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1、第七章外源基因的表达第1页，讲稿共49张，创作于星期日第一节第一节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达1.1.原核生物基因表达的特点原核生物基因表达的特点 与真核细胞相比，原核细胞的基因表达有以下特点：与真核细胞相比，原核细胞的基因表达有以下特点：（1 1）原原核核生生物物只只有有一一种种RNARNA聚聚合合酶酶（真真核核细细胞胞有有三三种种）识识别别 原原核核细细胞胞的的启动子，催化所有启动子，催化所有RNARNA的合成。的合成。（2 2）原核生物的基因表达是以操纵子为单位的。）原核生物的基因表达是以操纵子为单位的。（3 3）由由于于原原核核生生物物无无核核膜膜，所所以以转
2、转录录与与翻翻译译是是偶偶联联的的，也也是是连连续续进进行的。行的。（4 4）原原核核基基因因一一般般不不含含有有内内含含子子，在在原原核核细细胞胞中中缺缺乏乏真真核核细细胞胞的转录后加工系统。的转录后加工系统。（5 5）原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对）原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对第2页，讲稿共49张，创作于星期日基因产物的直接控制要慢。基因产物的直接控制要慢。（6 6）在在大大肠肠杆杆菌菌mRNAmRNA的的核核糖糖体体结结合合位位点点上上，含含有有一一个个转转译译起起始始密密码码子子及及16S16S核核糖糖体体RNA RNA 3 3 末末端端碱碱基基互
3、互补补的的序序列列，即即S-DS-D序序列列，而真核基因则缺乏此序列。而真核基因则缺乏此序列。2.2.原核表达系统的注意事项原核表达系统的注意事项 从从上上述述特特点点可可以以看看出出，欲欲将将外外源源基基因因在在原原核核细细胞胞中中表表达达，必必须须考考虑虑表表达达载载体体、外外源源基基因因的的性性质质、原原核核细细胞胞的的启启动动子子和和S-DS-D序序列列、阅阅读读框架及宿主菌调控系统等基本条件，也就是说必须满足以下条件：框架及宿主菌调控系统等基本条件，也就是说必须满足以下条件：（1 1）通通过过表表达达载载体体将将外外源源基基因因导导入入宿宿主主菌菌，并并指指导导宿宿主主菌菌的的酶酶系
4、系统统合成外源蛋白。合成外源蛋白。（2 2）外源基因不能带有内含子，因而必须用）外源基因不能带有内含子，因而必须用cDNAcDNA或化学合成或化学合成第3页，讲稿共49张，创作于星期日的基因，而不能用基因组的基因，而不能用基因组DNADNA。（3 3）必必须须利利用用原原核核细细胞胞的的强强启启动动子子和和S-DS-D序序列列等等调调控控元元件件控控制制外外源源基基的表达。的表达。（4 4）外外源源基基因因与与表表达达载载体体连连接接后后，必必须须形形成成正正确确的的开开放放阅阅读读框框架。架。（5 5）利利用用宿宿主主菌菌的的调调控控系系统统，调调节节外外源源基基因因的的表表达达，防防止止外
5、外源源基基因因的的表达产物对宿主菌的伤害。表达产物对宿主菌的伤害。3.3.原核生物基因表达的调控序列原核生物基因表达的调控序列 只只有有在在了了解解了了原原核核生生物物基基因因表表达达调调控控序序列列的的基基础础上上，才才能能够够构构建建高高效效的的表表达达载载体体，使使外外源源目目的的基基因因在在原原核核细细胞胞中中得得到到高高效效率率、高高水水平地表达。对于原核细胞来讲，基因表达的调控序平地表达。对于原核细胞来讲，基因表达的调控序第4页，讲稿共49张，创作于星期日列主要涉及启动子、列主要涉及启动子、S-DS-D序列、终止子、增强子、衰减子等序列。序列、终止子、增强子、衰减子等序列。（1 1
6、）启动子）启动子 启启动动子子(promoter)(promoter)是是DNADNA链链上上一一段段能能与与RNARNA聚聚合合酶酶结结合合并并能能起起始始mRNAmRNA合合成成的的序序列列，它它是是基基因因表表达达不不可可缺缺少少的的重重要要调调控控序序列列。没没有有启启动动子子，基基因就不能转录。因就不能转录。原原核核生生物物的的启启动动子子是是由由两两段段彼彼此此分分开开且且高高度度保保守守的的核核苷苷酸酸序序列列组成。组成。-35-35区区（TTGACATTGACA）：位位于于转转录录起起始始位位点点上上游游的的-35bp-35bp附附近近，是是RNARNA聚聚合酶初始识别和结合位
