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1、关于血红蛋白提取第1页，此课件共47页哦课题背景课题背景:血红蛋白血红蛋白是人和其他脊是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分。负椎动物红细胞的主要组成成分。负责血液中责血液中O2和和CO2的运输。的运输。1.1.血液血液由由_和和_两部分组成。两部分组成。血细胞中血细胞中_细胞数量最多，该细细胞数量最多，该细胞中含量最高的化合物是胞中含量最高的化合物是_血浆血浆血细胞血细胞红红血红蛋白血红蛋白第2页，此课件共47页哦2 2条条-肽链肽链2 2条条-肽链肽链 亚铁血红素亚铁血红素2.血红蛋白由血红蛋白由 _和和_构成的，其中每个亚基中都含有一个能构成的，其中每个亚基中都含有一个能与与O2和和CO
2、2结合的结合的_基团基团 故，故，本课题可选用猪、牛等其他本课题可选用猪、牛等其他脊椎动物脊椎动物的血的血液来分离血红蛋白液来分离血红蛋白!血红蛋白呈红色！血红蛋白呈红色！第3页，此课件共47页哦一、一、基础知识基础知识(一一)蛋白质提取与分离的依据蛋白质提取与分离的依据-根据蛋白质各种根据蛋白质各种特性的差异：特性的差异：1.1.分子的形状、大小分子的形状、大小 2.2.电荷性质和多少电荷性质和多少 3.3.溶解度溶解度 4.4.吸附性质吸附性质 5.5.对其他分子的亲和力对其他分子的亲和力 凝胶色谱法凝胶色谱法 凝胶电泳法凝胶电泳法(二二)蛋白质提取与分离的方法蛋白质提取与分离的方法:第4
3、页，此课件共47页哦（1 1）原理：）原理：（2 2）材料：凝胶）材料：凝胶大大分子通过多孔凝胶颗粒的分子通过多孔凝胶颗粒的_,_,路程路程_,_,移动移动_小小分子穿过多孔凝胶颗粒的分子穿过多孔凝胶颗粒的_,_,路程路程_,_,移动移动_1、凝胶色谱法凝胶色谱法(分配色谱法分配色谱法)间隙间隙内部内部短短长长快快慢慢根据根据相对分子质量的大小相对分子质量的大小分离蛋白质分离蛋白质凝胶：凝胶：微小的多孔球体微小的多孔球体，内部有许多，内部有许多贯穿的贯穿的通道。通道。化学本质多为：化学本质多为：多糖类化合物多糖类化合物，如：，如：葡聚糖或琼脂糖葡聚糖或琼脂糖。第5页，此课件共47页哦混合物混合
4、物上上 柱柱洗洗脱脱大分子流动快大分子流动快小分子流动慢小分子流动慢收收 集集大分子大分子收收 集集小分子小分子 洗脱：从色谱柱上端不断注入洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液缓冲液，促使蛋白质分促使蛋白质分子的差速流动。子的差速流动。凝胶色谱柱凝胶色谱柱（层析柱）（层析柱）（3 3）凝胶色谱法凝胶色谱法分离过程分离过程 第6页，此课件共47页哦凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示:演示结束第7页，此课件共47页哦如如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等等洗脱液洗脱液抵制抵制外
5、界酸和碱对溶液外界酸和碱对溶液pHpH的影响，在一定范围内保的影响，在一定范围内保持持 pHpH稳定。稳定。（4）缓冲溶液缓冲溶液作用：作用：配制：配制：通常由通常由1 12 2种缓冲剂种缓冲剂溶解于溶解于水水中配制而成中配制而成第8页，此课件共47页哦(2)(2)电泳的电泳的原理原理：2、凝胶电泳法、凝胶电泳法(1)(1)电泳的概念电泳的概念注：带电粒子向着注：带电粒子向着_的电极移动。的电极移动。与其所带电荷相反与其所带电荷相反带电粒子在电场作用下发生迁移的带电粒子在电场作用下发生迁移的过程过程 利用待分离样品中各分子利用待分离样品中各分子带电性带电性质质的差异，分子本身的的差异，分子本身
6、的大小大小和和形状形状的的不同，使带电分子产生不同的迁移速不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现各种分子的分离度，从而实现各种分子的分离第9页，此课件共47页哦注：影响蛋白质分子运动速度的因素：注：影响蛋白质分子运动速度的因素：决定运动方向电场作用力决定运动速率电荷性质电荷量分子形状分子大小思考：蛋白质为什么带有电荷？思考：蛋白质为什么带有电荷？许多生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，许多生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的在一定的PHPH下，这些基团会带上下，这些基团会带上正电正电或或负电负电第10页，此课件共47页哦电泳原理示意图电泳原理示意图-教材教材P
