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1、分解尿素的细菌的计数与分离第一页，讲稿共二十七页哦一、课题背景一、课题背景1 1、尿素的利用、尿素的利用尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被农作物被农作物吸收。吸收。土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分解成氨分解成氨之后才能被植之后才能被植物利用。物利用。2 2、细菌能利用尿素的原因、细菌能利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶能合成脲酶CO(NHCO(NH2 2)2 2脲酶脲酶 +H +H2 2O O+CO+CO2 22NH2NH3 3第二页，讲稿共二十七页哦3 3、常见的分解尿素的微生物、常见的分解尿
2、素的微生物芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。分解尿素。4 4、课题目的、课题目的从土壤中分离出从土壤中分离出能够分解尿素的细菌能够分解尿素的细菌统计统计每克土壤每克土壤样品中究竟含有样品中究竟含有多少这样的细菌多少这样的细菌一一.研究思路研究思路.筛选菌株筛选菌株.统计菌落数目统计菌落数目.设置对照设置对照第三页，讲稿共二十七页哦 1 1、实例：、实例：PCRPCR技术技术技术技术启示：寻找启示：寻找目的菌种目的菌种时要根据它对生存环境的要时要根据它对
3、生存环境的要求，到求，到相应的环境相应的环境中去寻找。中去寻找。原因：原因：因为热泉温度因为热泉温度707080800 0C C，淘汰了绝大多数，淘汰了绝大多数微生物只有微生物只有TaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。DNADNA多聚酶多聚酶链式反应链式反应是是一种在一种在体外将少量体外将少量DNADNA大大量复制量复制(PCR)(PCR)的技术，此的技术，此项技术要求使用项技术要求使用耐高温耐高温（93930 0C C）的）的DNADNA聚合酶。聚合酶。.筛选菌株筛选菌株第四页，讲稿共二十七页哦 要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营
4、养、生理、生长条件等；包括营养、生理、生长条件等；方法：方法：抑制大多数微生物的生长抑制大多数微生物的生长 促进促进目的菌株目的菌株的的生长生长结果：结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。稀释等方法对它进行纯化培养分离。2、实验室中微生物的筛选原理：、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于人为提供有利于目的菌株目的菌株生长的条件生长的条件(包括营养、包括营养、温度、温度、pH等等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。，同时抑制或阻止其他微生物生长。第五页，讲稿共二十七页哦15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿
5、素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2OO2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 43 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：基：从物理性质看此培养基属于哪类？从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基固体培养基第六页，讲稿共二十七页哦在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖葡萄糖 氮源：氮源：尿素尿素培养基的培养基的培养基的培养基的氮源为尿素氮源为尿素氮源为尿素氮源为尿素，只有，只有，只有，只有能合成能
6、合成能合成能合成脲酶脲酶脲酶脲酶的微生物才能分解的微生物才能分解的微生物才能分解的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。尿素，以尿素作为氮源。尿素，以尿素作为氮源。尿素，以尿素作为氮源。缺乏缺乏缺乏缺乏脲酶的微生物由于不能分解脲酶的微生物由于不能分解脲酶的微生物由于不能分解脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长尿素，缺乏氮源而不能生长尿素，缺乏氮源而不能生长尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所发育繁殖，而受到抑制，所发育繁殖，而受到抑制，所发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出以用此培养基就能够选择出以用此培养基就能够选择出以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物
7、。分解尿素的微生物。分解尿素的微生物。分解尿素的微生物。5 5、培养基选择分解尿素的微生物的原理、培养基选择分解尿素的微生物的原理第七页，讲稿共二十七页哦允许允许特定种类特定种类的微生物生长，同时的微生物生长，同时抑制或阻止其他抑制或阻止其他种类种类微生物生长的培养基，叫做微生物生长的培养基，叫做选择培养基选择培养基尿素尿素尿素尿素第八页，讲稿共二十七页哦6 6、怎样证明此培养基具有选择性呢？、怎样证明此培养基具有选择性呢？以尿素为以尿素为唯一氮源唯一氮源的培养基的培养基牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨培养基培养基是是分离分离尿素尿素细菌细菌判断该判断该培养基培养基有无选有无选择性择性实验组实验组对照
8、组对照组培养基类型培养基类型是否是否接种接种目的目的结果结果只生长尿只生长尿素细菌素细菌生长多种生长多种微生物微生物是是第九页，讲稿共二十七页哦1 1、显微镜直接计数：、显微镜直接计数：利用利用血球计数板血球计数板(血细胞计数板血细胞计数板），在显微镜下计，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。算一定容积里样品中微生物的数量。.统计菌落数目：统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点：缺点：第十页，讲稿共二十七页哦2.