7、点。合酶初始识别和结合位点。-10-10区区（PribnowPribnow框框，TATAATTATAAT）：RNARNA聚聚合合酶酶结结合合于于此此处处导导致致DNADNA双双链链形形成单链。成单链。第5页，讲稿共49张，创作于星期日 原原核核表表达达系系统统中中通通常常使使用用的的可可调调控控的的强强启启动动子子有有laclac（乳乳糖糖启启动动子子）、trptrp（色色氨氨酸酸启启动动子子）、PLPL及及PRPR（噬噬菌菌体体左左向向和和右右向向启启动子）、动子）、tactac（乳糖和色氨酸的杂合启动子）等。（乳糖和色氨酸的杂合启动子）等。（2 2）终止子）终止子 在在一一个个基基因因或或
8、一一个个操操纵纵子子的的33端端往往往往有有一一个个特特定定的的核核苷苷酸酸序序列列，它它 有有 终终 止止 转转 录录 的的 功功 能能，这这 一一 段段 DNADNA序序 列列 称称 为为 终终 止止 子子（terminator)terminator)。终终止止子子在在结结构构上上有有一一些些共共同同的的特特点点，即即有有一一段段富富含含A/TA/T的的区区域域和和一一段段富富含含G/CG/C的的区区域域，G/CG/C区区域域具具有有回回文文对对称称结结构，使转录后的构，使转录后的RNARNA具有茎环结构。具有茎环结构。根据转录终止作用类型，终止子可分为两种：依赖于根据转录终止作用类型，终
9、止子可分为两种：依赖于因子的转因子的转录终止子及不依赖于录终止子及不依赖于因子的转录终止子。因子的转录终止子。第6页，讲稿共49张，创作于星期日（3 3）S-DS-D序列序列 S-DS-D序序列列是是位位于于起起始始密密码码子子（AUGAUG）上上游游3 310bp10bp处处的的由由3 39bp9bp组组成成的的序序列列。这这段段序序列列正正好好与与16S 16S rRNA rRNA 33端端序序列列互互补补，是是rRNArRNA的的识识别别和和结结合合位点。位点。S-DS-D序序列列存存在在与与否否及及S-DS-D序序列列与与起起始始密密码码子子之之间间的的距距离离，是是影影响响mRNAm
10、RNA翻翻译成蛋白质的主要因素之一。译成蛋白质的主要因素之一。（4 4）增强子）增强子 增增强强子子（enhancer)enhancer)是是能能够够增增强强启启动动子子转转录录活活性性的的DNADNA顺顺式式作作用用序序列。列。第7页，讲稿共49张，创作于星期日4.4.几种类型的原核表达载体几种类型的原核表达载体 在在原原核核细细胞胞中中表表达达外外源源基基因因时时，由由于于实实验验设设计计的的不不同同，总总的的来来说说可可以以产产生生融融合合型型和和非非融融合合型型表表达达蛋蛋白白。不不与与细细菌菌的的任任何何蛋蛋白白或或多多肽肽融融合合在在一一起起的的表表达达蛋蛋白白称称为为非非融融合合
11、蛋蛋白白。融融合合蛋蛋白白指指蛋蛋白白质质的的N N末末端端由原核由原核DNADNA序列或其它序列或其它DNADNA序列编码，序列编码，C C端由真核端由真核DNADNA的完整序列编码。的完整序列编码。（1 1）非融合型表达蛋白载体）非融合型表达蛋白载体pKK223-3pKK223-3具具有有一一个个强强的的tactac（trp-lactrp-lac）启启动动子子，这这个个启启动动子子是是由由trptrp启启动动子的子的-35-35区、区、lac UV5lac UV5启动子的启动子的-10-10区、操纵基因及区、操纵基因及S-DS-D序列组成。序列组成。紧紧接接着着tactac启启动动子子的的
12、是是一一个个取取自自pUC8pUC8的的多多位位点点接接头头，使使之之很很容容易易把把目目的的基基因定位在启动子和因定位在启动子和S-DS-D序列之后。序列之后。第8页，讲稿共49张，创作于星期日在在多多位位点点下下游游的的一一段段DNADNA序序列列中中，还还包包含含一一个个很很强强的的rrnBrrnB核核糖糖体体RNARNA的转录终止子。的转录终止子。载体的其余部分由载体的其余部分由pBR322pBR322组成。组成。（2 2）分泌型克隆表达载体）分泌型克隆表达载体pIN IIIpIN III系统系统 这个载体系统是由这个载体系统是由pBR322pBR322为基础构建的。为基础构建的。带带