7、66P66第11页，此课件共47页哦该电泳该电泳蛋白质迁移速率仅取决于蛋白质迁移速率仅取决于分子大小分子大小（3 3）常用电泳方法）常用电泳方法琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质测定蛋白质分子量分子量常用常用：SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳注：注：SDS的作用的作用:消除净电荷对迁移率的影响消除净电荷对迁移率的影响SDS能使蛋白质完全变性，解聚成单条肽链。能使蛋白质完全变性，解聚成单条肽链。形成形成“蛋白质蛋白质SDS复合物复合物”，掩盖了蛋白质间，掩盖了蛋白质间的电荷差别。的电荷差别。且分子质量越大，电泳迁移速率越慢！且分子质
8、量越大，电泳迁移速率越慢！第12页，此课件共47页哦课堂反馈课堂反馈1 1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是一步是A A 弄清各种蛋白质的空间结构弄清各种蛋白质的空间结构B B 弄清各种蛋白质的功能弄清各种蛋白质的功能C C 弄清各种蛋白质的合成过程弄清各种蛋白质的合成过程D D 获得高纯度的蛋白质获得高纯度的蛋白质第13页，此课件共47页哦2 2凝胶色谱法是根据（凝胶色谱法是根据（）分离蛋白质的）分离蛋白质的有效方法。有效方法。A A、分子的大小、分子的大小 B B、相对分子质量的
9、大小、相对分子质量的大小 C C、带电荷的多少、带电荷的多少 D D、溶解度、溶解度3 3电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（其所带电荷（）的电极移动。）的电极移动。A A、相同、相同 B B、相反、相反 C C、随机、随机BB第14页，此课件共47页哦4 4、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是（蛋白质的叙述，正确的是（）A A、相对分子质量较小的蛋白质行程较大、相对分子质量较小的蛋白质行程较大B B、相对分子质量较小的蛋白质行程较小、相对分子质量较小的蛋白质行程较小C C、行程与、行
10、程与蛋白质的相对分子质量大小无关蛋白质的相对分子质量大小无关D D、二者根本无法比较、二者根本无法比较第15页，此课件共47页哦课题课题3 3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离第二课时第二课时四川省绵阳中学四川省绵阳中学 邓志华邓志华第16页，此课件共47页哦回忆复习回忆复习-血液组成成分血液组成成分第17页，此课件共47页哦知识填空知识填空-血液组成成分：血液组成成分：血液由血液由_和和_两部分组成。两部分组成。1.1.血细胞中血细胞中_细胞数量最多，红细胞细胞数量最多，红细胞中含量最多的有机化合物是中含量最多的有机化合物是_2.2.血红蛋白由血红蛋白由 _和和_构成的，其中每条肽链
11、中都含有一个能构成的，其中每条肽链中都含有一个能与与O2O2或或CO2CO2结合的结合的_基团，基团，因因其含有其含有_而呈而呈红色红色。血浆血浆血细胞血细胞红红血红蛋白血红蛋白2条条-肽链肽链2条条-肽链肽链 血红素血红素亚铁血红素亚铁血红素第18页，此课件共47页哦 本课题可选用猪、牛、羊或其他本课题可选用猪、牛、羊或其他哺乳动哺乳动物的红细胞物的红细胞来分离血红蛋白来分离血红蛋白选材选材:思考：为什么以哺乳动物的红细胞为思考：为什么以哺乳动物的红细胞为材料？材料？无细胞核，无细胞器等结构，无细胞核，无细胞器等结构，血红蛋白含量丰富，便于提血红蛋白含量丰富，便于提取。取。第19页，此课件共