9、2.间接计数法（间接计数法（活菌计数法）活菌计数法）原理：原理：在稀释度足够高时，微生物在固体在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的培养基上所形成的一个菌落一个菌落是由是由一个单细胞一个单细胞繁殖而成的，即繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单一个菌落代表原先的一个单细胞。细胞。常用方法：稀释涂布平板法。常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(CV)M(CV)M其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，落数，V V代表涂布平板时所用的稀释液的体积代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数
10、。代表稀释倍数。第十一页，讲稿共二十七页哦？说明设置重复组的重要性。在在设设计计实实验验时时，一一定定要要涂涂布布至至少少3 3个个平平板板，作作为为重重复复组组，才才能能增增强强实实验验的的说说服服力力与与准准确确性性。在在分分析析实实验验结结果果时时，一一定定要要考考虑虑所所设设置置的的重重复复组组的的结结果果是是否否一一致致，结结果果不一致，意味着操作有误，需要重新实验不一致，意味着操作有误，需要重新实验。第十二页，讲稿共二十七页哦注意事项注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030300300的平板上进行计数。的平板上进行计数。为使结果接近真实值
11、可将为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或同一稀释度加到三个或三个以上的平板中三个以上的平板中，经涂布，培养计算出菌落平均，经涂布，培养计算出菌落平均数。数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。第十三页，讲稿共二十七页哦计算公式：计算公式：每克样品中的菌株数每克样品中的菌株数=（CV）M某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）()A.2.34108B.2.34109C.234D.23.4B第十四页，讲稿共二十七页哦（三）设置对照（三）设置对照判断培养基中是否有杂菌污
12、染：判断培养基中是否有杂菌污染：将未接种的培养基同时进行培养。将未接种的培养基同时进行培养。判断选择培养基是否具有筛选作用：判断选择培养基是否具有筛选作用：完全培养基（营养成分齐全）接种后培养完全培养基（营养成分齐全）接种后培养观察菌落数目。观察菌落数目。主要目的是排除实验组中非测试因素对实验主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。结果的影响，提高实验结果的可信度。第十五页，讲稿共二十七页哦实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，的实验时，A A同学从对应的同学从对应的10106 6倍稀释的培养基中筛倍稀
13、释的培养基中筛选出大约选出大约150150个菌落，但是其他同学在同样的稀释个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约度下只选择出大约5050个菌落。分析其原因。个菌落。分析其原因。原因：原因：土样不同土样不同培培养养基基污污染染或或操操作作失失误误(或或者者是是混混入入了了其其他他的的含含氮氮物质物质)第十六页，讲稿共二十七页哦小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。力，对照的设置是必不可少的。方案一：方案一：由其他同学由其他同学用与用与A同学相同土样同学相同土样进行实验进行实验方案二：方案二：将将A同学配制的培
14、养基在不加土样的情况同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。受到污染。结果预测：结果预测：如果结果与如果结果与A同学一致，则证明同学一致，则证明A无误；如无误；如果结果不同，则证明果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配同学存在操作失误或培养基的配制有问题。制有问题。第十七页，讲稿共二十七页哦实验设计实验设计从从肥肥沃沃、酸酸碱碱度度接接近近中中性性的的湿湿润润土土壤壤中中取取样样。先先铲铲去去表表层层土土3 cm3 cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。左右，再取样，将样品装入事先准备好的
15、信封中。“微生物的天然培养基微生物的天然培养基”一一 土壤取样土壤取样数量最大、种类最多数量最大、种类最多大约大约70%90%70%90%是细菌是细菌取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。第十八页，讲稿共二十七页哦 二二 制备培养基制备培养基 由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：个较为宽泛的范围：稀释倍数为稀释倍数为103107。准备准备牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基和和选择培养基。选择培养基。每个稀释度下每个稀释度下需要需要3个选择培养基，个选
