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1、光化学传感器理论与实践第七章第一页，讲稿共六十九页哦第一节第一节 识别原理识别原理生物修饰传感组成：生物修饰传感组成：由由内传感器内传感器(普通光学波导普通光学波导传感器或化学修饰光化学传感器传感器或化学修饰光化学传感器)和和修饰的生物修饰的生物敏感层敏感层组成。组成。第二页，讲稿共六十九页哦识别原理：识别原理：在生物修饰传感器中，在生物修饰传感器中，修饰的生物敏感层在修饰的生物敏感层在对分析对象进行生物识别对分析对象进行生物识别的同时，能向普通光学波导的同时，能向普通光学波导传感器或化学修饰光化学传感器传感器或化学修饰光化学传感器提供可检测的光学信号提供可检测的光学信号。第三页，讲稿共六十九
2、页哦特点：特点：与分子或离子化学识别相比，生物识别与分子或离子化学识别相比，生物识别有有更高的选择性与灵敏度。更高的选择性与灵敏度。第四页，讲稿共六十九页哦具有生物识别功能的生物物质具有生物识别功能的生物物质生物修饰敏感层生物修饰敏感层目前应用：目前应用：生物修饰敏感层主要涉及生物修饰敏感层主要涉及酶，抗原或抗体酶，抗原或抗体。酶酶微微生生物物抗抗原原或或抗抗体体激激素素抗抗体体结结合合蛋蛋白白植植物物凝凝血血素素第五页，讲稿共六十九页哦酶相关知识酶相关知识酶的定义：酶的定义：是一类具有催化活性的蛋白质分子。是一类具有催化活性的蛋白质分子。活性基团种类：活性基团种类：组氨酸上的组氨酸上的咪唑基
3、咪唑基、丝氨酸上、丝氨酸上的的羟基羟基、半胱氨酸上的、半胱氨酸上的巯基巯基等等酶特点酶特点(优点优点)非常高的催化效率非常高的催化效率非常高的特异性非常高的特异性影影响响酶酶活活性性因因素素环境因素环境因素：pH值影响值影响(最佳：最佳：生理生理pH7.4),抑制剂抑制剂(Ag+、Hg2+、As3+等等)存在使酶失活存在使酶失活活性中心的空间构象：活性中心的空间构象：独特的三维结构独特的三维结构决决定了酶发挥其活性的基础定了酶发挥其活性的基础第六页，讲稿共六十九页哦 酶分子上的亲核基团有酶分子上的亲核基团有Ser-OHSer-OH、Cys-SH、HisHis-咪咪唑基等，这些唑基等，这些富含电
4、子的基富含电子的基团团(有孤对电子有孤对电子)，攻击底，攻击底物分子中电子云密度较小物分子中电子云密度较小的亲电子基团，并供出电的亲电子基团，并供出电子，二者形成共价键，子，二者形成共价键，酶和底物形成一个不稳定的中间物，进而转变为产，进而转变为产物。物。蛋蛋蛋蛋 白白白白 质质质质 中中中中 三三三三 种种种种 主主主主 要要要要 的的的的 亲亲亲亲 核核核核 基基基基 团团团团第七页，讲稿共六十九页哦全酶的结构与分子组成全酶的结构与分子组成全酶全酶酶蛋白酶蛋白活性中心活性中心辅助因子辅助因子蛋蛋白白链链第八页，讲稿共六十九页哦底 物 活性中心以外的必需基团 结合基团 催化基团 活性中心 多
5、肽链图图7-1 酶活性中心示意图酶活性中心示意图底物敏感链 第九页，讲稿共六十九页哦类别功能举例氧化还原酶促进电子或氢转移葡萄糖氧化酶转移酶促进化学基团转移转氨酶水解酶促进水解反应蛋白、淀粉酶裂解酶促进消去反应形成双键碳酸酐酶异构酶促进同分异构体的相互转变 磷酸葡萄糖变化酶连接酶促进键的形成，同时使ATP分子中的高能磷酸键断裂谷氨酰胺合成酶酶的分类酶的分类第十页，讲稿共六十九页哦目前主要限于：目前主要限于：氧化还原酶氧化还原酶，转移酶转移酶。原因：原因：常常伴随有可供光学检测的物质的产生或消耗常常伴随有可供光学检测的物质的产生或消耗;可直接采用普通光学波导传感器作为内传感器器件可直接采用普通光