13、有有大大肠肠杆杆菌菌最最强强的的启启动动子子之之一一，即即IppIpp（脂脂蛋蛋白白基基因因）启启动动子子。在在启启动动子子的的下下游游装装有有lac lac UV5UV5的的启启动动子子及及其其操操纵纵基基因因，并并把把laclac阻阻遏遏子子的的基基因因（lac Ilac I）也克隆到这个质粒上。这样目的基因的表达就成为可调节的了。）也克隆到这个质粒上。这样目的基因的表达就成为可调节的了。在在转转录录控控制制的的下下游游再再装装上上人人工工合合成成的的高高效效翻翻译译起起始始序序列列（S-DS-D序序列列及及ATGATG）。）。信号肽序列取自于大肠杆菌中分泌蛋白的基因信号肽序列取自于大肠杆
14、菌中分泌蛋白的基因ompaompa（外膜蛋白基因）。（外膜蛋白基因）。第9页，讲稿共49张，创作于星期日在在编编码码序序列列的的下下游游紧紧接接着着一一段段人人工工合合成成的的多多克克隆隆位位点点片片断断，包包括括三三个个单单一酶切位点，一酶切位点，Eco RIEco RI、Hind IIIHind III、Bam HIBam HI。（3 3）融合蛋白表达载体）融合蛋白表达载体pGEXpGEX系统系统 载载体体的的组组成成成成分分基基本本上上与与其其它它表表达达载载体体相相似似，含含有有启启动动子子tactac及及laclac操纵基因、操纵基因、S-DS-D序列、序列、lacIlacI阻遏蛋白
15、基因等。阻遏蛋白基因等。这这类类载载体体与与其其它它表表达达载载体体不不同同之之处处在在于于S-DS-D序序列列下下游游是是谷谷胱胱甘甘肽肽巯巯基基转转移移酶酶基基因因，而而克克隆隆的的外外源源基基因因则则与与谷谷胱胱甘甘肽肽巯巯基基转转移移酶酶基基因因相相连连。当当进进行行基基因因表表达达时时，表表达达产产物物为为谷谷胱胱甘甘肽肽巯巯基基转转移移酶酶和和目目的的基基因因产产物物的融合蛋白。的融合蛋白。第10页，讲稿共49张，创作于星期日5.5.外源基因在大肠杆菌中的表达部位外源基因在大肠杆菌中的表达部位（1 1）不同表达部位）不同表达部位 克克隆隆在在大大肠肠杆杆菌菌中中的的外外源源基基因因
16、，它它们们的的编编码码产产物物蛋蛋白白质质，有有的的是是在在细细胞胞质质中中表表达达，有有的的是是在在细细胞胞周周质质中中表表达达，还还有有的的则则是是以以分分泌到细胞外的方式表达。泌到细胞外的方式表达。细胞质中表达细胞质中表达 大大肠肠杆杆菌菌细细胞胞质质中中表表达达的的外外源源蛋蛋白白，大大多多是是以以包包含含体体的的形形式式存存在在的的。包包含含体体是是存存在在于于细细胞胞质质中中的的一一种种由由不不溶溶性性蛋蛋白白质质聚聚集集折折叠叠而成的晶体结构。而成的晶体结构。周质中表达周质中表达 周周质质是是指指在在大大肠肠杆杆菌菌一一类类格格兰兰氏氏阴阴性性细细菌菌中中，位位于于内内膜膜和和外
17、外膜膜之之间间的细胞结构部分。周质中表达的蛋白需要在信号肽的引的细胞结构部分。周质中表达的蛋白需要在信号肽的引第11页，讲稿共49张，创作于星期日导下才能穿越内膜，进入细胞周质。导下才能穿越内膜，进入细胞周质。细胞外表达细胞外表达 表达的外源蛋白分泌到胞外培养基中，同样需要信号肽序列的引导。表达的外源蛋白分泌到胞外培养基中，同样需要信号肽序列的引导。（2 2）不同部位表达外源蛋白的优缺点）不同部位表达外源蛋白的优缺点第12页，讲稿共49张，创作于星期日表达部位优点缺点细胞质1、形成包涵体（a）蛋白质易于以高纯度和高浓度的方式分离（b）蛋白质受保护而免受胞内酶的降解作用（c）蛋白质没有活性，因此
18、不会使寄主细胞受伤害2、蛋白质产量高3、表达的质粒载体构建比较简单1、形成包涵体（a）蛋白质折叠了，再折叠的蛋白质可能无法恢复其生物学活性（b）蛋白质的终产量偏低（c）蛋白质生产成本比较昂贵2、还原的环境不利于二硫键的形成3、由于N-末端存在甲硫氨酸，使蛋白质的真实性受到影响4、蛋白质会被降解5、蛋白质种类多，因此纯化比较复杂周质1、由于周质中蛋白种类比较少，因此目标蛋白质的纯化就比较简单2、蛋白质降解的程度不甚严重3、促进了二硫键的形成及蛋白质的折叠作用4、蛋白质的N-末端结构真实1、信号肽并非总是有助于蛋白质的转运2、有可能形成包涵体胞外1、蛋白质的降解作用程度最低2、由于分泌到胞外的蛋白
