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1、半薄与超薄切片现在学习的是第1页，共22页第一节第一节 超薄切片超薄切片专用于透射电子显微镜标本的制备专用于透射电子显微镜标本的制备现在学习的是第2页，共22页透射电镜透射电镜透射电镜是观察细胞及亚细胞结构的重要手段透射电镜是观察细胞及亚细胞结构的重要手段：我们所获得的关于细胞、细胞器、：我们所获得的关于细胞、细胞器、细胞内大分子的形态信息大多由它提供细胞内大分子的形态信息大多由它提供透射电镜的样品制备中，超薄切片技术是最基本、最常用的制备技术。透射电镜的样品制备中，超薄切片技术是最基本、最常用的制备技术。现在学习的是第3页，共22页高尔基体高尔基体Chloroplast of tobacco
2、:1=cell wall2=cytoplasm3=vacuole4=chloroplast envelope 叶绿体被膜5=tonoplast液泡膜6=plasma membrane质膜7=grana叶绿体基粒 8=stroma thylakoids类囊体9=starch grains淀粉粒10=stroma基质 叶绿体叶绿体现在学习的是第4页，共22页内质网内质网线粒体线粒体酶体酶体现在学习的是第5页，共22页超薄切片超薄切片植物细胞的大小植物细胞的大小 直径多为直径多为25-50um25-50um之间。之间。最小：球菌直径最小：球菌直径0.5um0.5um。最大：苎麻纤维细胞长最大：苎麻纤
3、维细胞长550mm550mm。超薄切片厚度是超薄切片厚度是50-70nm1细胞细胞=350-1000张切片张切片透射电镜样品制备中，由于透射电镜产生的电子束穿透能力很弱，必须把透射电镜样品制备中，由于透射电镜产生的电子束穿透能力很弱，必须把标本切成厚度小于标本切成厚度小于0.1um0.1um以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片。以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片。切片厚度切片厚度:50-70nm:50-70nm 制作程序与石蜡切片相似制作程序与石蜡切片相似,只是包埋剂不同只是包埋剂不同(环氧树脂环氧树脂),),切片方法不同切片方法不同现在学习的是第6页，共22页超薄切片制作程序超薄切片制
4、作程序一一.取材的基本要求取材的基本要求为保持细胞结构的生前状态为保持细胞结构的生前状态,必须做到快、小、准、冷必须做到快、小、准、冷(1)(1)快快:最短时间内最短时间内(争取在争取在1min1min内内)投入固定液。投入固定液。(2)(2)小小:体积要小体积要小(一般不超过一般不超过1mm1mm1mm)1mm1mm1mm)。固定剂的渗透能力较弱；如果块大，内部不能得到良好的固定。固定剂的渗透能力较弱；如果块大，内部不能得到良好的固定。(3)(3)准准:取材部位要准确。取材部位要准确。(4)(4)冷冷:低温低温(0(04)4)操作操作,以降低酶的活性以降低酶的活性,防止细胞自溶。防止细胞自溶
5、。与石蜡切片相似与石蜡切片相似,经取材、固定、脱水、浸透、包埋聚合、切片及染经取材、固定、脱水、浸透、包埋聚合、切片及染色等步骤。色等步骤。现在学习的是第7页，共22页二二.固定固定1.固定剂固定剂四氧化锇四氧化锇:对多细胞结构蛋白对多细胞结构蛋白,脂肪脂肪,脂蛋白的固定效果好。有强烈的脂蛋白的固定效果好。有强烈的电子染色作用电子染色作用,固定样固定样品图象反差较好。品图象反差较好。戊戊 二二 醛醛:穿透力比四氧化锇强穿透力比四氧化锇强.糖原、微管、核蛋白的固定效果比锇酸好糖原、微管、核蛋白的固定效果比锇酸好.对脂类的保对脂类的保存能力很差存能力很差,没有电子染色作用没有电子染色作用。电子染色
