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1、第四部分 浅尝现代生物技术第一页，讲稿共二十五页哦实验目的实验目的 1 1、进行菊花的组织培养、进行菊花的组织培养 2 2、尝试植物激素的应用、尝试植物激素的应用第二页，讲稿共二十五页哦 通过必修课的学习，我们已经了解到大多绿色开花植物都是靠种子来繁殖的。那么，有没有不用种子来培育植物的方法呢？组织培养组织培养营养繁殖营养繁殖扦插扦插嫁接嫁接压条压条 无性繁殖无性繁殖一、基础知识分析一、基础知识分析（一）组织培养的生殖方式（一）组织培养的生殖方式第三页，讲稿共二十五页哦（二）植物组织培养的基本过程（二）植物组织培养的基本过程知识要点知识要点:1.1.细胞分化的概念；细胞分化的概念；2.2.离体
2、植物细胞的脱分化和再分化。离体植物细胞的脱分化和再分化。第四页，讲稿共二十五页哦（三）影响植物组织培养的因素（三）影响植物组织培养的因素 影响植物组织培养的因素有培养基配制、外影响植物组织培养的因素有培养基配制、外植体的选取、消毒、接种、培养、移栽和栽培植体的选取、消毒、接种、培养、移栽和栽培等。等。(1)(1)外植体选取：不同的植物组织外植体选取：不同的植物组织 同一植物的不同材料同一植物的不同材料(2)(2)营养营养(3)(3)环境条件环境条件(pH(pH、温度温度、光照光照)(4)(4)植物激素植物激素(5)(5)消毒消毒第五页，讲稿共二十五页哦（四）生长素与细胞分裂素使用配比对实验结果
3、的影响（四）生长素与细胞分裂素使用配比对实验结果的影响第六页，讲稿共二十五页哦制备制备MS固体培固体培养基养基外植体消毒外植体消毒 接种接种 培培 养养栽培栽培 移移 栽栽二、实验操作二、实验操作 第七页，讲稿共二十五页哦（一）制备（一）制备MSMS固体培养基固体培养基1 1、配制母液、配制母液 按照按照MS培养基成分表培养基成分表,分别配制培养基的母液。分别配制培养基的母液。(1)(1)大量元素母液大量元素母液(10(10倍液倍液)分分别别称称取取1010倍倍用用量量的的各各种种大大量量无无机机盐盐，依依次次溶溶解解于于大大约约800ml800ml热热的的（60-8060-80）蒸蒸馏馏水水
4、中中。（一一种种成成分分完完全全溶溶解解后后再再加加入入下下一一种种，最最后后加水，定容至加水，定容至1000ml1000ml后装入试剂瓶中，冰箱内贮存备用）。后装入试剂瓶中，冰箱内贮存备用）。(2)(2)微量元素母液微量元素母液(100(100倍液倍液)(3)(3)铁盐母液（铁盐母液（100100倍液）倍液）(4)(4)有机物质母液有机物质母液(100(100倍数倍数)(5)(5)生长素母液生长素母液(6)(6)细胞分裂素母液细胞分裂素母液注意注意:配制培养基时，一定要注意调节配制培养基时，一定要注意调节pHpH。第八页，讲稿共二十五页哦MSMS培养基配制方法培养基配制方法第九页，讲稿共二十
5、五页哦你能说出各种营养物质的作用吗？同微生物培养你能说出各种营养物质的作用吗？同微生物培养基的配方相比，基的配方相比，MSMS培养基的配方有哪些明显的不同培养基的配方有哪些明显的不同？微量元素和大量元素提供植物细胞生活所微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的无机盐必需的无机盐；蔗糖提；蔗糖提供供碳源碳源，同时能够，同时能够维持细胞的渗透压维持细胞的渗透压；甘氨酸、维生素等物质主；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的产生的特殊营养需求特殊营养需求。微生物培养基以微生物培养基以有机营养为主有机营