19、质种类少，因此目标蛋白质容易纯化3、增进了蛋白质的折叠作用4、蛋白质的N-末端结构真实1、在大肠杆菌中表达的外源真核蛋白质，通常是不会分泌到胞外培养基中去的2、由于分泌在胞外培养基中的蛋白质相当稀释，因此目标蛋白质的纯化过程比较复杂表表7.1 7.1 不同部位表达外源蛋白的优缺点不同部位表达外源蛋白的优缺点第13页，讲稿共49张，创作于星期日6.6.影响外源基因表达效率的因素及提高表达水平常用的方法影响外源基因表达效率的因素及提高表达水平常用的方法（1 1）启动子结构对表达效率的影响）启动子结构对表达效率的影响 原原核核生生物物启启动动子子有有两两种种保保守守序序列列，即即-35-35区区的的
20、TTGACATTGACA序序列列和和-10-10区区的的TATAATTATAAT序序列列。研研究究发发现现，启启动动子子的的强强度度与与一一致致序序列列的的相相似似程程度度成成正正比比。进进一一步步的的研研究究表表明明，-35-35和和-10-10区区的的距距离离也也是是一一个个重重要要因因素素。如如果果间间隔隔为为1717个个碱碱基基对对，启启动动子子表表现现很很强强，如如果果大大于于1717个个碱碱基基对对，启启动动子子表表现现较弱。较弱。根根据据这这些些原原理理，AmannAmann等等克克隆隆了了tactac启启动动子子（lac-trplac-trp），促促进进了克隆基因的表达。了克隆
21、基因的表达。（2 2）转译起始序列对表达效率的影响）转译起始序列对表达效率的影响第14页，讲稿共49张，创作于星期日 S-DS-D序序列列的的保保守守性性、S-DS-D序序列列后后面面的的4 4个个碱碱基基成成分分以以及及起起始始密密码码子子AUGAUG左左侧的密码三联体的碱基组成都会影响到外源基因的表达效率。侧的密码三联体的碱基组成都会影响到外源基因的表达效率。如：如：UAAGGAGGUAAGGAGG比比GGAGGGGAGG高高3 36 6倍（表达水平倍（表达水平)SD SD与与AUGAUG间富含间富含ATAT有利于翻译有利于翻译 AUGAUG左左侧侧的的密密码码三三联联体体为为UAUUAU
22、或或CUUCUU时时，转转译译最最为为有有效效；如如果果是是UUCUUC、UCAUCA或或AGGAGG时，转译水平将下降时，转译水平将下降2020倍。倍。（3 3）启动子同克隆基因间的距离对表达效率的影响）启动子同克隆基因间的距离对表达效率的影响 启启动动子子同同克克隆隆基基因因间间的的距距离离对对表表达达效效率率的的影影响响，主主要要是是由由于于mRNAmRNA的的55末端形成不同的二级结构，从而影响末端形成不同的二级结构，从而影响mRNAmRNA的翻译效率。的翻译效率。根据上述原理，要提高克隆基因的表达效率，可采用构建克根据上述原理，要提高克隆基因的表达效率，可采用构建克第15页，讲稿共4
23、9张，创作于星期日隆隆库库的的办办法法。在在库库中中，将将外外源源基基因因分分别别放放置置在在离离启启动动子子远远近近不不同同的的地地方方。转化后，筛选重组克隆，从中筛选出外源基因表达最强的克隆。转化后，筛选重组克隆，从中筛选出外源基因表达最强的克隆。（4 4）转录终止区对克隆基因表达效率的影响）转录终止区对克隆基因表达效率的影响 克克隆隆基基因因的的末末端端是是否否存存在在转转录录终终止止区区也也会会影影响响到到克克隆隆基基因因的的表表达效率。其原因可能为：达效率。其原因可能为：若若干干非非必必须须的的转转录录本本的的合合成成，会会使使细细胞胞消消耗耗巨巨大大的的能能量量用用于于制制造大量非
24、必须的蛋白质。造大量非必须的蛋白质。在在转转录录本本上上有有可可能能出出现现一一些些不不期期望望出出现现的的二二级级结结构构，从从而而降降低低了了转转译译的效率。的效率。偶尔会出现启动子阻塞现象。偶尔会出现启动子阻塞现象。因此，在构建表达载体时，在克隆基因后面安装一个强转录因此，在构建表达载体时，在克隆基因后面安装一个强转录第16页，讲稿共49张，创作于星期日终终止止子子（如如rrnB rrnB 终终止止子子）对对完完全全终终止止转转录录是是必必要要的的，可可以以阻阻止止通通读读，增加基因表达。增加基因表达。（5 5）质粒的拷贝数及稳定性对表达效率的影响）质粒的拷贝数及稳定性对表达效率的影响
25、由由于于细细胞胞中中的的核核糖糖体体数数量量，与与任任何何一一种种mRNAmRNA分分子子数数目目相相比比，都都是是大大大大超超量量的的，因因此此，提提高高克克隆隆基基因因表表达达效效率率的的途途径径之之一一，是是增增加加相相应的应的mRNAmRNA分子数量。为此，须增加质粒的拷贝数及其稳定性。分子数量。为此，须增加质粒的拷贝数及其稳定性。一一般般采采用用松松弛弛型型质质粒粒构构建建外外源源基基因因的的表表达达载载体体，从从而而达达到到增增加加质质粒粒及外源基因拷贝数的目的。及外源基因拷贝数的目的。质质粒粒载载体体中中含含有有分分配配功功能能区区parpar，能能保保证证质质粒粒分分子子在在每