6、学波导传感器作为内传感器器件;有时酶所催化的化学反应可能不产生或不消耗可供检测的物质，有时酶所催化的化学反应可能不产生或不消耗可供检测的物质，但往往伴随有易于被化学修饰光化学传感器检测的物质（例如但往往伴随有易于被化学修饰光化学传感器检测的物质（例如H、O2、NH3等）的生成与消耗。等）的生成与消耗。酶在光化学传感器中应用酶在光化学传感器中应用第十一页，讲稿共六十九页哦酶分化反应速率方程酶分化反应速率方程(一一)E +S ES P +E (酶酶)(底物底物)(中间物中间物)(产物产物)(酶酶)K1K-1K1葡萄糖葡萄糖(S)己糖激酶己糖激酶(E)复合物复合物(ES)诱导契诱导契合作用合作用例如
7、：例如：第十二页，讲稿共六十九页哦酶分化反应速率方程酶分化反应速率方程(二二)稳态近似法：稳态近似法：米氏方程米氏方程(一一):):米氏方程米氏方程(二二):):第十三页，讲稿共六十九页哦光学波导光学波导内传感器内传感器生物催化层生物催化层底物底物产物产物酶酶图图7-2 酶催化酶催化光化学传感器识别原理光化学传感器识别原理底物底物产物产物样品样品检测器检测器光极光极第十四页，讲稿共六十九页哦识别过程识别过程传质传质扩散扩散底物底物(分析对象分析对象)：样品相：样品相 生物催化层生物催化层产物：生物催化层产物：生物催化层 样品相样品相 稳态响应信号稳态响应信号：产物生成速度恰好等于产物离开生物：
8、产物生成速度恰好等于产物离开生物 层的净速度。层的净速度。分析对象分析对象浓度测定浓度测定根据校正曲线根据校正曲线+稳态响应信号稳态响应信号(快响应快响应)根据校正曲线根据校正曲线+反应速率反应速率(响应时间较长响应时间较长)第十五页，讲稿共六十九页哦免疫反应免疫反应免疫反应免疫反应：当动物体收到外界异性物质（抗原）的侵入时，当动物体收到外界异性物质（抗原）的侵入时，动物体内的免疫系统细胞就会产生一种与这些异性物质动物体内的免疫系统细胞就会产生一种与这些异性物质相对抗的物质（抗体），通过抗体与抗原的结合使抗原相对抗的物质（抗体），通过抗体与抗原的结合使抗原的作用消失。的作用消失。第十六页，讲稿
9、共六十九页哦免疫反应免疫反应抗原：抗原：具有免疫原性与抗原特异性。按来源可分为具有免疫原性与抗原特异性。按来源可分为天然天然抗原抗原、人工抗原人工抗原和和合成原合成原。一般为具有较大分子量的生。一般为具有较大分子量的生物活性物质，例如蛋白质、多糖、核酸等，有时为小分物活性物质，例如蛋白质、多糖、核酸等，有时为小分子活性物质子活性物质(半抗原半抗原)，药物，激素，肽等。，药物，激素，肽等。第十七页，讲稿共六十九页哦免疫反应免疫反应抗体：抗体：是一类称为免疫球蛋白的蛋白质。五种免疫是一类称为免疫球蛋白的蛋白质。五种免疫球蛋白包括球蛋白包括IgG(主要主要)、IgA、IgM、IgD、IgE。第十八页
10、，讲稿共六十九页哦-COOH端端-NH2端端图图7-3 IgG 分子结构示意图分子结构示意图结合抗原结合抗原碎片碎片Fab可结晶可结晶 碎碎片片Fc重链（重链（heavy chain，H链）链）450550个氨基酸残基，分子量约个氨基酸残基，分子量约5575kD。根据根据Ig重链抗原性的差异，重链抗原性的差异，Ig可分为五类可分为五类即即 IgG、IgM、IgA、IgD、IgE，相应相应H链为链为、及及 链。链。第十九页，讲稿共六十九页哦五种免疫球蛋白结构示意图五种免疫球蛋白结构示意图第二十页，讲稿共六十九页哦抗体与抗原的结合力抗体与抗原的结合力非极性非极性作用作用氢键力氢键力作用作用库仑力库