6、原理电子染色原理 某些某些重金属盐重金属盐（铀、铅等）（铀、铅等）与组织细胞中某些成分结合或被组织吸附与组织细胞中某些成分结合或被组织吸附,重金属的原重金属的原子对电子束形成散射子对电子束形成散射,从而提高图象的反差。从而提高图象的反差。拟南介小孢子母细胞拟南介小孢子母细胞现在学习的是第8页，共22页二二.固定固定2.固定方法固定方法:戊二醛戊二醛锇酸双重固定法锇酸双重固定法 分预固定和后固定分预固定和后固定,中间用磷酸缓冲液漂洗中间用磷酸缓冲液漂洗.这样可以相互补充这样可以相互补充,使细胞的细微结构得到很好的保存。使细胞的细微结构得到很好的保存。步骤步骤:前固定用前固定用2.5%戊二醛固定戊
7、二醛固定2小时、后固定用小时、后固定用1%锇酸固定锇酸固定12小时，小时，脱水。缓冲液漂洗脱水。缓冲液漂洗20min现在学习的是第9页，共22页三三.脱水脱水常用脱水剂常用脱水剂:乙醇、丙酮乙醇、丙酮梯度脱水梯度脱水 四四.过渡过渡环氧丙烷环氧丙烷:相当于石蜡切片中的透明剂二甲苯。相当于石蜡切片中的透明剂二甲苯。五五.浸透和包埋浸透和包埋(一一)浸透浸透 利用包埋剂渗入到组织内部取代脱水剂。利用包埋剂渗入到组织内部取代脱水剂。步骤步骤:环氧树脂环氧树脂+无水乙醇无水乙醇(1:1)(1:1)中中1212小时小时环氧树脂环氧树脂2424小时小时(二二)包埋剂包埋剂 环氧树脂环氧树脂:高分子聚合物高
8、分子聚合物,单体状态时单体状态时(聚合前聚合前)为液体、能够渗为液体、能够渗 入组织入组织内内;当加入硬化剂和经加温后当加入硬化剂和经加温后,聚合成固体聚合成固体现在学习的是第10页，共22页包埋剂包埋剂:环氧树脂环氧树脂硬化剂硬化剂:酸酐类酸酐类,与环氧树脂起交联作用与环氧树脂起交联作用,并被吸收到树脂链中并被吸收到树脂链中 十二烷基琥珀酸酐十二烷基琥珀酸酐(DDSA),六甲酸酐六甲酸酐(MNA),顺丁烯二酸酐顺丁烯二酸酐加速剂加速剂:引起环氧树脂末端环氧基相连，形成首尾相接的长链状引起环氧树脂末端环氧基相连，形成首尾相接的长链状 聚聚合物合物,加速包埋剂的凝固速度加速包埋剂的凝固速度。2,
9、4,6三三(二甲氨基甲基苯酚二甲氨基甲基苯酚)(简称简称DMP(30)、二乙基苯胺及乙二胺、二乙基苯胺及乙二胺增塑剂增塑剂:使包埋块具有适当的韧性，改善包埋块的切割性能。使包埋块具有适当的韧性，改善包埋块的切割性能。邻苯二甲酸二丁酯邻苯二甲酸二丁酯(简称简称DBP)环氧树脂包埋剂的配方环氧树脂包埋剂的配方 现在学习的是第11页，共22页包埋步骤包埋步骤 1.1.组织块包埋在环氧树脂包埋模板中，组织块包埋在环氧树脂包埋模板中，2.2.置烤箱烘干，置烤箱烘干，3.3.经经45(1245(12小时小时)、60(3660(36小时小时)后，即可聚合硬化，后，即可聚合硬化，形成包埋块。形成包埋块。包埋操
