各产产生一生一个个切口切口回回文序列文序列(palindrom
41、e sequence)5-GTTACATGA GATC ACGGATTC-33-CAATGTACT CTAG TGCCTAAG-5第92页，此课件共114页哦产生粘性末端产生粘性末端(cohesive end,sticky end)5-GTTACATGAG3-CAATGTACTCTTAAEcoR I5-TTACATGC3-AATGTACG GCMsp IAATT CACGGATTC-3 GTGCCTAAG-5CG GACGGAT-3 CTGCCTA-55-GTTACATGAG3-CAATGTACTCTTAAAATT CACGGATTC 3 GTGCCTAAG-55-TTACATGC3-AATG
42、TACG GCCG GACGGAT-3 CTGCCTA-5第93页，此课件共114页哦5-ACGGATTCGTT3-TGCCTAAGCAAHpa I5-AACTGTCGG3-TTGACAGCCHae IIIAACGTTACATGA 3TTGCAATGTACT 5CCAGGCTG-3GGTCCGAC-5产生平末端产生平末端(blunt end)5-ACGGATTCGTT3-TGCCTAAGCAAAACGTTACATGA 3TTGCAATGTACT 55-AACTGTCGG3-TTGACAGCCCCAGGCTG-3GGTCCGAC-5第94页，此课件共114页哦（3）限制性片段长度多态性(RFLP
43、）第95页，此课件共114页哦四、免疫学方四、免疫学方法法精确性精确性(Accurate)灵敏性灵敏性(Sensitive)特异性特异性(Specific)第96页，此课件共114页哦（一）荧光抗体法（一）荧光抗体法（FA）（Fluorescence antibody）1942年创立，在食品和医学微生物中应用广年创立，在食品和医学微生物中应用广泛。泛。原理：抗体与荧光物质结合而带有荧光，与原理：抗体与荧光物质结合而带有荧光，与相应抗原结合后，在荧光显微镜下可以观察，相应抗原结合后，在荧光显微镜下可以观察，也可计数。也可计数。第97页，此课件共114页哦荧光素：荧光素：异硫氰酸荧光素（异硫氰酸荧
44、光素（FITC）若丹名若丹名B（Rhodamine B）第98页，此课件共114页哦（二）沙门氏菌（二）沙门氏菌1-2实验（实验（1-2 Test）原理：原理：血清学原理血清学原理,即抗原抗体结合形成即抗原抗体结合形成肉眼可见的免疫带。肉眼可见的免疫带。一种检测有动力的沙门氏菌的方法一种检测有动力的沙门氏菌的方法第99页，此课件共114页哦 在一个特殊的含两个容器的塑料设备中进在一个特殊的含两个容器的塑料设备中进行：行：一个容器中装有一个容器中装有选择性液体选择性液体培养基，另一培养基，另一个中装有个中装有非选择性运动性非选择性运动性培养基（半固培养基（半固体），并含有体），并含有鞭毛抗体鞭毛
45、抗体。恒温培养时，运动性沙门氏菌经选择性恒温培养时，运动性沙门氏菌经选择性培养后进入非选择性培养基，并与其中培养后进入非选择性培养基，并与其中的抗体结合形成免疫带。的抗体结合形成免疫带。第100页，此课件共114页哦优点：将血清学反应和生化增菌过程结优点：将血清学反应和生化增菌过程结 合起来，特异性强；合起来，特异性强；不需特殊实验室条件，简便不需特殊实验室条件，简便；8-14小时内得出结果，快速小时内得出结果，快速。缺点：不能检测非运动型沙门氏菌，缺点：不能检测非运动型沙门氏菌，免疫条带的判断有主观因素。免疫条带的判断有主观因素。第101页，此课件共114页哦（三）（三）酶联免疫吸附剂测定酶
46、联免疫吸附剂测定 Enzyme Linked Immunosorbent Assay1971年年Engvall和和Perlmann（ELISA）can measure antibodies or antigens inexpensive,rapid,quantitative,specific sensitive(pg/ml)expensive equipment not required can be automated第102页，此课件共114页哦 ELISA ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体结合在固相载
47、体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。性，又保留酶的活性。原理：原理：第103页，此课件共114页哦待测样品与固相载体表面的抗原或抗体起反应，待测样品与固相载体表面的抗原或抗体起反应，加入酶标记的抗原或抗体也结合在固相载体上。加入酶标记的抗原或抗体也结合在固相载体上。此时此时固相上的酶量与样品中受检物质的量呈一定固相上的酶量与样品中受检物质的量呈一定的比例的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成有色产物，成有色产物，产物的量与样品中受检
48、物质的量产物的量与样品中受检物质的量直接相关直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。分析。第104页，此课件共114页哦 ELISA可用于测定抗原或抗体。测定中有三可用于测定抗原或抗体。测定中有三个必要的试剂：个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即）固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂免疫吸附剂”（immunosorbent）；）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物结合物”（conjugate）；）；（3）酶反应的底物（）酶反应的底物（substrate）。）。第105页，此课件共114页哦固相载体固相载体 固相载体作为吸附
49、剂和容器，不参与化固相载体作为吸附剂和容器，不参与化学反应。最常用的是学反应。最常用的是聚苯乙烯聚苯乙烯，具较强的吸，具较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性，且价格低廉，上后仍保留原来的免疫学活性，且价格低廉，故被普遍采用。故被普遍采用。第106页，此课件共114页哦载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板最常用，和小试管。以微量滴定板最常用，称为称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为板，国际上标准的微量滴定板为812的的96孔式。孔式。第107页，此课件共1
50、14页哦ELISA常用的酶：常用的酶：辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase,HRP）碱性磷酸酶碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）第108页，此课件共114页哦应用：应用：1）沙门氏菌的检测）沙门氏菌的检测2）金黄色葡萄球菌及其内毒素检测）金黄色葡萄球菌及其内毒素检测3）霉菌和真菌毒素的检测）霉菌和真菌毒素的检测4）大肠杆菌内毒素的检测）大肠杆菌内毒素的检测第109页，此课件共114页哦（四）鲎试剂测定法（四）鲎试剂测定法 Limulus Amoebotyte lysate method 目前最灵敏的测定目前最灵敏的测定G-菌细胞