11、仑力作用作用分子间吸分子间吸引力引力立体排立体排斥力斥力通过通过 -NH2 -OH 作作用用通过非极通过非极性侧链作性侧链作用用通过两通过两侧链相侧链相反电荷反电荷吸引吸引通过范德通过范德华力作用华力作用通过结通过结合部电合部电子云互子云互补补抗原抗原-抗体结合抗体结合力的主要贡献力的主要贡献者者抗体识别抗体识别抗原分子抗原分子的基础的基础第二十一页，讲稿共六十九页哦免疫光化学传感器响应免疫光化学传感器响应免疫光化学传感器响应特点：免疫光化学传感器响应特点：与热力学平衡有关与热力学平衡有关第二十二页，讲稿共六十九页哦免疫光化学传感器响应免疫光化学传感器响应抗原抗抗原抗体检测体检测无需标记：无需
12、标记：抗原抗原-抗体结合前后会引起体系荧光强抗体结合前后会引起体系荧光强度或偏振程度的变化而直接被检测。度或偏振程度的变化而直接被检测。需标记：需标记：无光学性质变化，进行荧光标记。无光学性质变化，进行荧光标记。或或第二十三页，讲稿共六十九页哦降低抗原降低抗原-抗体结合力提高光化学传感器的可逆性抗体结合力提高光化学传感器的可逆性措施措施1.1.减少主体溶剂极性降低抗体抗原之间的疏水减少主体溶剂极性降低抗体抗原之间的疏水相互作用从而降低抗原与抗体结合力相互作用从而降低抗原与抗体结合力(消极消极，因为：，因为：结合力发、灵敏度下降结合力发、灵敏度下降)2.2.通过改变测量温度降低结合力的方法通过改
13、变测量温度降低结合力的方法(消极消极)3.3.通过缓释技术，或竞争结合原理可以作成可逆通过缓释技术，或竞争结合原理可以作成可逆响应的光化学传感器响应的光化学传感器(积极积极)第二十四页，讲稿共六十九页哦第七章第七章 生物修饰传感器生物修饰传感器第一节第一节 识别原理识别原理第二节第二节 基于普通光学波导传感器的酶催化传感器基于普通光学波导传感器的酶催化传感器第三节第三节 基于化学修饰传感器的酶催化传感器基于化学修饰传感器的酶催化传感器第四节第四节 基于简单免疫体系的光化学传感器基于简单免疫体系的光化学传感器第五节第五节 基于竞争免疫体系的光化学传感器基于竞争免疫体系的光化学传感器第六节第六节
14、核酸生物修饰传感器核酸生物修饰传感器第二十五页，讲稿共六十九页哦第二节第二节 基于普通光学波导传感器基于普通光学波导传感器 的酶催化传感器的酶催化传感器概念：概念：当酶催化反应直接产生或消耗可供光学检测当酶催化反应直接产生或消耗可供光学检测的物质时，可将相应的酶固定于普通光学波导传的物质时，可将相应的酶固定于普通光学波导传感器的探头上，构成酶催化传感器。感器的探头上，构成酶催化传感器。第二十六页，讲稿共六十九页哦第二节第二节 基于普通光学波导传感器基于普通光学波导传感器 的酶催化传感器的酶催化传感器类型类型(根据检测信号分根据检测信号分)紫外吸收紫外吸收荧光荧光(NADH体系体系)化学发光化学
15、发光(Luminol)第二十七页，讲稿共六十九页哦探测光纤探测光纤信号光纤信号光纤尼龙网尼龙网碱性磷酸脂酶碱性磷酸脂酶+404nm样品样品+酶酶钨灯钨灯例：基于碱性磷酸酯酶的普通光化学传感器例：基于碱性磷酸酯酶的普通光化学传感器基于基于紫外吸收紫外吸收信号检测的酶催化传感器信号检测的酶催化传感器对对-硝基苯基磷酸盐硝基苯基磷酸盐对对-硝基酚硝基酚滤光片404.7nmPMT公共端Anal.Chem.1985,57,565第二十八页，讲稿共六十九页哦基于基于荧光信号荧光信号检测的酶催化传感器检测的酶催化传感器基本上是与辅酶基本上是与辅酶 I(烟酰胺烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸，腺嘌呤二核苷酸，NAD)参