10、作中注意事项包埋操作中注意事项(1)(1)干燥干燥:所有试剂要防潮所有试剂要防潮,所用器皿应烘干；所用器皿应烘干；(2)(2)搅拌搅拌:配包埋剂时，每加入一种试剂要搅拌均匀；配包埋剂时，每加入一种试剂要搅拌均匀；(3)(3)包埋时动作轻巧，防止产生气泡；包埋时动作轻巧，防止产生气泡；(4)(4)皮肤尽量不要接触包埋剂，以免引起皮炎；皮肤尽量不要接触包埋剂，以免引起皮炎；现在学习的是第12页，共22页药用胶囊：最好用药用胶囊：最好用1号号(直径直径6.3mm)或或2号号(直径直径5.6mm)包埋步骤包埋步骤:a.取载玻片硬纸盒作为支架，用打孔器在纸盒的盖上钻若干排孔，孔的直径比胶囊略取载玻片硬纸
11、盒作为支架，用打孔器在纸盒的盖上钻若干排孔，孔的直径比胶囊略小。小。b.然后将胶囊插入孔内，胶囊的底部悬空。然后将胶囊插入孔内，胶囊的底部悬空。c.打开胶囊盖子，用滴管将包埋剂加入胶囊内至打开胶囊盖子，用滴管将包埋剂加入胶囊内至3/4的位置，然后小心地将材料连的位置，然后小心地将材料连同少许包埋混合液移入胶囊内，待材料下沉到胶囊底部后，用一只细的清洁同少许包埋混合液移入胶囊内，待材料下沉到胶囊底部后，用一只细的清洁铜丝调整材料的方位，盖上胶囊盖。铜丝调整材料的方位，盖上胶囊盖。d.但在加盖之前，必须把盖的圆顶端压凹，这样可以避免空气停留在盖的顶端，因为氧气会阻但在加盖之前，必须把盖的圆顶端压凹
12、，这样可以避免空气停留在盖的顶端，因为氧气会阻碍环氧树脂凝固。碍环氧树脂凝固。e.最后将载有胶囊的纸盒放进温箱中，按最后将载有胶囊的纸盒放进温箱中，按45 12小时、小时、60 36小时的顺序升温聚合。小时的顺序升温聚合。参考参考:材料的包埋材料的包埋现在学习的是第13页，共22页六六.切片切片(一一)准备工作准备工作 1.修块修块:解剖显微镜下解剖显微镜下,削去表面的包埋剂削去表面的包埋剂,露出组织露出组织;2.半薄切片定位半薄切片定位:切厚度为切厚度为1m-10m的切片的切片,染色染色,光学显微镜光学显微镜 观察定位观察定位;3.修整修整:定位以后定位以后,对包埋块作进一步的修整。顶端金字
13、塔形对包埋块作进一步的修整。顶端金字塔形,顶面梯形顶面梯形,每边长度每边长度0.2mm0.3mm。半薄切片进行光学显微镜观察的目的：半薄切片进行光学显微镜观察的目的：(1)定位定位:确定所要观察的范围确定所要观察的范围,保留观察的部分保留观察的部分,修去其余部分修去其余部分;(2)对同一组织的同一部位进行光学显微镜和电镜的对比观察对同一组织的同一部位进行光学显微镜和电镜的对比观察。4.制刀制刀:玻璃刀，钻石刀玻璃刀，钻石刀-制刀机制刀机 5载网和支持膜载网和支持膜 5.1 载网载网铜网，圆形、直径铜网，圆形、直径3mm。网孔数目。网孔数目100、200、300目等目等;5.2 支持膜支持膜聚乙
14、烯醇缩甲醛膜聚乙烯醇缩甲醛膜,载网上覆盖一层载网上覆盖一层,厚度厚度10nm20nm。现在学习的是第14页，共22页(二二)切片切片(1)安装包埋块；安装包埋块；(2)安装玻璃刀；安装玻璃刀；(3)调节刀与组织块的距离；调节刀与组织块的距离；(4)调节水槽液面调节水槽液面高度与灯光位置；高度与灯光位置；(5)调节加热电流及切片速度；调节加热电流及切片速度；(6)切片。切片。(三三)展片展片当有皱缩的切片浮在槽液时当有皱缩的切片浮在槽液时,用一小块滤纸浸少量氯仿用一小块滤纸浸少量氯仿,接近切片接近切片,以这种蒸气熏以这种蒸气熏之之,使切片展开。使切片展开。(四四)捞片捞片将切片捞在有支持膜的载网
