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1、分子生物学基础第二章第一页，讲稿共四十八页哦第一节第一节染色体染色体 一、染色体概述一、染色体概述 染色体在不同的细胞周期有不同的形态表现。在细胞大部分时间的分裂间期表现为染色质(chromatin)。染色质是细胞核内可以被碱性染料着色的一类非定形物质。它以双链DNA为骨架，与组蛋白(hilston)、非组蛋白(non-histon)以及少量的各种RNA等共同组成丝状结构。在染色质中，DNA和组蛋白的组成非常稳定，非组蛋白和RNA随细胞生理状态不同而有变化。在细胞分裂期，染色质纤丝经多级螺旋化形成一种有固定形态的复杂的立体结构的染色体。染色体只在细胞分裂期，人们才能在光学显微镜下观察到这些结构
2、。它们存在于细胞核，呈棒状的可染色结构，故称为染色体。细胞分裂时，每条染色体都复制生成一条与母链完全一样的链，形成同源染色体对。作为遗传物质，染色体具有以下特征：分子结构相对稳定；能够自我复制，使亲代、子代之间保持连续性；能够指导蛋白质的合成；能够产生可遗传的变异。第二页，讲稿共四十八页哦第一节第一节染色体染色体 二、原核生物的染色体1细菌染色体形态结构 大肠杆菌染色体长为1333m，而要装入长约2m宽1m的细胞中，为此DNA必定以折叠或螺旋状态存在。有实验证明：在DNA分子进行折叠或螺旋过程中还依赖于RNA分子的作用。如300m的环状DNA（图2-1A），通过RNA分子的连接作用将DNA片段
3、结合起来形成环（loop），从而导致DNA长度缩小成为25m（图2-1B），在活体大肠杆菌染色体上约有50多个这样的环。接着每个环内DNA进一步螺旋，使DNA长度进一步缩短为1.5m，而形成更高级结构的染色体（图2-1C）。因此，细菌的染色体不是一条裸露的DNA链，而是以高度的组装形式存在，同时这种组装不仅为了适应细菌细胞的狭小空间，而且还要有利于染色体功能的实现，便于染色体复制和基因表达。第三页，讲稿共四十八页哦第一节第一节染色体染色体 图2-1大肠杆菌（E.coli）染色体的基本结构 第四页，讲稿共四十八页哦第一节第一节染色体染色体2原核生物DNA基因组的组织结构特点（1）结构简练原核DN
4、A分子的绝大部分是用来编码蛋白质的，只有非常小的一部分不转录，这与真核DNA的冗余现象不同。（2）基因种类和数量较少原核细胞中染色体一般只有一条双链DNA分子，且大都带有单拷贝基因，且多以重叠基因的形式存在，只有很少数基因（如rRNA基因）是以多拷贝形式存在的；整个染色体DNA几乎全部由功能基因与调控序列所组成；几乎每个基因序列都与它所编码的蛋白质序列呈线性对应状态。（3）以操纵子为转录单元原核生物DNA序列中功能相关的RNA和蛋白质基因，往往丛集在基因组的一个或几个特定部位，形成功能单位或转录单元，它们可被一起转录为含多个mRNA的分子，叫多顺反子mRNA。X174及G4基因组中就含有数个多