16、加参加的反应联系在一起的反应联系在一起NAD结构式结构式第二十九页，讲稿共六十九页哦关于辅酶关于辅酶 I I分子生物学意义：分子生物学意义：是参与生命体中能量代谢过程的重要是参与生命体中能量代谢过程的重要物质，在反应中主要起递氢作用。物质，在反应中主要起递氢作用。辅酶辅酶I类型类型还原型还原型(NADH)：荧光较强荧光较强 l lEx=360nm,l lEM=460nm氧化型氧化型(NAD)：无荧光无荧光第三十页，讲稿共六十九页哦分析对象固定化酶催化反应文献乳酸、丙酮酸卤酸脱氢酶乳酸+NAD丙酮+NADH7，8葡萄糖葡萄糖脱氢酶葡萄糖+NAD葡萄糖酸内酯+NADH9胆酸羟基类固醇脱氢酶3-羟基
17、胆酸+NAD胆酸酮+DADH10乙醇醇脱氢酶乙醇+NAD乙醛+NADH7，11苹果酸、草酸盐苹果酸脱氢酶苹果酸+NAD草酸盐+NADH12甘油-3-磷酸葡糖-6-磷酸-脱氢酶甘油-3-磷酸+NAD6-磷酸葡萄糖酸内酯+NADH123-羟基-丁酸3-羟基-丁酸脱氢酶3-羟基-丁酸+NAD乙酰乙酸+NADH12辅酶I醇脱氢酶乙醇+NAD乙醛+NADH12睪酮雄（甾）酮羟基类固醇脱氢酶睾酮雄（甾）酮+NAD类固醇+NADH12表表7-3 7-3 检测检测NADHNADH荧光的脱氢酶催化传感器荧光的脱氢酶催化传感器第三十一页，讲稿共六十九页哦与与NADHNADH生成反应耦合生成反应耦合NADHNAD
18、+心肌黄酶心肌黄酶1.与与NADH反应产生更强荧光产物反应产生更强荧光产物刃天青刃天青(无无荧光荧光)9-羟基异吩羟基异吩噁噁唑唑 (强荧光强荧光)灵敏度提高灵敏度提高2倍倍2.与与NADH反应产生紫外可见吸收反应产生紫外可见吸收NADHNAD +噻唑蓝噻唑蓝紫色甲紫色甲臜臜 强吸收强吸收l lmax=558nm 心肌黄酶心肌黄酶第三十二页，讲稿共六十九页哦硫胺素硫胺素+H H2 2O O2 2HRP基于基于其它荧光体系其它荧光体系的酶催化传感器的酶催化传感器基于辣根过氧化酶基于辣根过氧化酶(HRPHRP)催化硫催化硫胺素的胺素的H H2 2O O2 2荧光传感器：荧光传感器：HRP结构示意图
19、结构示意图意义：是继酶催化意义：是继酶催化NADH荧光传感器之后另一种非常有意义的荧光传感器之后另一种非常有意义的酶催化荧光传感器酶催化荧光传感器检测检测H H2 2O O2 2本身；本身；可检测在酶催化反应中生成可检测在酶催化反应中生成H H2 2O O2 2的的生物活性物质生物活性物质(底物底物)硫胺荧硫胺荧(强荧光强荧光)+二硫化硫胺素二硫化硫胺素(无荧光无荧光)第三十三页，讲稿共六十九页哦基于基于化学或生物发光化学或生物发光信号检测的酶催化传感器信号检测的酶催化传感器该传感器的显著特点：该传感器的显著特点：体系只需要通过光学波导器件收集信号光，体系只需要通过光学波导器件收集信号光，可直
20、接将生物催化层修饰在光电检测器上。可直接将生物催化层修饰在光电检测器上。基于化学或生物基于化学或生物发光的酶催化反发光的酶催化反应体系应体系鲁米诺鲁米诺(Luminol)+H(Luminol)+H2 2O O2 2化学发光体系化学发光体系(最经典最经典)ATP-ATP-荧光素荧光素-O-O2 2-荧光素酶生物发光体系荧光素酶生物发光体系NADH-NADH-黄素单核苷酸黄素单核苷酸(FMN)-(FMN)-氧化还原酶氧化还原酶-O-O2 2-荧光荧光素酶生物分化发光体系素酶生物分化发光体系第三十四页，讲稿共六十九页哦鲁米诺鲁米诺(Luminol)+H(Luminol)+H2 2O O2 2化学发光