26、每次次细细胞胞周周期期中中都都能能准准确确地地进进行行分分离离，并并均均等等地地分分配配到到子子代代细细胞胞中中去去，从从而而达达到到稳稳定定质质粒粒拷拷贝数的作用。贝数的作用。第17页，讲稿共49张，创作于星期日（6 6）mRNAmRNA的稳定性对表达效率的影响的稳定性对表达效率的影响 原原核核生生物物的的mRNAmRNA分分子子的的降降解解速速度度很很快快，一一般般在在几几秒秒几几分分之之间间。因因此，维持外源基因此，维持外源基因mRNAmRNA的稳定性可提高其表达效率。的稳定性可提高其表达效率。一一般般的的作作法法是是给给外外源源基基因因mRNAmRNA的的55及及33端端安安装装某某些
27、些结结构构序序列列，保保护护mRNAmRNA不不能能被被降降解解。如如：33端端茎茎环环结结构构、转转录录终终止止子子结结构构；E.coli ompAE.coli ompA转录物的转录物的55非翻译部分可作为非翻译部分可作为mRNAmRNA的稳定剂。的稳定剂。（7 7）遗传密码子的使用对表达效率的影响）遗传密码子的使用对表达效率的影响 无无论论是是真真核核基基因因还还是是原原核核基基因因，一一种种特特定定的的氨氨基基酸酸并并不不是是以以等等同同的的频频率率使使用用所所有有的的同同义义密密码码子子，而而是是使使用用其其中中的的某某一一两两种种。我我们们将将这这种种遗遗传传密密码码子子使使用用的的
28、非非随随机机性性现现象象，称称为为密密码码子子使使用用偏偏爱爱性性，简简称密码子偏爱性。称密码子偏爱性。第18页，讲稿共49张，创作于星期日 选选择择和和使使用用大大肠肠杆杆菌菌偏偏爱爱密密码码子子有有利利于于增增加加外外源源基基因因在在大大肠肠杆杆菌菌中的翻译效率，从而提高外源基因的表达效率。中的翻译效率，从而提高外源基因的表达效率。（8 8）寄主细胞的生理状态对基因表达效率的影响）寄主细胞的生理状态对基因表达效率的影响 大大肠肠肝肝菌菌寄寄主主细细胞胞的的生生理理状状态态，会会或或多多或或少少地地影影响响外外源源基基因因的的表表达达效效率率，诸诸如如：培培养养基基营营养养成成分分的的选选择
29、择、细细胞胞培培养养的的方方式式，以以及及培培养养的的温度和培养基中所溶解的氧的数量等环境参数。温度和培养基中所溶解的氧的数量等环境参数。不不过过，有有关关处处于于不不同同生生理理状状态态下下的的大大肠肠杆杆菌菌寄寄主主细细胞胞，究究竟竟是是怎怎样样影响外源基因的细胞效率的，人们在这方面的知识还是相当贫乏的。影响外源基因的细胞效率的，人们在这方面的知识还是相当贫乏的。第19页，讲稿共49张，创作于星期日图图7.1 7.1 原核细胞的启动子序列原核细胞的启动子序列 第20页，讲稿共49张，创作于星期日图图7.2 7.2 原核基因转录的起始原核基因转录的起始 第21页，讲稿共49张，创作于星期日图
30、图7.3 7.3 原核基因终止子序列及其结构原核基因终止子序列及其结构 第22页，讲稿共49张，创作于星期日图图7.4 7.4 非融合型表达蛋白载体非融合型表达蛋白载体pKK223-3pKK223-3第23页，讲稿共49张，创作于星期日图图7.5 7.5 分泌型克隆表达载分泌型克隆表达载体体pIN IIIpIN III系统系统第24页，讲稿共49张，创作于星期日图图7.6 7.6 融合蛋白表达载体融合蛋白表达载体pGEXpGEX系系统统第25页，讲稿共49张，创作于星期日图图7.7 47.7 4个天然启动子和两个人造启动子的个天然启动子和两个人造启动子的-35-35区和区和-10-10区的碱基
31、序列区的碱基序列第26页，讲稿共49张，创作于星期日图图7.8 7.8 三个重组质粒的三个重组质粒的cro mRNAcro mRNA二级结构二级结构第27页，讲稿共49张，创作于星期日图图7.9 7.9 改变改变Lac Lac 启动子和克隆基因间启动子和克隆基因间距离的一般方法距离的一般方法第28页，讲稿共49张，创作于星期日第二节第二节 外源基因在真核细胞中的表达外源基因在真核细胞中的表达1.1.酵母表达系统酵母表达系统 酵酵母母（yeastyeast）是是一一类类以以芽芽殖殖或或裂裂殖殖进进行行无无性性繁繁殖殖的的单单细细胞胞真真核核生生物物，是最理想的真核生物基因表达系统。是最理想的真核
