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1、关于革兰氏染色和抗酸染色法第1页，此课件共23页哦革兰染色法革兰染色法 革兰氏染色法是革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学年由丹麦病理学家汉斯家汉斯克里斯蒂安克里斯蒂安革兰革兰（Hans Christain Gran）创立的。）创立的。第2页，此课件共23页哦实验目的和要求实验目的和要求1.掌握革兰氏染色方法的操作步骤及注意掌握革兰氏染色方法的操作步骤及注意事项。事项。2.了解革兰氏染色的临床意义。了解革兰氏染色的临床意义。第3页，此课件共23页哦一、实验原理一、实验原理二、实验器材二、实验器材三、操作步骤三、操作步骤四、注意事项四、注意事项五、革兰染色的临床意义五、革兰染色的临床意义第4页，
2、此课件共23页哦（一）基本步骤：（一）基本步骤：1、初染：草酸胺结晶紫染色、初染：草酸胺结晶紫染色 2、媒染：碘液媒染、媒染：碘液媒染 3、脱色：乙醇脱色、脱色：乙醇脱色 4、复染：石炭酸复红复染、复染：石炭酸复红复染一、实验原理一、实验原理第5页，此课件共23页哦细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。们细胞壁的成分和结构不同而造成的。初染后，所有细菌都被染成初染剂的蓝初染后，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫晶紫碘的复合物，增强染料与细菌的碘的复合物，增
3、强染料与细菌的结合力。结合力。（二）原理：（二）原理：第6页，此课件共23页哦当用脱色剂处理时，当用脱色剂处理时，G+菌菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫透性降低，从而使结晶紫碘的复合物不易被洗脱而碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。色。G-菌菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂质则不同，由于其
4、细胞壁肽聚糖层较薄、类脂质含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫细胞壁透性增大，使结晶紫碘的复合物比较容易被碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。色。第7页，此课件共23页哦细胞保留细胞保留初染剂蓝紫色初染剂蓝紫色的细菌为的细菌为G+菌；菌；细胞中初染剂被脱色剂洗脱而染上细胞中初染剂被脱色剂洗脱而染上复染剂的颜色（红色）复染剂的颜色（红色）的细菌为的细菌为G-菌。菌。G-G+第8页，此课件共23页哦二、实验器材二、实验器材 大肠杆菌，金黄色葡萄
5、球菌，革兰氏大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，革兰氏染色液，生理盐水，载玻片，接种环，显染色液，生理盐水，载玻片，接种环，显微镜等。微镜等。第9页，此课件共23页哦三、操作步骤三、操作步骤第10页，此课件共23页哦 1 1、涂片：、涂片：将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别涂将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别涂片、干燥、固定。片、干燥、固定。2 2、染色：、染色：（1 1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗洗 （2 2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖一分钟，）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖一分钟，水洗水洗 （3 3）脱色：将水甩净，并衬以白背景，用）脱色：将水甩净，
6、并衬以白背景，用95%95%乙乙醇滴洗至刚刚无紫色为止，约醇滴洗至刚刚无紫色为止，约20302030秒，立即用水冲净秒，立即用水冲净乙醇乙醇 （4 4）复染：用番红液染）复染：用番红液染1-21-2分钟，水洗分钟，水洗 3 3、镜检：、镜检：干燥后，油镜观察。以分散开的细菌颜干燥后，油镜观察。以分散开的细菌颜色为准，革兰氏阳性菌呈色为准，革兰氏阳性菌呈紫色紫色，革兰氏阴性菌呈，革兰氏阴性菌呈红色红色。第11页，此课件共23页哦四、注意事项四、注意事项第12页，此课件共23页哦 1、注意涂片不宜过于浓厚。、注意涂片不宜过于浓厚。2、火焰固定温度要适宜。、火焰固定温度要适宜。3、革兰氏染色成败的关