12、47页哦二二.实验操作实验操作(1)(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤(2)(2)血红蛋白的释放血红蛋白的释放(3)(3)分离血红蛋白溶分离血红蛋白溶液液样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定透析透析除去除去分子较小的分子较小的杂质杂质通过通过凝胶色谱法凝胶色谱法将分将分子量较大的子量较大的杂质蛋白杂质蛋白质质除去除去通过通过聚丙烯酰胺凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电泳泳鉴定纯度鉴定纯度第20页，此课件共47页哦（1 1）红细胞的洗涤）红细胞的洗涤血液血液100mL100mL低速短时低速短时间离心间离心红细胞红细胞血血 浆浆吸出吸出血浆血浆红细胞红细胞5 5倍倍体积体积生理盐水生理盐水搅拌搅拌
13、10min步骤步骤1 1、样品处理、样品处理阅读教材阅读教材P67P67思考：洗涤的思考：洗涤的目的目的是什么？是什么？用什么用什么水水洗涤？洗涤？洗涤干净洗涤干净的标志是什么？的标志是什么？重复洗涤重复洗涤3 3次次，直至上清液没有黄色直至上清液没有黄色3g3g柠檬酸钠柠檬酸钠第21页，此课件共47页哦注意：注意：红细胞洗涤采用红细胞洗涤采用低速短时间离心低速短时间离心！速度速度越高越高和和时间越长时间越长会使会使白细胞和淋巴细白细胞和淋巴细胞等一同沉淀胞等一同沉淀达不到分离的效果！达不到分离的效果！洗涤的洗涤的目的目的-除去血浆蛋白等除去血浆蛋白等用什么水用什么水洗涤？洗涤？-0.9%的生
14、理盐水的生理盐水洗涤干净洗涤干净的标志的标志-上清液没有黄色上清液没有黄色答案：答案：第22页，此课件共47页哦初次离心后的结果：初次离心后的结果：第23页，此课件共47页哦步骤步骤1“1“样品处理样品处理”-(2)(2)血红蛋白的释放血红蛋白的释放1.1.用什么方法将红细胞中的血红蛋白释放用什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来？出来？2.2.采取了什么措施加速释放过程？采取了什么措施加速释放过程？分析：分析：蒸馏水的作用是蒸馏水的作用是_。加入甲苯的作用是加入甲苯的作用是_。充分搅拌的目的是充分搅拌的目的是_。使红细胞大量吸水胀裂使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜溶解红细胞的细胞膜加速红
15、细胞破裂加速红细胞破裂阅读教材阅读教材P67思考：思考：第24页，此课件共47页哦参观参观-磁力搅拌器磁力搅拌器第25页，此课件共47页哦步骤步骤1“样品处理样品处理”-(3)分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液分离过程分离过程:红细胞红细胞混合液混合液高速离心高速离心10min 如何除去小分子脂类物质？如何除去小分子脂类物质？过滤过滤滤纸滤纸脂类物质脂类物质血红血红蛋白蛋白-过滤！过滤！收集滤液于分液漏斗得到下层红色液体！收集滤液于分液漏斗得到下层红色液体！第26页，此课件共47页哦透透析析袋袋步骤步骤2 2、粗分离（即透析）粗分离（即透析）20mmol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液1mL1mL思考回
16、答：思考回答：透析的透析的原理原理及及目的目的分别分别是什么是什么？透析的透析的原理原理-半透膜的半透性半透膜的半透性(教材教材P P6767)透析透析目的目的-除去分子量除去分子量较小的杂质！较小的杂质！第27页，此课件共47页哦实际操作的透析袋实际操作的透析袋第28页，此课件共47页哦（粗分离）透析过程动画演示：（粗分离）透析过程动画演示：演示结束第29页，此课件共47页哦步骤步骤3 3、纯化、纯化-凝胶色谱操作凝胶色谱操作教材教材P P6868图图5 51919（1 1）凝胶色谱柱的）凝胶色谱柱的制作制作：（2 2）凝胶色谱柱的装填：）凝胶色谱柱的装填：（3 3）样品的加入和洗脱）样品的
17、加入和洗脱：第30页，此课件共47页哦（1）凝胶色谱柱的制作凝胶色谱柱的制作：(见教材见教材P67)取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃管，厘米的玻璃管，两端磨平。两端磨平。底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔挖出凹穴挖出凹穴安装移液管头部安装移液管头部覆盖尼龙网，再用覆盖尼龙网，再用100100目尼龙纱包好插入玻璃管的目尼龙纱包好插入玻璃管的一一端端注意事项注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮不得超出橡皮塞的凹穴底面塞的凹穴底面。否则难以铺实尼龙网，还会导致液体。否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。残留，蛋白质分离不彻底