5、顺反子。功能相关的基因串联在一起转录产生一条多顺反子mRNA链，然后再翻译成各种蛋白质。第五页，讲稿共四十八页哦第一节第一节染色体染色体 三、真核生物染色体的组成三、真核生物染色体的组成1染色体蛋白质 （1）组蛋白组蛋白是真核生物染色体的基本结构蛋白，富含带正电荷的Arg和Lys等碱性氨基酸，等电点一般在pHl0.0以上，属碱性蛋白质，可以和酸性的DNA非特异性紧密结合，而且一般不要求特殊的核苷酸序列，通常用0.25mol/LHCL或H2SO4从染色质中分离得到。真核生物染色体的组蛋白有5种，即H1、H3、H2A、H2B和H4。组蛋白中，H3，H4，H2A，H2B，其N端氨基酸都是碱性氨基酸，
6、碱性N端借静电引力与DNA起作用，组蛋白之间借此相互聚合，C端是疏水端；而H1则相反，C端是碱性氨基酸，N端是疏水端，而且H1具有45种分子类型，所以在遗传上H1保守性最少。组蛋白可进行各种修饰。由于组蛋白N端赖氨酸的乙酰化，改变了赖氨酸所负载的电荷，从而影响了与DNA的结合，有利于转录的进行，而组蛋白的磷酸化主要在组蛋白N端丝氨酸残基上进行。现一般认为组蛋白磷酸化可减弱组蛋白与核酸的结合，从而降低组蛋白对DNA模板活力的抑制，从而利于转录进行。而甲基化组蛋白。第六页，讲稿共四十八页哦第一节第一节染色体染色体 （2）非组蛋白与染色体组蛋白不同与染色体组蛋白不同，非组蛋白是指染色体上与特异DNA
7、序列相结合的蛋白质，所以又称序列特异性DNA结合蛋白(sequencespecificDNAbindingproteins)。一般来说，非组蛋白所含酸性氨基酸的量超过碱性氨基酸的量，所以带负电荷。非组蛋白和组蛋白不同，它具有种属和组织特异性，而且在活动的染色质中比不活动的染色质中含量要高。非组蛋白在整个细胞周期中都进行合成，而不像组蛋白仅在S期和DNA复制同步进行。非组蛋白的功能：能帮助DNA分子折叠，以形成不同的结构域，从而有利于DNA的复制和基因的转录；协助启动DNA复制；特异性地控制基因转录，调节基因表达。非组蛋白和组蛋白一样可以被磷酸化，这被认为是基因表达和调控的重要环节。第七页，讲稿
8、共四十八页哦第一节第一节染色体染色体2染色质和核小体 （1）核小体结构的主要实验证据用温和的方法破坏细胞核，将染色质铺展在电镜铜网上，通过电镜观察，未经处理的染色质自然结构为30nm的纤丝，经盐溶液处理后解聚的染色质呈现一系列核小体相互连接的串珠状结构，念珠的直径为10nm；用微球菌核酸酶(micrococcalnuclease)消化染色质，经过蔗糖梯度离心及琼脂糖凝胶电泳分析发现，如果完全酶解，切下的片段都是200bp的单体；如果部分酶解，则得到的片段是以200bp为单位的单体、二体(400bp)、三体(600bp)等等。蔗糖梯度离心得到的不同组分，在波长260nm的吸收峰的大小和电镜下所见
9、到的单体、二体、三体的核小体完全一致；应用X射线衍射、中子散射及电镜三维重建技术，研究染色质结晶颗粒，发现颗粒是直径为11nm、高6.0nm的扁圆柱体，具有二分对称性(dyadsymmetry)，核心组蛋白的构成是两个H3分子和两个H4分子先形成四聚体，然后再与两个由H2A和H2B构成的异二聚体(heterodimer)结合成八聚体。第八页，讲稿共四十八页哦第一节第一节染色体染色体 （2）核小体结构要点每个核小体单位包括200bp左右的DNA、一个组蛋白八聚体以及一个分子的组蛋白H1；组蛋白八聚体构成核小体的核心结构，分子量100kD，由H2A、H2B、H3和H4各两个分子所组成；DNA分子以