6、养为主。与微生物的培养不同，。与微生物的培养不同，MSMS培培养基则需提供养基则需提供大量无机营养大量无机营养，无机盐混合物包括植物生长必须的大，无机盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素两大类。量元素和微量元素两大类。第十页，讲稿共二十五页哦 (1)(1)取取1000ml1000ml烧烧杯杯一一只只，加加大大量量元元素素1010倍倍母母液液100ml100ml，微微量量元元素素100100倍倍母母液液10ml10ml，铁铁盐盐100100倍倍母母液液10ml,10ml,有有机机物物质质100100倍倍母母液液10ml10ml。此此外外,根根据据培培养养材材料料和和实实验验目目的的还还要
7、要附附加加一一定定量量的的生生长长素素,细细胞胞分分裂裂素素及及蔗蔗糖糖等等,然然后后加加水水至至1000ml,1000ml,待待蔗蔗糖糖充充分分溶溶解解后后用用1mol/L 1mol/L 的的NaOHNaOH或或HClHCl调调酸酸碱碱度度为为pH5.8,pH5.8,最后加入琼脂粉最后加入琼脂粉6.5g,6.5g,如用琼脂条如用琼脂条,则要加则要加8g8g。2.2.培养基配制与分装：培养基配制与分装：(2)(2)将将盛盛有有培培养养基基的的烧烧杯杯在在电电磁磁炉炉上上，煮煮至至琼琼脂脂完完全全融融化化，补补加加蒸馏水至蒸馏水至1000ml1000ml。将将配配制制好好的的培培养养基基分分装装
8、到到培培养养用用三三角角瓶瓶中中，每每只只100ml100ml三三角角瓶约装瓶约装40ml40ml培养基。培养基。分分装装时时要要避避免免把把培培养养基基倒倒在在瓶瓶口口上上，否否则则培培养养时时容容易易引引起起杂菌污染。杂菌污染。第十一页，讲稿共二十五页哦 （1 1）把把装装好好的的培培养养基基的的三三角角瓶瓶放放入入高高压压灭菌锅中，盖好锅盖。灭菌锅中，盖好锅盖。（2 2）设设置置灭灭菌菌温温度度参参数数为为121121，20min20min，开始灭菌。，开始灭菌。3 3、灭菌、灭菌无菌技术是植物组织培养能否获得成功的关键无菌技术是植物组织培养能否获得成功的关键 第十二页，讲稿共二十五页哦
9、（二）外植体（离体组织）消毒（二）外植体（离体组织）消毒注意：注意：对培养材料进行表面灭菌时，一方面要考虑药剂的消毒对培养材料进行表面灭菌时，一方面要考虑药剂的消毒效果；另一方面还要考虑植物材料的耐受能力。不同药剂、不同植物效果；另一方面还要考虑植物材料的耐受能力。不同药剂、不同植物材料，甚至不同器官要区别对待。材料，甚至不同器官要区别对待。1 1、7070酒精中浸泡酒精中浸泡10min10min，无菌水冲洗，无菌水冲洗2 2、5%5%次氯酸钠溶液中浸泡，无菌水冲洗次氯酸钠溶液中浸泡，无菌水冲洗3 3、用另一、用另一5%5%次氯酸钠溶液浸泡次氯酸钠溶液浸泡5min5min，无菌水冲洗，无菌水冲
10、洗4 4、超净台中用无菌水多次冲洗、超净台中用无菌水多次冲洗第十三页，讲稿共二十五页哦（三）切段后接种（三）切段后接种 1 1、先先用用肥肥皂皂洗洗手手，穿穿上上工工作作服服，戴戴上上口口罩罩和和工工作帽。作帽。2 2、放放入入培培养养瓶瓶和和灭灭菌菌后后的的接接种种用用具具(镊镊子子、解解剖剖刀刀、接接种种针针)，把把镊镊子子、解解剖剖刀刀、接接种种针针插插入入内内盛盛70%70%酒精的广口瓶中。酒精的广口瓶中。第十四页，讲稿共二十五页哦 3 3、在在酒酒精精灯灯火火焰焰旁旁，打打开开三三角角瓶瓶，把把花花茎茎用用无无菌菌解解剖剖刀刀切切成成几几段段，每每段段至至少少有有一一张张叶叶片片 4
11、 4、切切段段插插入入培培养养基基，诱诱导导愈愈伤伤组织，盖上封口膜。组织，盖上封口膜。5 5、愈愈伤伤组组织织插插入入生生芽芽培培养养基，盖上封口膜。基，盖上封口膜。6 6、用用记记号号笔笔在在瓶瓶壁壁上上写写明明培培养材料养材料、培养基代号培养基代号、接种日期接种日期。注意事项注意事项 全全部部接接种种操操作作都都是是在在无无菌菌条条件件下下进进行行的的，所所以以要要特特别别认真仔细，以防杂菌污染。认真仔细，以防杂菌污染。第十五页，讲稿共二十五页哦（四）培养（四）培养接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养。培养期接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养。培养期间应定期消毒，温度控制在间应定期消毒，温