7、键是酒精脱色。如脱色过度，、革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。以严格规定。4、染色过程中应吸去玻片上的残水，以免染色液被、染色过程中应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。稀释而影响染色效果。5、选择幼龄的细菌。、选择幼龄的细菌。G+菌培养菌培养12-16h，E.coli培养培
8、养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使G+菌转呈阴菌转呈阴性反应。性反应。第13页，此课件共23页哦五、革兰染色的临床意义五、革兰染色的临床意义1.对细菌的鉴别有重要意义对细菌的鉴别有重要意义2.指导临床选择用药指导临床选择用药3.研究细菌与致病性的关系研究细菌与致病性的关系第14页，此课件共23页哦思考题：思考题：当你对一株未知菌进行革兰染色时，当你对一株未知菌进行革兰染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？果可靠？第15页，此课件共23页哦抗酸染色法抗酸染色法第16页，此课件共23页哦【原理原理】结核杆菌
9、对苯胺染料不易着色，若加温或结核杆菌对苯胺染料不易着色，若加温或延长染色时间使其着色后，再用延长染色时间使其着色后，再用3%盐酸酒盐酸酒精处理也不易脱色，再经美兰复染，结核精处理也不易脱色，再经美兰复染，结核杆菌及其它分枝杆菌仍呈红色，而非抗酸杆菌及其它分枝杆菌仍呈红色，而非抗酸菌和细胞杂质等呈蓝色。菌和细胞杂质等呈蓝色。第17页，此课件共23页哦【材料材料】结核病人的咳痰液：采取清晨第一口粘结核病人的咳痰液：采取清晨第一口粘痰，或浓缩集落菌法处理过的痰标本。痰，或浓缩集落菌法处理过的痰标本。石炭酸复红染色液，石炭酸复红染色液，3%盐酸酒精，碱性盐酸酒精，碱性美蓝染液美蓝染液生理盐水生理盐水载
10、物玻片，滤纸片、接种环、玻片夹、载物玻片，滤纸片、接种环、玻片夹、酒精灯、蜡笔等酒精灯、蜡笔等 第18页，此课件共23页哦【方法方法】1涂膜涂膜 痰的涂片：用灭菌的接种环采取痰中干酪痰的涂片：用灭菌的接种环采取痰中干酪坏死的小块或带血的痰液，在载玻片上涂坏死的小块或带血的痰液，在载玻片上涂成薄而均匀的膜（在烧接种环时为防止痰成薄而均匀的膜（在烧接种环时为防止痰中的细菌溅出，可先将接种环在内焰烧干，中的细菌溅出，可先将接种环在内焰烧干，然后再于外焰中灭菌）。然后再于外焰中灭菌）。第19页，此课件共23页哦2染色染色 （1）在已固定好的涂片上放置滤纸片（滤纸的作用是滤去染液）在已固定好的涂片上放置
11、滤纸片（滤纸的作用是滤去染液中的沉渣，使标本清晰），滴加石炭酸变红染色液于滤纸片上（应滴中的沉渣，使标本清晰），滴加石炭酸变红染色液于滤纸片上（应滴满滤纸片）。满滤纸片）。（2）将加有染液的涂片加温，在火焰上保持一定的高度，直）将加有染液的涂片加温，在火焰上保持一定的高度，直到出现蒸汽（不得沸腾）如此反复到出现蒸汽（不得沸腾）如此反复23次（约次（约5分钟）。在加温分钟）。在加温过程中防止将染液烘干（应及时添加染液）。过程中防止将染液烘干（应及时添加染液）。（3）去掉滤纸片，使涂片冷却，水洗。）去掉滤纸片，使涂片冷却，水洗。（4）用）用3%盐酸酒精脱色，直到流下的脱色剂无色为止，水盐酸酒精脱色
12、，直到流下的脱色剂无色为止，水洗。洗。（5）用碱性美蓝染液复染）用碱性美蓝染液复染30秒，水洗、干燥、镜检。秒，水洗、干燥、镜检。第20页，此课件共23页哦【结果观察结果观察】1.结核杆菌染成红色，细长，直的或为微弯结核杆菌染成红色，细长，直的或为微弯曲，有的可表现出分枝特征，偶而有着色曲，有的可表现出分枝特征，偶而有着色不匀，成颗粒状者。亦可以见到有纵行条不匀，成颗粒状者。亦可以见到有纵行条索状排列。标本的其余部分及非抗酸性细索状排列。标本的其余部分及非抗酸性细菌染成蓝色。必须逐一观察各个视野，直菌染成蓝色。必须逐一观察各个视野，直待全部涂片找不到结核杆菌时，才可报告待全部涂片找不到结核杆菌时，才可报告阴性。阴性。第21页，此课件共23页哦2.涂片染色能查到结核杆菌者，一般需要每涂片染色能查到结核杆菌者，一般需要每ml痰液内含菌量至少应有痰液内含菌量至少应有500个以上，甚至个以上，甚至需达到需达到5万以上。故材料多进行浓缩集菌处万以上。故材料多进行浓缩集菌处理，以提高检出阳性率，也造成在染色标理，以提高检出阳性率，也造成在染色标本片观察中，不一定每个视野都能看到结本片观察中，不一定每个视野都能看到结核杆菌。核杆菌。第22页，此课件共23页哦感谢大家观看第23页，此课件共23页哦