10、左手方向盘绕八聚体两圈，每圈83bp，共166bp。用微球菌核酸酶水解，可得到不含组蛋白H1的146bp的DNA片段(1.75圈)。一个分子的组蛋白H1与DNA结合，锁住核小体DNA的进出口，从而稳定了核小体的结构；两个相邻核小体之间以连接DNA(1inkerDNA)相连，长度为080bp不等（图2-2）。第九页，讲稿共四十八页哦第一节第一节染色体染色体AB图2-2核小体单体的存在及核心颗粒的形成A：为核小体结构示意图；B：为核小体单元的产生第十页，讲稿共四十八页哦第二节 DNA的组成和结构一、一、DNA的组成的组成 1碱基 核酸中的碱基分两类：嘧啶碱和嘌呤碱。嘧啶碱是母体化合物嘧啶的衍生物。
11、核酸中常见的嘧啶碱有三类：胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶。其中胞嘧啶为DNA和RNA两类核酸所共有。胸腺嘧啶只存在于DNA中，但是tRNA中也有少量存在；尿嘧啶只存在于RNA中。植物DNA中含有一定量的5甲基胞嘧啶。在一些大肠杆菌噬菌体DNA中，5羟甲基胞嘧啶代替了胞嘧啶。嘌呤碱有两类：腺嘌呤及鸟嘌呤。嘌呤碱是由母体化合物嘌呤衍生而来的。除了5种基本的碱基外，核酸中还有一些含量甚少的稀有碱基。稀有碱基种类极多，大多数都是甲基化的碱基。tRNA中含有较多的稀有碱基，可高达10。目前已知稀有碱基和核苷达近百种。图2-3A是存在于DNA和RNA分子中的5种含氮碱基的结构式。第十一页，讲稿共四十八页哦第二节
12、 DNA的组成和结构2核苷 核苷是一种糖苷，由戊糖和碱基缩合而成。糖与碱基之间以糖苷键相连接。糖的第一位碳原于（C1）与嘧啶碱的第一位氮原子(N1)或与嘌呤碱的第九位氮原子（N9）相连接。所以，糖与碱基间的连键是NC键，一般称之为N糖苷键；核苷中的D核糖及D2脱氧核糖均为呋喃型环状结构。糖环中的C1是不对称碳原子，所以有及两种构型。但核酸分子中的糖苷键均为糖苷键。应用X射线衍射法已证明，核苷中的碱基与糖环平面互相垂直。根据核苷中所含戊糖（图2-3B）的不同，将核苷分成两大类：核糖核苷和脱氧核糖核苷。对核苷进行命名时，必须先冠以碱基的名称，例如腺嘌呤核苷、腺嘌呤脱氧核苷等。RNA中含有某些修饰和
13、异构化的核苷。核糖也能被修饰，主要是甲基化修饰。tRNA和rRNA中还含少量假尿嘧啶核苷，在它的结构中，核糖不是与尿嘧啶的第一位氮（N1），而是与第五位碳（C5）相连接。细胞内有特异的异构化酶催化尿嘧啶核苷转变为假尿嘧啶核苷。第十二页，讲稿共四十八页哦第二节 DNA的组成和结构3核苷酸 核苷的磷酸酯叫做核苷酸，分为(核糖)核苷酸(ribo)nucleotide和脱氧(核糖)核苷酸deoxy(ribo)nucleotide两大类，分别构成DNA和RNA的基本结构单位。所有的核苷酸都可在其5位置连接一个以上的磷酸基团；从戊糖开始的第一、二、三个磷酸残基依次称为、。和及和之间的键是高能键，为许多细胞
14、活动提供能量来源。核苷三磷酸缩写为NTP，核苷二磷酸缩写为NDP。5核苷三磷酸是核酸合成的前体。细胞内还有各种游离的核苷酸和核苷酸衍生物，它们都具有重要的生理功能。因此，对于核酸和蛋白质系统，核苷酸相当于氨基酸，碱基相当于氨基酸的功能基。下面列举几种核苷酸的结构式（图2-3C）。核糖核苷的糖环上有3个自由羟基，能形成3种不同的核苷酸。(图2-3C)脱氧核苷的糖环上只有2个自由羟基，所以只能形成两种核苷酸。生物体内游离存在核苷酸多是5-核苷酸。用碱水解RNA时，可得到2-与3-核糖核苷酸的混合物。第十三页，讲稿共四十八页哦第二节 DNA的组成和结构 图2-3碱基、戊糖和核苷酸的结构A：碱基；B：