12、度控制在55，并且每，并且每日照光日照光4.54.5小时小时 。观察记录生长情况，并照相。观察记录生长情况，并照相存档。存档。2 2-3 3周后将生长健壮的周后将生长健壮的丛状苗丛状苗在无菌条件下一个在无菌条件下一个个转入生根培养基中，在上述条件下继续培养个转入生根培养基中，在上述条件下继续培养第十六页，讲稿共二十五页哦（五）移栽（五）移栽（六）栽培（六）栽培 生根后，将苗移至生根后，将苗移至消毒的草炭土或蛭石中，消毒的草炭土或蛭石中，用玻璃罩或塑料布保持用玻璃罩或塑料布保持80%80%以上湿度，以上湿度，2 2-3 3天天后打开玻璃罩低湿度锻后打开玻璃罩低湿度锻炼炼转移至土中培养转移至土中培
13、养（定植）（定植）第十七页，讲稿共二十五页哦三、结果分析与评价三、结果分析与评价（一）对接种操作中污染情况的分析（一）对接种操作中污染情况的分析接种接种3 34 d4 d后，在接种操作中被杂菌污染的培养物会后，在接种操作中被杂菌污染的培养物会表现出被污染的现象。请学生适时统计污染率，分析接表现出被污染的现象。请学生适时统计污染率，分析接种操作是否符合无菌要求。种操作是否符合无菌要求。第十八页，讲稿共二十五页哦（二）是否完成了对植物组织的脱分化和再分化（二）是否完成了对植物组织的脱分化和再分化观察实验结果，看看是否培养出了愈伤组织，记录多观察实验结果，看看是否培养出了愈伤组织，记录多长时间长出愈
14、伤组织。统计更换培养基后愈伤组织进一长时间长出愈伤组织。统计更换培养基后愈伤组织进一步分化成根和芽的比例和时间。步分化成根和芽的比例和时间。（三）是否进行了统计、对照与记录（三）是否进行了统计、对照与记录做好统计和对照，填好结果记录表，培养严谨的科学态度。从做好统计和对照，填好结果记录表，培养严谨的科学态度。从实验的第一步开始就要求做好实验记录，实验小组配制不同培养实验的第一步开始就要求做好实验记录，实验小组配制不同培养基，如诱导愈伤或直接分化丛芽的培养基，然后做不同配方的比基，如诱导愈伤或直接分化丛芽的培养基，然后做不同配方的比较。较。第十九页，讲稿共二十五页哦（四）生根苗的移栽是否合格（四
15、）生根苗的移栽是否合格生根苗移栽技术的生根苗移栽技术的关键关键是既要充分清洗根系表面的培养是既要充分清洗根系表面的培养基，又不能伤及根系。一般使用无土栽培的办法。培养基质基，又不能伤及根系。一般使用无土栽培的办法。培养基质要提前消毒，可以向培养基质喷洒质量分数为要提前消毒，可以向培养基质喷洒质量分数为5%5%的高锰酸的高锰酸钾，并用塑料薄膜覆盖钾，并用塑料薄膜覆盖12 h12 h。掀开塑料薄膜后。掀开塑料薄膜后24 h24 h才能才能移栽。新移栽的组培苗要在温室过渡几天，等壮苗后再移栽。新移栽的组培苗要在温室过渡几天，等壮苗后再定植大田或进行盆栽。学生可以在课后统计自己移栽的定植大田或进行盆栽
16、。学生可以在课后统计自己移栽的成活率，看看移栽是否合格。成活率，看看移栽是否合格。第二十页，讲稿共二十五页哦四、本课题知识小结四、本课题知识小结 菊菊花花的的组组织织培培养养原理：细胞的全能性原理：细胞的全能性条件条件基础基础概念概念植物组织培养的植物组织培养的基本过程：基本过程：环境因素环境因素（温度、（温度、PH、光照）、光照）外植体的选择外植体的选择营养因素营养因素植株植株根、芽根、芽愈伤愈伤组织组织外植体外植体影响植物组织培影响植物组织培养的因素养的因素植物激素配比植物激素配比实验过程：实验过程：移栽移栽栽培栽培培养培养接种接种外植体外植体消毒消毒制备制备MS培培养基养基第二十一页，讲