21、体系化学发光体系许多氧化酶催化的反应伴随有许多氧化酶催化的反应伴随有H H2 2O O2 2产生产生，将氧化酶与过氧化酶固定在将氧化酶与过氧化酶固定在一起可建立灵敏的化学发光酶催化传感器，用于检测底物，一起可建立灵敏的化学发光酶催化传感器，用于检测底物，如：尿如：尿酸、氨基酸、乳酸、葡萄糖、胆固醇、胺类、丙酮酸等。酸、氨基酸、乳酸、葡萄糖、胆固醇、胺类、丙酮酸等。第三十五页，讲稿共六十九页哦ATP-ATP-荧光素荧光素-O-O2 2-荧光素酶生物发光体系荧光素酶生物发光体系ATP+ATP+荧光素荧光素 +O+O2 2 AMP+AMP+氧化荧光素氧化荧光素 +PPi+CO+PPi+CO2 2荧光
22、素酶荧光素酶 hn n(l lmax=560 nm560 nm)应用：应用：检测检测ATPATP，DL=10DL=10-10-10 molL molL-1-1其它有其它有ATPATP参与的代谢过程所涉及的反应物参与的代谢过程所涉及的反应物由由BlumBlum等人提出等人提出(Anal.Chim.Acta,1989,227,387)第三十六页，讲稿共六十九页哦NADH-NADH-黄素单核苷酸黄素单核苷酸(FMN)-(FMN)-氧化还原酶氧化还原酶-O-O2 2-荧光素酶荧光素酶生物催化发光体系生物催化发光体系NADH+H+FMNNAD+FMNH2氧化还原酶氧化还原酶FMNH2+RCHO+O2FM
23、N+RCOOH+H2O荧光素酶荧光素酶hn n(l lmax=490nm)第三十七页，讲稿共六十九页哦应用应用测定辅酶测定辅酶I(NADH)：C.Haggerty et.al.,Anal.Biochem.,88,162(1978)检测其它底物检测其它底物：与相应底物脱氢酶耦合后，参与递氢：与相应底物脱氢酶耦合后，参与递氢作用的辅酶作用的辅酶I起指示物质的作用起指示物质的作用L.J.Blum et.al.,Anal.Lett.,21,717(1988)第三十八页，讲稿共六十九页哦第七章第七章 生物修饰传感器生物修饰传感器第一节第一节 识别原理识别原理第二节第二节 基于普通光学波导传感器的酶催化传
24、感器基于普通光学波导传感器的酶催化传感器第三节第三节 基于化学修饰传感器的酶催化传感器基于化学修饰传感器的酶催化传感器第四节第四节 基于简单免疫体系的光化学传感器基于简单免疫体系的光化学传感器第五节第五节 基于竞争免疫体系的光化学传感器基于竞争免疫体系的光化学传感器第六节第六节 核酸生物修饰传感器核酸生物修饰传感器第三十九页，讲稿共六十九页哦第三节第三节 基于化学修饰传感器的酶催化传感器基于化学修饰传感器的酶催化传感器第四十页，讲稿共六十九页哦技术产生背景技术产生背景 有些酶催化的反应不产生或不消耗可直接光学检测的物有些酶催化的反应不产生或不消耗可直接光学检测的物质，但涉及质，但涉及质子质子的
25、产生与消耗、的产生与消耗、氧气氧气的产生与消耗、酸性的产生与消耗、酸性或碱性气体或碱性气体(CO2或或NH3)产生与消耗。这些物质很容易被化学产生与消耗。这些物质很容易被化学修饰光化学传感器所检测，故可采用相应化学修饰光化学传感修饰光化学传感器所检测，故可采用相应化学修饰光化学传感器作内传感器构建酶催化传感器。器作内传感器构建酶催化传感器。第四十一页，讲稿共六十九页哦常用的内传感器种类常用的内传感器种类氧光化学传感器为内传感器；氧光化学传感器为内传感器；CO2光化学传感器为内传感器；光化学传感器为内传感器；NH3光化学传感器为内传感器。光化学传感器为内传感器。第四十二页，讲稿共六十九页哦氧光化