15、上。将切片捞在有支持膜的载网上。直径直径3mm现在学习的是第15页，共22页七七.染色染色(电子染色电子染色)原原 理理:重金属盐与组织细胞中某些成分结合或被组织吸附重金属盐与组织细胞中某些成分结合或被组织吸附,电镜观察时重金属的原子对电电镜观察时重金属的原子对电子束形成散射子束形成散射,从而提高图象的反差。从而提高图象的反差。常用染色剂常用染色剂:醋酸铀和柠檬酸铅醋酸铀和柠檬酸铅 染色方法染色方法a.组织块染色组织块染色:脱水至脱水至70%乙醇乙醇,组织块放在用组织块放在用70%乙醇配制的饱和醋酸乙醇配制的饱和醋酸 铀溶铀溶液中液中,染色染色2h以上以上,或冰箱中过夜。或冰箱中过夜。b.切切
16、 片片 染染 色色:溶解石蜡制作蜡板溶解石蜡制作蜡板,蜡板上滴数滴柠檬酸铅染液蜡板上滴数滴柠檬酸铅染液,载网浮在液滴上载网浮在液滴上(贴有切片贴有切片的一面朝下的一面朝下),盖上培养皿盖上培养皿,染色染色10-20min.载网从染液中取出后,必须尽快用蒸馏水清洗干净.八八.电镜观察、拍片、记录电镜观察、拍片、记录现在学习的是第16页，共22页取材、固定、脱水、浸透、包埋聚合、切片及染色取材、固定、脱水、浸透、包埋聚合、切片及染色超薄切片技术步骤过程图超薄切片技术步骤过程图 现在学习的是第17页，共22页第二节第二节 半薄切片半薄切片现在学习的是第18页，共22页半薄切片法半薄切片法可供光学显微
17、镜观察研究的塑料切片技术；可供光学显微镜观察研究的塑料切片技术；制片方法与超薄切片相同，但制片方法与超薄切片相同，但切片厚度约在切片厚度约在0.5-2.0um，介于石蜡切片与，介于石蜡切片与超薄切片之间；超薄切片之间；效果比石蜡切片好效果比石蜡切片好:较薄，能较好的保存细胞的结构，减少人为假象，比较薄，能较好的保存细胞的结构，减少人为假象，比石蜡切片清晰。石蜡切片清晰。常用包埋剂：乙二醇丙烯酸酯常用包埋剂：乙二醇丙烯酸酯(GMA)与环氧树脂与环氧树脂现在学习的是第19页，共22页一、乙二醇丙烯酸酯一、乙二醇丙烯酸酯(GMA)制片技术制片技术1.水溶性塑料包埋剂水溶性塑料包埋剂-凝固后可被切成凝
18、固后可被切成0.5-2um的半薄切片的半薄切片 2.染色时无须去包埋剂染色时无须去包埋剂3.可在低温下凝固可在低温下凝固(紫外光照射紫外光照射)4.单体分子渗透性强单体分子渗透性强,凝固时仅是把结构分子支撑和包围起来凝固时仅是把结构分子支撑和包围起来,并不与结构分子形成并不与结构分子形成共价键共价键5.清晰度高、保存结构完整性好清晰度高、保存结构完整性好6.可做组织化学、酶活性和荧光显微观察可做组织化学、酶活性和荧光显微观察(一一)GMA的性质的性质现在学习的是第20页，共22页 GMA只有与增塑剂及加速剂混合才能用于制片只有与增塑剂及加速剂混合才能用于制片增塑剂增塑剂:控制包埋块硬度控制包埋
19、块硬度 加速剂加速剂:加速包埋剂凝固，也可以控制硬度加速包埋剂凝固，也可以控制硬度配方配方:GMA93g聚乙二醇聚乙二醇400(增塑剂增塑剂)7g过氧化苯酰过氧化苯酰(加速剂加速剂)0.6g(二二)GMA包埋剂的配方包埋剂的配方现在学习的是第21页，共22页1.固定固定 常采用戊二醛和四氧化锇双重固定法常采用戊二醛和四氧化锇双重固定法 固定方法与超薄切片一样固定方法与超薄切片一样 2.清洗清洗 用用0.1M 磷酸缓冲液洗涤磷酸缓冲液洗涤3-4次次3.脱水脱水 梯度乙醇至梯度乙醇至100%4.渗透渗透 GMA包埋剂包埋剂,0-4下两天以上，换两次。下两天以上，换两次。(三三)GMA制片过程制片过程与超薄切片相似与超薄切片相似,经取材、固定、清洗、脱水、渗透、包埋聚合、切片及染色等步骤。经取材、固定、清洗、脱水、渗透、包埋聚合、切片及染色等步骤。现在学习的是第22页，共22页