17、稿共二十五页哦五、练习五、练习 植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗性差，对培植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗性差，对培养条件的要求较高。用于植物组织培养的培养基同样适合于某养条件的要求较高。用于植物组织培养的培养基同样适合于某些微生物的生长，如些微生物的生长，如一些细菌、真菌等的生长一些细菌、真菌等的生长。而培养物一旦受。而培养物一旦受到微生物的污染，就会导致实验前功尽弃，因此要进行严格的无菌到微生物的污染，就会导致实验前功尽弃，因此要进行严格的无菌操作。操作。外植体的生理状态是成功进行组织培养的重要条件之外植体的生理状态是成功进行组织培养的重要条件之一。生长旺盛的嫩枝生理状况好，容
18、易诱导脱分化和再一。生长旺盛的嫩枝生理状况好，容易诱导脱分化和再分化。分化。在植物组织培养过程中，为什么要进行一系列的消毒，在植物组织培养过程中，为什么要进行一系列的消毒，灭菌，并且要求无菌操作？灭菌，并且要求无菌操作？在选取菊花茎段的时候，为什么要选取生长旺盛的嫩枝？在选取菊花茎段的时候，为什么要选取生长旺盛的嫩枝？第二十二页，讲稿共二十五页哦3 3、不同植物、不同组织的生根和生芽是否都可以使用与本实验相同的生、不同植物、不同组织的生根和生芽是否都可以使用与本实验相同的生长素和细胞分裂素浓度长素和细胞分裂素浓度4 4、本实验用人工合成的激素，而不用植物中存在的天然激素，为什么、本实验用人工合
19、成的激素，而不用植物中存在的天然激素，为什么？5 5、如果在自然界取植物样本进行组织培养，你认为应采取什么措施保证样、如果在自然界取植物样本进行组织培养，你认为应采取什么措施保证样本不被污染？本不被污染？任何植物物种或品种都不可贸然使用与本实验相同的生长素和细胞分裂任何植物物种或品种都不可贸然使用与本实验相同的生长素和细胞分裂素浓度素浓度，必须要套索使用如何合成激素和何种激素浓度才可以。，必须要套索使用如何合成激素和何种激素浓度才可以。学习者可以参考已有文献上成熟的经验，也可以自己探索学习者可以参考已有文献上成熟的经验，也可以自己探索植物中存在的天然激素有相应的使之分解的酶植物中存在的天然激素
20、有相应的使之分解的酶，这样，天然激素在，这样，天然激素在植物体内作用和植物体内作用和存在的时间就较短存在的时间就较短，而，而人工合成的激素在植物中人工合成的激素在植物中没有相应使之分解的酶没有相应使之分解的酶，所以作用和存在时间长，作用效果也更，所以作用和存在时间长，作用效果也更明显。明显。（1 1）操作环境洁净（）操作环境洁净（2 2）植物样本洁净（）植物样本洁净（3 3）操作过程无菌）操作过程无菌因为污染物的来源是操作过程中和植物本身带来的，主要是微生物的污因为污染物的来源是操作过程中和植物本身带来的，主要是微生物的污染，要采用各种措施防止微生物污染，具体做法和操作在微生物培养实染，要采用
21、各种措施防止微生物污染，具体做法和操作在微生物培养实验中已经介绍。除认真消毒除菌外，操作敏捷迅速，也可以降低污染率验中已经介绍。除认真消毒除菌外，操作敏捷迅速，也可以降低污染率第二十三页，讲稿共二十五页哦6 6右图为植物体细胞杂交过程示意图。据图右图为植物体细胞杂交过程示意图。据图回答：回答：（1 1）步骤）步骤是是 ，最常，最常用的方法是用的方法是 。（2 2）步骤）步骤一般常用的化学试剂是一般常用的化学试剂是 ，目的是，目的是 。(3)(3)在利用杂种细胞培育成为杂种植株在利用杂种细胞培育成为杂种植株的过程中，运用的技术手段是的过程中，运用的技术手段是 ，其中步骤，其中步骤相当于相当于 ，步骤，步骤相当于相当于 。（4 4）植物体细胞杂交的目的是获得新的杂）植物体细胞杂交的目的是获得新的杂种植株。使种植株。使 能够在新的能够在新的植物体上有所表现，其根本原因是植物体上有所表现，其根本原因是。去掉细胞壁，分离原生质体去掉细胞壁，分离原生质体酶解法酶解法聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）诱导植物原生质体融合诱导植物原生质体融合植物组织培养植物组织培养脱分化脱分化再分化再分化远缘杂交亲本的遗传特征远缘杂交亲本的遗传特征杂种植株获得双亲的遗传物质杂种植株获得双亲的遗传物质第二十四页，讲稿共二十五页哦感感谢谢大大家家观观看看第二十五页，讲稿共二十五页哦