32、生物基因表达系统。（1 1）酵母表达系统的优点）酵母表达系统的优点基因表达调控的机制比较清楚，遗传操作相对简便。基因表达调控的机制比较清楚，遗传操作相对简便。具有原核生物所不具备的蛋白质翻译后的加工和修饰系统。具有原核生物所不具备的蛋白质翻译后的加工和修饰系统。可将外源基因表达产物分泌到培养基中。可将外源基因表达产物分泌到培养基中。对人体和环境安全，不含毒素和特异性病毒。对人体和环境安全，不含毒素和特异性病毒。可进行大规模的发酵，工艺简单而成熟，成本低廉。可进行大规模的发酵，工艺简单而成熟，成本低廉。第29页，讲稿共49张，创作于星期日（2 2）酵母基因表达载体）酵母基因表达载体 酵酵母母克克
33、隆隆和和表表达达载载体体是是由由酵酵母母野野生生型型质质粒粒、原原核核生生物物质质粒粒载载体体上上的的功功能能基基因因（如如抗抗性性基基因因、复复制制子子等等）和和宿宿主主染染色色体体DNADNA上上的的自自主主复复制制子子结构（结构（ARSARS）、中心粒序列（）、中心粒序列（CENCEN）、端粒序列（）、端粒序列（LELLEL）等一起构建而成。）等一起构建而成。酵酵母母基基因因表表达达系系统统的的载载体体一一般般是是一一种种穿穿梭梭质质粒粒，它它既既能能够够在在原原核核细细胞（大肠杆菌）中复制，又能在真核细胞（酵母）中复制。胞（大肠杆菌）中复制，又能在真核细胞（酵母）中复制。DNADNA复
34、制起始区复制起始区a a：大肠杆菌源质粒的复制起始序列：使其能在大肠杆菌中复制。：大肠杆菌源质粒的复制起始序列：使其能在大肠杆菌中复制。b b：酵酵母母菌菌的的天天然然2 2质质粒粒的的复复制制起起始始序序列列或或酵酵母母基基因因组组中中的的自自主主复复制制序列，使其能在酵母菌中复制。序列，使其能在酵母菌中复制。第30页，讲稿共49张，创作于星期日选择标记基因选择标记基因a a：营养缺陷型选择标记，宿主菌为相应的营养缺陷型。：营养缺陷型选择标记，宿主菌为相应的营养缺陷型。b b：显性选择标记（：显性选择标记（G418G418等），可采用各种类型酵母细胞作为宿主细胞。等），可采用各种类型酵母细胞
35、作为宿主细胞。有丝分裂稳定区有丝分裂稳定区 来来源源于于酵酵母母染染色色体体着着丝丝粒粒（centromerecentromere）片片断断，能能保保证证表表达达载载体体在在酵酵母母细胞分裂时，能平均地分配到子代细胞中去。细胞分裂时，能平均地分配到子代细胞中去。表达盒表达盒 表表达达盒盒是是酵酵母母表表达达载载体体的的重重要要元元件件，包包括括启启动动子子、分分泌泌信信号号肽肽序序列列、多多克隆位点及终止子序列。克隆位点及终止子序列。启动子：启动子：保证转录的起始。保证转录的起始。分泌信号肽序列：分泌信号肽序列：引导目的基因蛋白分泌到细胞外。引导目的基因蛋白分泌到细胞外。第31页，讲稿共49张
36、，创作于星期日多克隆位点：多克隆位点：供外源基因插入。供外源基因插入。终止子：终止子：保证转录在适当位置停止。保证转录在适当位置停止。（3 3）酵母基因表达载体的种类）酵母基因表达载体的种类自主复制型质粒载体自主复制型质粒载体 该该质质粒粒含含有有酵酵母母基基因因组组的的DNADNA复复制制起起始始区区、选选择择标标记记、基基因因克克隆隆位位点等关键元件。点等关键元件。酵母基因组酵母基因组DNADNA复制起始区：复制起始区：能够在酵母细胞中自主复制。能够在酵母细胞中自主复制。基因克隆位点：基因克隆位点：来源于大肠杆菌源质粒，如来源于大肠杆菌源质粒，如pBR322pBR322。这这类类载载体体的
37、的优优点点在在于于：在在酵酵母母细细胞胞中中的的转转化化率率高高，每每个个细细胞胞拷拷贝贝数数可达可达200200个个缺缺点点在在于于：由由于于缺缺乏乏酵酵母母染染色色体体着着丝丝粒粒片片断断，在在细细胞胞分分裂裂过过程程中中不不能能均匀的分配到子细胞中去，因而经过多代培养后，子细均匀的分配到子细胞中去，因而经过多代培养后，子细第32页，讲稿共49张，创作于星期日胞中质粒载体的拷贝数迅速减少。胞中质粒载体的拷贝数迅速减少。整合型质粒载体整合型质粒载体 该该质质粒粒载载体体不不含含有有酵酵母母DNADNA复复制制起起始始区区，不不能能在在酵酵母母中中进进行行自自主主复复制制，但但该该质质粒粒含含