26、学传感器氧光化学传感器为基础光极的酶催化传感器为基础光极的酶催化传感器传感器的结构与原理：传感器的结构与原理：以测量葡萄糖为例以测量葡萄糖为例第四十三页，讲稿共六十九页哦葡萄糖葡萄糖样品样品光学波导光学波导O2 敏感荧光试剂敏感荧光试剂葡萄糖葡萄糖葡萄糖酸葡萄糖酸氧化酶氧化酶葡萄糖酸葡萄糖酸O2O2O2气透膜气透膜生物催化层生物催化层探测光探测光激发激发信号光信号光发射发射尼龙网尼龙网+图图7-5 7-5 氧光化学传感器为基础光极的氧光化学传感器为基础光极的葡萄糖生物传感器葡萄糖生物传感器内内传传感感器器氧氧光光学学传传感感器器第四十四页，讲稿共六十九页哦传感器的特性传感器的特性样品中葡萄的浓
27、度越大，传感器的荧光强度信号越样品中葡萄的浓度越大，传感器的荧光强度信号越大；大；检测范围检测范围0.1 20 mmol/L；响应时间几分钟之内。响应时间几分钟之内。第四十五页，讲稿共六十九页哦氨气酶光极氨气酶光极传感器为基础传感器的酶传感器为基础传感器的酶催化传感器催化传感器传感器的结构与原理：传感器的结构与原理：以测量尿素为例以测量尿素为例NH2CONH2(尿素尿素)+H2O2NH3+CO2脲酶脲酶第四十六页，讲稿共六十九页哦底物底物样品样品光学波导光学波导底物底物NH3脱氨酶脱氨酶NH3气透膜气透膜生物催化层生物催化层探测光探测光信号光信号光图图7-6 7-6 以氨气酶光极为基础传感器的
28、以氨气酶光极为基础传感器的酶催化传感器酶催化传感器内内传传感感器器氨氨气气敏敏光光极极NH3酶支持膜酶支持膜HINDH+IND-+NH4+H+化学修饰层化学修饰层厚度(m)第四十七页，讲稿共六十九页哦传感器的特性传感器的特性尿素的浓度越大，产生的尿素的浓度越大，产生的NH3气气越多，使内感器的越多，使内感器的吸收或荧光信号变化越明显；吸收或荧光信号变化越明显；检测范围检测范围510-5 110-2 mol/L，DL=510-5 mol/L；响应时间约响应时间约7分钟。分钟。第四十八页，讲稿共六十九页哦第七章第七章 生物修饰传感器生物修饰传感器第一节第一节 识别原理识别原理第二节第二节 基于普通
29、光学波导传感器的酶催化传感器基于普通光学波导传感器的酶催化传感器第三节第三节 基于化学修饰传感器的酶催化传感器基于化学修饰传感器的酶催化传感器第四节第四节 基于简单免疫体系的光化学传感器基于简单免疫体系的光化学传感器第五节第五节 基于竞争免疫体系的光化学传感器基于竞争免疫体系的光化学传感器第六节第六节 核酸生物修饰传感器核酸生物修饰传感器第四十九页，讲稿共六十九页哦第四节第四节 基于简单免疫体系的光化学传感器基于简单免疫体系的光化学传感器第五十页，讲稿共六十九页哦1.体系体系:一一对应的免疫体系；一一对应的免疫体系；适用范围适用范围2.抗原抗体要有荧光活性：抗原抗体要有荧光活性：n有内源荧光的
30、抗体（或抗原）：有内源荧光的抗体（或抗原）：许多抗体或抗原的多肽链许多抗体或抗原的多肽链含有荧光活性的氨基酸残基础，如：含有荧光活性的氨基酸残基础，如：苯丙氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。色氨酸。第五十一页，讲稿共六十九页哦n荧光标记后的抗体（或抗原）荧光标记后的抗体（或抗原）对标记物的要求：对标记物的要求：(1)稳定；稳定；(2)荧光发射光谱与背景荧光有明显差别；荧光发射光谱与背景荧光有明显差别；(3)高荧光量子产率；高荧光量子产率；(4)大的大的Stokes位移；位移；(5)有合适的与抗原或抗体连接的法；有合适的与抗原或抗体连接的法；(6)不影响抗原不影响抗原-抗体结合反应。抗体结