15、戊糖；C：核苷酸第十四页，讲稿共四十八页哦第二节 DNA的组成和结构 二、二、DNADNA的一级结构的一级结构 DNA由数量庞大的4种脱氧核苷酸通过3，5磷酸二酯键连接而成，DNA的一级结构就是这些脱氧核苷酸在分子中的排列顺序（序列）。就是DNA分子内碱基的排列顺序。它以密码子的方式蕴藏着遗传信息，以碱基序列的方式蕴藏着对遗传信息的调控。DNA分子中碱基序列似乎是不规则的，实际上是高度有序的。任何一段DNA序列都可以反映出功能特异性和它的个体的、种族的特征。一级结构决定了DNA的二级结构、折叠成的空间结构。这些高级结构又决定和影响着一级结构的信息功能，即基因的启动和关闭。因此，研究DNA的一级
16、结构对阐明遗传物质结构、功能以及它的表达、调控都是极其重要的。DNA几乎是所有生物遗传信息的携带者。它是信息分子，携带以下两类不同的遗传信息。一类是负责编码蛋白质氨基酸序列的信息。在这一类信息中，DNA的一级结构与蛋白质一级结构之间基本上存在共线性关系。第十五页，讲稿共四十八页哦第二节 DNA的组成和结构 另一类一级结构信息与基因的表达有关，负责基因活性的选择性表达和调控。这一部分DNA的一级结构参与调控基因的转录、翻译、DNA的复制、细胞的分化等功能，决定细胞周期的不同时期和个体发育的不同阶段、不同器官、不同组织以及不同外界环境下，基因是开启还是关闭，开启量是多少等等。这一类DNA一级结构有
17、两种情况：它本身负责编码某些调控蛋白，这些蛋白质负责调控相应的基因；一些DNA一级结构区段负责基因表达的调控位点，即决定基因开启或关闭的元件。一般由调控蛋白与调控元件相互作用来有效地控制基因。后者成为调控蛋白作用的靶位点。DNA分子中有各种特异性元件，如与复制有关的各种位点都有它们特异性的一级结构。DNA分子总的A+T与G+C含量相等，但在某些区域A+T的含量大大增高。由于AT碱基对有2个氢键，而GC之间有3个氢键，在很多有重要调节功能的DNA区域都富含有AT，如启动子区域等，有利于双链的解开，某些蛋白质与解链部位的相互结合。第十六页，讲稿共四十八页哦第二节 DNA的组成和结构 三、三、DNA
18、DNA的二级结构的二级结构 DNA的二级结构指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构。1双螺旋结构模型的依据 X射线衍射数据说明DNA含有两条或两条以上具有螺旋结构的多核苷酸链，而且沿纤维长轴有0.34nm和3.4nm两个重要的周期性变化。choqoe等应用层柝法对多种生物。DNA的碱基组成进行了分析，发现中的腺嘌呤数目与胸腺嘧啶的数目相等，胞嘧啶(包括5甲基胞嘧啶)的数目和鸟嘌呤的数目相等。后来又有人证明腺嘌呤和胸腺嘧啶间可以生成两个氢键；而胞嘧啶和鸟嘌呤之间可以允许生成3个氢键。用电位漓定法证明DNA的磷酸基可以滴定，而嘌呤和嘧啶的可解离基团则不能漓定，说明它们是由氢键连接起来的。第