38、有有整整合合介介导导区区，可可以以通通过过DNADNA的的同同源源重重组组将将外外源源基基因因整整合合到到酵母染色体上，随染色体一起进行复制。酵母染色体上，随染色体一起进行复制。着丝粒型质粒载体着丝粒型质粒载体 该该质质粒粒载载体体是是在在自自主主复复制制型型质质粒粒载载体体的的基基础础上上构构建建而而成成的的，增增加加了了酵酵母母染染色色体体有有丝丝分分裂裂稳稳定定序序列列元元件件（着着丝丝粒粒），因因而而能能保保证证质质粒粒载载体体在在细细胞胞分分裂裂时时平平均均地地分分配配到到子子细细胞胞中中去去，同同时时提提高高了了质质粒粒在在宿宿主主细细胞胞中的稳定性。中的稳定性。酵母人工染色体酵母
39、人工染色体第33页，讲稿共49张，创作于星期日（4 4）酵母基因表达系统宿主菌）酵母基因表达系统宿主菌 目目前前，作作为为外外源源基基因因表表达达的的宿宿主主酵酵母母菌菌主主要要包包括括：酿酿酒酒酵酵母母、巴巴斯德毕赤酵母、乳酸克努维酵母和多形汉森酵母斯德毕赤酵母、乳酸克努维酵母和多形汉森酵母。（5 5）在酵母中高效表达外源基因的策略）在酵母中高效表达外源基因的策略提高表达载体在细胞中的拷贝数提高表达载体在细胞中的拷贝数 以以多多拷拷贝贝酵酵母母内内源源性性质质粒粒为为基基础础构构建建的的多多拷拷贝贝表表达达载载体体，是是提提高高表表达达载载体体在在酵酵母母中中拷拷贝贝数数的的一一个个途途径径
40、。但但以以上上的的多多拷拷贝贝载载体体在在没没有有选选择择压力的情况下，可能难以保持其高拷贝数。压力的情况下，可能难以保持其高拷贝数。将将外外源源基基因因整整合合到到染染色色体体上上可可维维持持外外源源基基因因在在细细胞胞中中的的稳稳定定性性，然而在多数情况下会因为在细胞中的拷贝数较低而影响其表达。然而在多数情况下会因为在细胞中的拷贝数较低而影响其表达。第34页，讲稿共49张，创作于星期日提高外源基因的转录水平提高外源基因的转录水平 在在构构建建表表达达载载体体时时组组入入强强启启动动子子，如如：酵酵母母磷磷酸酸甘甘油油酯酯激激酶酶基基因因启启动动子子、甘甘油油醛醛磷磷酸酸脱脱氢氢酶酶基基因因
41、启启动动子子，可可提提高高外外源源基基因因的的转转录录水水平。但外源基因表达的产物量过高也会对细胞形成伤害。平。但外源基因表达的产物量过高也会对细胞形成伤害。选择合适的受体细胞系统选择合适的受体细胞系统 根据表达载体特性，选择合适的酵母受体系统。根据表达载体特性，选择合适的酵母受体系统。第35页，讲稿共49张，创作于星期日2.2.植物细胞基因表达系统植物细胞基因表达系统（1 1）植物基因表达载体的组成特性）植物基因表达载体的组成特性 大大多多数数植植物物基基因因表表达达载载体体是是以以TiTi质质粒粒为为基基础础构构建建而而成成的的，其其组组成成包包括括启启动子、动子、T-DNAT-DNA、终
42、止子、内含子及选择标记基因和报告基因。、终止子、内含子及选择标记基因和报告基因。植物基因表达载体的启动子植物基因表达载体的启动子 根根据据启启动动子子的的功功能能和和作作用用方方式式，可可分分为为组组成成型型启启动动子子、诱诱导导型型启启动子动子和和组织特异性启动子组织特异性启动子等几类。等几类。组组成成型型启启动动子子：外外源源基基因因的的表表达达大大体体恒恒定定在在一一定定水水平平，在在不不同同组组织织部部位位没没有有明明显显差差异异，没没有有时时空空特特异异性性。一一般般采采用用花花椰椰菜菜花花叶叶病病病病毒毒（CaMVCaMV）35S 35S RNARNA的的启启动动子子、TiTi质质
43、粒粒的的胭胭脂脂碱碱合合成成酶酶基基因因(nos)(nos)或或章章鱼鱼碱碱合成酶基因合成酶基因(ocs)(ocs)的启动子。的启动子。第36页，讲稿共49张，创作于星期日诱诱导导型型启启动动子子：在在某某些些特特定定的的物物理理或或化化学学信信号号刺刺激激下下，可可大大幅幅度度提提高高外外源源基因的转录水平。基因的转录水平。组组织织特特异异型型启启动动子子：外外源源基基因因只只能能在在特特定定的的组组织织细细胞胞中中表表达达。如如：采用马铃薯块茎蛋白基因的启动子、花粉特异表达基因启动子等。采用马铃薯块茎蛋白基因的启动子、花粉特异表达基因启动子等。植物基因表达载体的终止子植物基因表达载体的终止
44、子 不不同同来来源源的的终终止止子子对对外外源源基基因因的的表表达达有有很很大大影影响响，它它不不仅仅决决定定外外源源基基因因的的转转录录活活性性，也也决决定定mRNAmRNA在在细细胞胞中中的的稳稳定定性性，从从而而影影响响mRNAmRNA的的翻翻译译。研研究究表表明明，采采用用相相同同的的启启动动子子及及外外源源基基因因，而而采采用用不不同同的的终终止止子子序列序列 ，外源基因的表达水平有很大差异（差异可达，外源基因的表达水平有很大差异（差异可达6060倍）。倍）。T-DNAT-DNA（transfer DNAtransfer DNA）第37页，讲稿共49张，创作于星期日 可可将将外外源源