31、合反应。第五十二页，讲稿共六十九页哦 主要基于抗原主要基于抗原-抗体作用前后荧光强度的变化：抗体作用前后荧光强度的变化：n非辐射荧光能量转移：荧光熄灭非辐射荧光能量转移：荧光熄灭 例：半抗原例：半抗原2,4-二硝基苯二硝基苯(DNP)DNP-赖氨酸赖氨酸 +抗体抗体 DNP-赖氨酸赖氨酸/抗体抗体(有荧光活性有荧光活性)(无荧光活性无荧光活性)简单免疫荧光分析原理简单免疫荧光分析原理第五十三页，讲稿共六十九页哦n辐射荧光能量转移：荧光增强辐射荧光能量转移：荧光增强例：二甲氨基萘例：二甲氨基萘-5-磺酰磺酰(DANS)DANS-赖氨酸赖氨酸 +抗体抗体 DANS-赖氨酸赖氨酸/抗体抗体(有荧光活
32、性有荧光活性)(强荧光活性强荧光活性)荧光强度增加荧光强度增加25-30倍倍n抗原抗体结合前后微环境变化引起荧光增强度变化抗原抗体结合前后微环境变化引起荧光增强度变化第五十四页，讲稿共六十九页哦构建基于简单免疫体系的光化学传感器构建基于简单免疫体系的光化学传感器1.采用荧光标记物的简单免疫体系构造光化学传感采用荧光标记物的简单免疫体系构造光化学传感F.V.Bright et al.,Anal.Chem.,62,1065(1990)第五十五页，讲稿共六十九页哦光纤光纤端部端部HSA：人血清白蛋白人血清白蛋白Fab：抗人血清白蛋白抗抗人血清白蛋白抗体碎片体碎片荧光试剂荧光试剂：丹酰氯：丹酰氯Fab
33、 与与HSA结合后使荧光标记物的结合后使荧光标记物的微环境改变微环境改变，荧光增强荧光增强KSCN溶液能将溶液能将Fab 与与HSA分开，从而使传感器再生。分开，从而使传感器再生。第五十六页，讲稿共六十九页哦2.酶联免疫光化学传感酶联免疫光化学传感T.Vo-Dinh et al.,Appl.Spectrosc.,40,696(1986)非荧光物质：与磷酸根相结合的非荧光物质：与磷酸根相结合的4-甲基伞形酮甲基伞形酮与抗体结合的酶：碱性磷酸酯酶与抗体结合的酶：碱性磷酸酯酶酶催化分解产物：酶催化分解产物：4-甲基伞形酮酶，强荧光活性甲基伞形酮酶，强荧光活性第五十七页，讲稿共六十九页哦EEEEEEE
34、E激发激发发射发射酶催化反应酶催化反应固定在池壁上的待测抗原固定在池壁上的待测抗原非荧光酶底物非荧光酶底物E酶联抗体酶联抗体酶催化产生的荧光活性物质酶催化产生的荧光活性物质激发态的荧光活性物质激发态的荧光活性物质图图7-9 7-9 酶联免疫荧光传感器原理示意图酶联免疫荧光传感器原理示意图第五十八页，讲稿共六十九页哦定量分析的依据：定量分析的依据：样品中抗原浓度越大，结合酶联抗体就越多，催化水样品中抗原浓度越大，结合酶联抗体就越多，催化水解产生的游离解产生的游离4-甲基伞形酮越多，强荧光强度越强。甲基伞形酮越多，强荧光强度越强。第五十九页，讲稿共六十九页哦第七章第七章 生物修饰传感器生物修饰传感
35、器第一节第一节 识别原理识别原理第二节第二节 基于普通光学波导传感器的酶催化传感器基于普通光学波导传感器的酶催化传感器第三节第三节 基于化学修饰传感器的酶催化传感器基于化学修饰传感器的酶催化传感器第四节第四节 基于简单免疫体系的光化学传感器基于简单免疫体系的光化学传感器第五节第五节 基于竞争免疫体系的光化学传感器基于竞争免疫体系的光化学传感器第六节第六节 核酸生物修饰传感器核酸生物修饰传感器第六十页，讲稿共六十九页哦第五节第五节 基于竞争免疫体系的光化学传感器基于竞争免疫体系的光化学传感器第六十一页，讲稿共六十九页哦原理：原理：Optode-Ag+Ab*+Ab Optode-Ag-Ab*+Op