18、。第31页，此课件共47页哦顶塞的制作：顶塞的制作：打孔打孔安装玻璃管安装玻璃管。组装：组装：将上述三者按相应位置组装成整体将上述三者按相应位置组装成整体如如图图：装装配配好好的的凝凝胶胶柱柱返回第32页，此课件共47页哦材料：交联葡聚糖凝胶材料：交联葡聚糖凝胶(G-75)(G-75)（2 2）凝胶色谱柱的装填：）凝胶色谱柱的装填：（见教材见教材P68）步骤操作要求50操作压，操作压，磷酸缓冲液磷酸缓冲液洗涤平衡洗涤平衡12h洗涤平衡洗涤平衡打开下端，一次性缓慢倒入；轻轻敲打打开下端，一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液装填悬浮液凝胶颗粒洗脱液凝胶颗粒洗脱液沸水浴沸水浴 凝胶颗粒蒸馏水凝胶颗粒蒸
19、馏水充分溶胀充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液配制悬浮液计算称量凝胶计算称量凝胶固定色谱柱固定色谱柱阅读教材阅读教材P68回答：回答：“G G”表示？表示？“75“75”表示？表示？注意：注意：1 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。的空隙。2 2、装填凝胶柱时不能有气泡存在、装填凝胶柱时不能有气泡存在返回第33页，此课件共47页哦（3 3）样品加入与洗脱）样品加入与洗脱 (见教见教材材P68P69)加样前：加样前：调节缓冲液面与凝胶面平齐调节缓冲液面与凝胶面平
20、齐注意：注意：正确的加样操作：正确的加样操作：1.1.不要触及并破坏凝胶面不要触及并破坏凝胶面 2.2.贴壁加样贴壁加样 3.3.吸管管口沿管壁环绕移动吸管管口沿管壁环绕移动第34页，此课件共47页哦注意：注意：1 1、洗脱液面不能低于凝胶表、洗脱液面不能低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，面，否则可能有气泡混入，搅乱洗搅乱洗脱次序，降低分离效果脱次序，降低分离效果。2 2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象颗粒的现象。加样后：加样后：样品渗入凝胶床样品渗入凝胶床洗脱洗脱收集收集色谱柱制作成功的标准：色谱柱制作成功的标准：红色区带红色区带均匀一致的移动均匀一致的
21、移动 第35页，此课件共47页哦收集得到的纯化后的血红蛋白收集得到的纯化后的血红蛋白第36页，此课件共47页哦步骤步骤4 4、血红蛋白血红蛋白纯度鉴定纯度鉴定（见教材见教材P69P69）SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳方法：方法：-详情请观看详情请观看血红蛋白提取和分离的视频血红蛋白提取和分离的视频第37页，此课件共47页哦操作提示：（注意事项）操作提示：（注意事项）1.1.红细胞的洗涤：红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；须低速、短时离心。洗涤次数不能过少；须低速、短时离心。2.2.凝胶的预处理：凝胶的预处理：短时间沸水浴，还能除去微生物和气泡短时间沸水浴，还能除去微生物和气泡3
22、.3.色谱柱的装填：色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。洗脱液不能断流。4.4.色谱柱成功标志：色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动红色区带均匀一致地移动第38页，此课件共47页哦 观察你处理的血液样品离心后观察你处理的血液样品离心后是否分层是否分层（见（见教材图教材图5-185-18），），如果分层不明显，可能是洗如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红