45、基基因因连连入入T-DNAT-DNA区区域域，随随T-DNAT-DNA随随机机整整合合进进入入植植物物细细胞胞的的染染色色体体基基因因组组中中，从从而而使使外外源源基基因因得得到到稳稳定定维维持持和和表表达达。但但必必须须注注意意保保留留T-DNAT-DNA序序列列的的左左右右边边界界序序列列，因因为为左左右右边边界界序序列列是是外外源源DNADNA转移和整合不可缺少的元件。转移和整合不可缺少的元件。内含子序列内含子序列 研研究究表表明明，内内含含子子与与基基因因表表达达水水平平有有很很大大关关系系。因因而而在在构构建建植植物物基基因因表表达达载载体体时时，可可根根据据不不同同基基因因的的类类
46、型型，有有选选择择性性的的插插入入内内含含子子序列。序列。选择标记基因和报告基因选择标记基因和报告基因 选选择择标标记记基基因因和和报报告告基基因因的的作作用用在在于于筛筛选选转转化化体体，检检测测外外源源基基因因的的转转译译水水平平。常常用用的的选选择择标标基基因因有有新新霉霉素素磷磷酸酸转转移移酶酶基基因因、二二氢氢叶叶酸酸还还原原酶酶基基因因、潮潮霉霉素素磷磷酸酸转转移移酶酶基基因因等等；报报告告基基因因有有冠冠瘿瘿碱碱基基因因、氯氯霉霉素乙酰转移酶基因等。素乙酰转移酶基因等。第38页，讲稿共49张，创作于星期日（2 2）植物基因表达的受体系统）植物基因表达的受体系统 植植物物基基因因表
47、表达达的的受受体体系系统统是是指指用用于于转转化化的的植植物物细细胞胞，主主要要包包括括以以下五类：下五类：愈伤组织再生系统愈伤组织再生系统 它它是是外外植植体体经经脱脱分分化化培培养养、诱诱导导愈愈伤伤组组织织并并通通过过分分化化培培养养获获得得再生植株的受体系统。再生植株的受体系统。特特点点：易易于于接接受受外外源源基基因因，转转化化效效率率高高；扩扩繁繁量量大大，可可获获得得大大量量的的转转化化植植株株；但但获获得得的的再再生生植植株株无无性性系系变变异异较较大大；外外源源基基因因的的稳稳定定性差。性差。直接分化再生系统直接分化再生系统 它它是是指指外外植植体体细细胞胞不不经经脱脱分分化
48、化阶阶段段而而直直接接分分化化出出不不定定芽芽而而获获得得再再生株。生株。第39页，讲稿共49张，创作于星期日 特特点点：获获得得再再生生植植株株的的周周期期短短，细细胞胞无无性性系系变变异异小小，能能较较好好地地保保持持受受体体细胞的遗传稳定性；但转化率相对较低，存在较多的嵌合株。细胞的遗传稳定性；但转化率相对较低，存在较多的嵌合株。原生质体再生系统原生质体再生系统 特特点点：转转化化率率高高，可可形形成成基基因因型型一一致致的的细细胞胞克克隆隆；但但原原生生质质体体培培养养周周期期较长、难度大、再生频率较低，在原生质体的培养过程中易造成变异。较长、难度大、再生频率较低，在原生质体的培养过程
49、中易造成变异。胚状体再生系统胚状体再生系统 它它是是指指体体细细胞胞或或单单倍倍体体细细胞胞在在组组织织培培养养条条件件下下诱诱导导成成为为形形态态结结构构和和功功能能上类似于有性胚的胚状体，是一种最理想的转化受体系统。上类似于有性胚的胚状体，是一种最理想的转化受体系统。特点：转化率高；获得嵌合体少；可生产人工种子。特点：转化率高；获得嵌合体少；可生产人工种子。第40页，讲稿共49张，创作于星期日生殖细胞受体系统生殖细胞受体系统 以以生生殖殖细细胞胞如如花花粉粉、卵卵细细胞胞等等作作为为基基因因转转化化的的受受体体细细胞胞，通通过过组组织织培培养养技技术术将将生生殖殖细细胞胞诱诱导导成成为为胚
50、胚性性细细胞胞或或愈愈伤伤组组织织，或或直直接接利利用用花花粉粉和卵子受精过程进行基因转化。和卵子受精过程进行基因转化。特特点点：转转化化率率高高；易易于于获获得得稳稳定定的的遗遗传传，并并且且通通过过加加倍倍后后成成为为纯纯合的二倍体。合的二倍体。（3 3）提高外源基因在植物细胞中的表达效率的策略）提高外源基因在植物细胞中的表达效率的策略构建高效表达的转化载体构建高效表达的转化载体防止外源基因失活防止外源基因失活优化先导序列，提高翻译效率优化先导序列，提高翻译效率第41页，讲稿共49张，创作于星期日3.3.哺乳动物细胞基因表达系统哺乳动物细胞基因表达系统（1 1）哺乳动物基因表达载体的组成特