36、tode-Ag-Ab Optode-Ab+Ag*+Ag Optode-Ab-Ag*+Optode-Ab-Ag 或或样品中待测样品中待测Ag(或或Ab)越多，结合到光极探头上的标记越多，结合到光极探头上的标记物抗原物抗原Ag*(或标记抗体或标记抗体Ab*)越少，传感器的荧光强度越少，传感器的荧光强度越低。越低。第六十二页，讲稿共六十九页哦有可逆响应的葡萄糖免疫光化学传感器有可逆响应的葡萄糖免疫光化学传感器J.S.Schultz et al.,Diabetes Care,5,245(1982)第一个真正有可逆响应的免疫光化学传感器。第一个真正有可逆响应的免疫光化学传感器。所有基于荧光标记竞争的免疫
37、体系均可以按此设计思想所有基于荧光标记竞争的免疫体系均可以按此设计思想制成有可逆响应的光化学传感器。制成有可逆响应的光化学传感器。第六十三页，讲稿共六十九页哦激激发发发发射射葡萄糖葡萄糖荧光素标记的葡聚糖荧光素标记的葡聚糖固定化刀豆球蛋白固定化刀豆球蛋白激发态荧光素标记葡聚糖激发态荧光素标记葡聚糖样品样品光纤渗析管图图7-11 有可逆响应的葡萄糖免疫光化学传感器有可逆响应的葡萄糖免疫光化学传感器第六十四页，讲稿共六十九页哦基于荧光能量转移的竞争免疫传感器基于荧光能量转移的竞争免疫传感器原理：原理：当对抗原和抗体标记不同荧光物质时，若一个标记物当对抗原和抗体标记不同荧光物质时，若一个标记物的荧光
38、发射光谱与另一个标记物的荧光吸收光谱重叠则抗的荧光发射光谱与另一个标记物的荧光吸收光谱重叠则抗原与抗体结合的同时可能发生荧光能量转移。原与抗体结合的同时可能发生荧光能量转移。第六十五页，讲稿共六十九页哦hn nhn n标记标记1标记标记2AgAb能量转移能量转移Ag-Ab荧光能量转移的结果：荧光能量转移的结果：一个标记物的荧光消失，另下标记物一个标记物的荧光消失，另下标记物的荧光能量增强。的荧光能量增强。荧光能量转移图示荧光能量转移图示第六十六页，讲稿共六十九页哦应用应用1.测葡萄糖：测葡萄糖：Schultz et al.,Talanta,35,145(1988)Ag：葡聚糖：葡聚糖(半抗原半
39、抗原)；标记物：荧光素异硫氰酸酯标记物：荧光素异硫氰酸酯(FITC)。Ab：刀豆球蛋白：刀豆球蛋白A；标记物：罗丹明标记物：罗丹明(Rh)。葡萄糖浓度葡萄糖浓度，游离的，游离的Ag-FITC浓度浓度，FITC荧光荧光，Ag-Ab-Rh荧光荧光第六十七页，讲稿共六十九页哦第六节第六节 核酸生物修饰传感器核酸生物修饰传感器 核酸：核酸：是生命现象中不可缺少的生物大分子，也是生物是生命现象中不可缺少的生物大分子，也是生物遗传信息的载体，它控制着蛋白质的合成和有机体细胞遗传信息的载体，它控制着蛋白质的合成和有机体细胞的机能。的机能。第六十八页，讲稿共六十九页哦第七章第七章 生物修饰传感器生物修饰传感器第一节第一节 识别原理识别原理第二节第二节 基于普通光学波导传感器的酶催化传感器基于普通光学波导传感器的酶催化传感器第三节第三节 基于化学修饰传感器的酶催化传感器基于化学修饰传感器的酶催化传感器第四节第四节 基于简单免疫体系的光化学传感器基于简单免疫体系的光化学传感器第五节第五节 基于竞争免疫体系的光化学传感器基于竞争免疫体系的光化学传感器第六节第六节 核酸生物修饰传感器核酸生物修饰传感器第六十九页，讲稿共六十九页哦