23、细胞，影响细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。后续血红蛋白的提取纯度。三、实验结果分析与评价三、实验结果分析与评价1 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？处理后的样品发生了哪些变化吗？第39页，此课件共47页哦三、实验结果分析与评价三、实验结果分析与评价2 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？如何判断？谱柱装填得成功吗？如何判断？由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁胶柱旁放一
24、支与凝胶柱垂直的日光灯放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色加入大分子的有色物质物质，例如蓝色葡聚糖，例如蓝色葡聚糖20002000或红色葡聚糖，或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、均匀、狭窄、平整平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消消除不了时要重新装柱除不了时要重新装柱。第40页，此课件共47页哦 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操如果凝胶
25、色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液，随着洗脱液缓慢流出缓慢流出。3 3、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？并据此判断分离效果？三、实验结果分析与评价三、实验结果分析与评价第41页，此课件共47页哦知识小结知识小结血血红红蛋蛋白白的的提提取取和和分分离离蛋白质分子的差异性蛋白质分子的差异性凝胶色谱法凝胶色谱法原原 理理分离过程分离过程凝胶电
26、泳法凝胶电泳法缓冲溶液缓冲溶液组组 成成作作 用用蛋白质的蛋白质的提取分离提取分离样品处理样品处理粗粗 分分 离离纯纯 化化纯度鉴定纯度鉴定第42页，此课件共47页哦课堂巩固练习课堂巩固练习1 1、使用、使用SDS-SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于质的电泳迁移率完全取决于A A 电荷的多少电荷的多少 B B 分子的大小分子的大小C C 肽链的多少肽链的多少 D D 分子形状的差异分子形状的差异2 2、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是A A 调节调节pH B pH B 维持红细胞的能量供应维持红细胞的能
27、量供应C C 防止微生物生长防止微生物生长 D D 防止血液凝固防止血液凝固第43页，此课件共47页哦3 3、一分子血红蛋白最多可携带的、一分子血红蛋白最多可携带的 O O2 2分子数和分子数和COCO2 2分子数分别是分子数分别是A 4A 4、2 B 42 B 4、4 4 C 2C 2、1 D1 D、1 1、1 14 4、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序层顺序自上而下自上而下是：是：有有机溶剂机溶剂-脂脂类物质类物质-血血红蛋白溶液红蛋白溶液-红红细胞破碎物沉淀细胞破碎物沉淀第44页，此课件共47页哦甲苯层甲苯层（无色透明）（无色透明）脂溶性物
28、质沉淀层脂溶性物质沉淀层(白色薄层固体白色薄层固体)血红蛋白水溶液血红蛋白水溶液(红色透明红色透明)杂质沉淀层杂质沉淀层（暗红色暗红色）血红蛋白溶液离心血红蛋白溶液离心试管中溶液层次试管中溶液层次第45页，此课件共47页哦讨论：讨论：答：让血红蛋白处在稳定的答：让血红蛋白处在稳定的pHpH范围内，维持范围内，维持结构和功能结构和功能1 1、在分离血红蛋白的整个过程中不断用磷酸、在分离血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？缓冲液处理的目的是什么？2 2、血红蛋白有什么特点？这一特点对你进行蛋、血红蛋白有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？白质的分离有什么意义？答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断和收集洗脱液。离时可以通过观察颜色来判断和收集洗脱液。分离过程的分离过程的实验操作实验操作非常直观。非常直观。第46页，此课件共47页哦感谢大家观看第47页，此课件共47页哦