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1、关于多糖的分离纯化第1页，讲稿共15张，创作于星期日第2页，讲稿共15张，创作于星期日研究背景实验步骤与结果总结与展望目录第3页，讲稿共15张，创作于星期日研究背景1第4页，讲稿共15张，创作于星期日莼菜莼菜睡莲科，多年生水生草本植物，又名马蹄草，有调节免疫、抗氧化、抗病毒、抗炎、抗菌、降血糖、降血脂等功效，含酸性多糖、多酚、蛋白质、氨基酸、维生素、组胺及微量元素，多糖在莼菜干品中所占的比例最高，主要分布于叶底部、茎周围的黏液质中，是莼菜发挥药效的主要物质基础。第5页，讲稿共15张，创作于星期日方法流程采用碱提醇沉工艺，经除蛋白、除色素得到 莼 菜 多 糖 (BSP)再经DEAE纤维素DE-5
2、2柱Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱对BSP进行分级精制采用高效凝胶过滤色谱(HPGFC)测定BSP各组分的分子量第6页，讲稿共15张，创作于星期日仪器与材料Agilent 1200 HPLC 色谱仪AE240 分析天平UV-2102PC 紫外可见分光光度计 FD-1C-55 冻干机旋转蒸发仪超滤仪DZG-6020 减压干燥箱 莼菜嫩叶；无水乙醇；NaOH；盐酸；木瓜蛋白酶；聚酰胺树脂；DEAE 纤维素 DE-52；琼脂糖凝胶 Sepharose CL-6B；透析袋；蒽酮、硫酸；纯化水第7页，讲稿共15张，创作于星期日粗多糖的提取莼菜粗多糖 加40倍 0.3 mol/L NaOH 溶
3、液，70 加热搅拌提取 2 h，加盐酸中和，过滤，滤液浓缩，加入无水乙醇至 67%，4 静置过夜，4 500 r/min 离心 20 min，80%乙醇洗涤 3 次，沉淀减压干燥，得 83 g 莼菜粗多糖。除去脂溶性成分 取250g莼菜喷干粉，加无水乙醇2.5 L，60 旋转回流提取2 h，过滤，重复操作 1 次，除去脂溶性成分，滤渣烘干。莼菜喷干粉 新鲜莼菜嫩叶，经清水淋洗、均浆机剪切、喷雾干燥得莼菜喷干粉。第8页，讲稿共15张，创作于星期日粗多糖纯化01020304酶解灭活脱蛋白 粗多糖用 2.5 L 纯化水复溶，加入木瓜蛋白酶，63 酶解 6 h，灭活过滤除去不溶物，滤液进行第2 次酶解
4、灭活脱蛋白。聚酰胺层析 滤液流经预处理的聚酰胺层析柱脱色，滤液与聚酰胺湿填料的体积之比为11，纯化水洗脱，共收集洗脱液 8 L。滤膜过滤浓缩 再用微孔滤膜过滤，滤液用超滤膜超滤浓缩至800mL 后加入无水乙醇至67%，4 静置过夜后离心，80%乙醇洗涤 3 次，减压干燥。得到BSP 获得灰白色胶状莼菜多糖(BSP)22 g，收率为 8.8%。第9页，讲稿共15张，创作于星期日BSP含有量测定010203葡萄糖标准曲线制作 BSP纯度测定精密称取干燥至恒重的BSP 24.72 mg 至 500mL 量瓶，纯化水溶解并定容，摇匀，测定样品吸光度为 0.521，计算可知 BSP的纯度为 61.89%
5、。紫外检测粗多糖经木瓜蛋白酶脱蛋白、聚酰胺脱色素等处理后，紫外全波长扫描显示在 260、280 nm 处其吸光度接近于零，表明已除去蛋白质、核酸等杂质。利用蒽酮硫酸法：以葡萄糖质量浓度为横坐标(X)，吸光度为纵坐标(A)得曲线方程 A=17.294X 0.0076(2=0.9994)。第10页，讲稿共15张，创作于星期日BSP 精制取10 g BSP，200 mL 纯化水充分溶解后过DEDA 纤维素 DE-52 离子交换柱(60 mm 950 mm)，依次用01.0mol/L NaCl 溶液梯度洗脱，分管收集洗脱液，采用“2.2”项下方法，以洗脱管数为横坐标，多糖浓度为纵坐标绘制洗脱曲线。BS
6、P 经 DEAE 纤维素 DE-52 分离后，可得 3 个峰(图 1)，透析(截留分子量 8 000 14 000)、浓缩、冻干各峰组分，得到 BSP-1、BSP-2、BSP-3。第11页，讲稿共15张，创作于星期日BSP 精制对 2 个主要组分 BSP-1、BSP-3 用琼脂糖凝胶柱 Sepharose CL-6B 进一步的分离纯化，用纯化水洗脱，蒽酮-硫酸显色法测定多糖含有量。洗脱曲线(图 2)表明，莼菜精制多糖 BSP-1、BSP-3 组分均一，分别浓缩、冻干。第12页，讲稿共15张，创作于星期日分子量测定 色谱条件:色谱柱 TSK gel G5000PWxl(10)、G4000PWxl
7、(10)、G3000PWxl(7)(7.8 mm 300 mm)串联;保护柱 TSKPWxl Guard column;Agilent 1260 示差折光检测器;流动相为纯化水;体积流量0.4 mL/min;进样量 30L;柱 温30 ;检测器温度 35 ;环境温度 25 。称取葡聚糖对照品、莼菜多糖各组分样品（BSP1、BSP2、BSP3），分别用纯水溶解并配制成2mg/mL的溶液，过 0.22 m微孔滤膜，取续滤液，将图谱数据导入 GPC软件，建立分子量分布标准曲线，得到分子量对数 log MW与洗脱体积 VR的线性回归方程 log MW=10.513 0.2377V(r=0.996 2)，第13页，讲稿共15张，创作于星期日 将莼菜多糖各组分导入 GPC 软件，调用标准曲线，得出莼菜多糖各组分的Mw、Mn 和 D 等，结果见表 1，莼菜多糖的分子量分布为(1.0507 1.5208)106 Da，分子量较大。图 3 显示，高效凝胶渗透色谱图出峰时间单一，可知莼菜多糖各组分均一性良好。第14页，讲稿共15张，创作于星期日2023/4/2感谢大家观看第15页，讲稿共15张，创作于星期日