16、择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基。还需要个牛肉膏蛋白胨培养基。还需要8个灭个灭菌试管和菌试管和1个灭菌移液管个灭菌移液管。将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显落数目应明显多于多于选择培养基上的数目，因此，选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择选择作用。作用。第十九页，讲稿共二十七页哦应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每
17、一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在目的：保证获得菌落数在目的：保证获得菌落数在目的：保证获得菌落数在30303030300300300300之间、适于计数的平板之间、适于计数的平板之间、适于计数的平
18、板之间、适于计数的平板（三）（三）样品的稀释样品的稀释第二十页，讲稿共二十七页哦问问题题：为为什什么么分分离离不不同同的的微微生生物物要要采采用用不不同同的的稀稀释释度度？测测定定土土壤壤中中细细菌菌的的总总量量和和测测定定土土壤壤中中能能分分解解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？原原因因：土土壤壤中中各各类类微微生生物物的的数数量量（单单位位：株株/kg/kg）是是不不同同的的。例例如如在在干干旱旱土土壤壤中中的的上上层层样样本本中中：好好氧氧及及兼兼性性厌厌氧氧细细菌菌数数约约为为2 2 185185万万，放放线线菌菌数数约约为为477477万
19、万，霉菌数约为霉菌数约为23.123.1万。万。结结论论：为为获获得得不不同同类类型型的的微微生生物物，就就需需要要按按不不同同的的稀稀释释度度进进行行分分离离，同同时时还还应应当当有有针针对对性性地地提提供供选选择择培培养养的条件。的条件。第二十一页，讲稿共二十七页哦.取样涂布取样涂布实验时要对实验时要对培养皿作好标培养皿作好标记。注明培养记。注明培养基类型、培养基类型、培养时间、稀释度、时间、稀释度、培养物等。培养物等。如果得到了如果得到了如果得到了如果得到了2 2 2 2个或个或个或个或2 2 2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在个以上菌落数目在个以上菌落数目在303003030030
20、30030300的平板，的平板，的平板，的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同同同同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。需要重新实验。需要重新实验。需要重新实验。第二十二页，讲稿共二十七页哦.微生物的培养与观察微生物的培养与观察在菌落计数时
21、，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。时间不足而导致遗漏菌落的数目。培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：细菌：30303737培养培养1 12d2d 放线菌：放线菌：25252828培养培养5 57d7d 霉菌：霉菌：25252828的温度下培养的温度下培养3 34d4d。第二十三页，讲稿共二十七页哦微生物的培养与观察微生物的培养与观察第二十四页，讲稿共二十七页哦操作提示操作提示操作提示操作提示 一
22、一一一 无菌操作无菌操作无菌操作无菌操作1 1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2 2、应应在在火火焰焰旁旁称称取取土土壤壤。在在火火焰焰附附近近将将称称好好的的土土样样倒倒入入锥锥形形瓶瓶中中，塞好棉塞。塞好棉塞。3 3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。二二二二 做好标记做好标记做好标记做好标记注明培养基种类、培养日期、平板培养样品注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。的稀释度等。三三三三 规划时间规划时间规划时间规划时间 三、三、第二十五页，讲稿共
23、二十七页哦四四.结果分析与评价结果分析与评价1.1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。分解尿素的微生物。2.2.提示：选择每个平板上长有提示：选择每个平板上长有3030030300个菌个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同同一稀释倍数的三个重复的菌落数一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。如相差较大，表示实验不精确。
24、第二十六页，讲稿共二十七页哦1.1.在以在以尿素尿素为唯一氮源的培养基中加入为唯一氮源的培养基中加入酚酚红红指示剂。培养某种细菌后，如果指示剂。培养某种细菌后，如果PHPH升高，升高，指示剂将指示剂将变红变红，说明该细菌能够分解尿素。，说明该细菌能够分解尿素。2.2.测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊伊红红-美蓝美蓝 培养基上培养，大肠杆菌培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑菌落呈现黑色色，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。五五.课外延伸课外延伸第二十七页，讲稿共二十七页哦