19、十七页，讲稿共四十八页哦第二节 DNA的组成和结构 由此得出DNA双螺旋模型的要点：主链：DNA主链由脱氧核糖和磷酸相互间隔连接而成，从3，5磷酸二酯键的方向来看，双螺旋中2条多聚脱氧核苷酸链是反向平行的。2条主链处于螺旋的外侧，碱基处于螺旋的内侧，且主链是亲水性的。2条主链形成右手螺旋，有共同的螺旋轴，螺旋的直径是2nm。碱基配对特征：由于受几何形状限制，只有A和T配对，G和C配对，其形状才能正适合双螺旋的大小，安置在双螺旋内，不会使螺旋有任何畸变或丧失对称性。这两种碱基对还有另一个特征，就是处于一个平面具有二次旋转对称性，即一个碱基对旋转180并不影响双螺旋对称性。这意味着AT、TA、GC
20、和CG四种碱基对形式都允许处在这种几何形状中，即双螺旋结构只限定配对方式，并不限定碱基的排列顺序。第十八页，讲稿共四十八页哦第二节 DNA的组成和结构 碱基：碱基环是一个共轭环，碱基对构成的平面与螺旋轴近似垂直，螺旋轴穿过碱基平面，相邻碱基对沿螺旋转36角，上升0.34nm。因此，每10对碱基绕轴旋转一圈组成一节螺旋，螺距3.4nm。大沟和小沟：沿螺旋轴方向观察，可以看到配对的碱基并没有充满螺旋的空间。由于碱基对与糖环的连接都是在碱基对的同侧，故这种不对称的连接导致双螺旋表面形成2个凹下去的沟，一个宽一个窄，分别称为大沟和小沟。糖一磷酸骨架构成大沟和小沟的两壁，碱基对边就是沟底，而螺旋轴通过碱
21、基对中央。因此，大、小两沟的深度差不多，亦即从螺旋圆柱面至碱基对边之间的横向距离大致相等。双螺旋表面的沟对DNA与蛋白质的相互识别和结合都是很重要的。因为只有在沟内才能接触到碱基的顺序，而在双螺旋的表面则是脱氧核糖和磷酸的重复结构，似乎并无信息可言。当然，大沟和小沟之间存在着明显的差别。大沟的空间可容纳其它分子“阅读”沟内的碱基顺序信息，并可使其氮、氧原子与蛋白质的氨基酸侧链形成氢键而结合。而小沟没有足够大的空间与蛋白质分子识别和结合，但是在B-DNA的小沟内可观察到水合结构。（图2-4）是DNA双螺旋模型第十九页，讲稿共四十八页哦第二节 DNA的组成和结构 图2-4DNA双螺旋模型 第二十页
22、，讲稿共四十八页哦第二节 DNA的组成和结构 2DNA双螺旋的种类 （1）右手螺旋的多重构象表2-1不同螺旋形式DNA分子主要参数比较 第二十一页，讲稿共四十八页哦第二节 DNA的组成和结构 （2）左手螺旋 在DNA单链中存在嘌呤与嘧啶交替排列的顺序CGCGCG或CACACA时，则会出现左手双螺旋结构。在主链中各个磷酸根呈锯齿状排列，犹如“之”字形一样，因此叫做Z型构象(采用Zigzag第一个字母)。Z型结构是所有DNA结构每圈螺旋碱基对最多的，因而有最少扭曲结构。比如，真核细胞中常出现胞嘧啶第5位碳原于的甲基化，形成局部疏水区，这一区域伸入BDNA的大沟中，使BDNA不稳定而转变为ZDNA。
23、抗体可以区分Z型DNA和B型DNA。这些抗体与果蝇染色体的特殊区域以及其它生物体的细胞核结合。在果蝇中，结合的区域比染色体有更为展开的结构,说明ZDNA的存在是一种自然现象。可以看出，DNA构象的多变性，或者说DNA二级结构的多态性，是在不同条件和具有特殊序列结构时才呈现出来的，说明DNA是一个可变的动态分子，以多变的构象实现内涵丰富的生物学功能。第二十二页，讲稿共四十八页哦第二节 DNA的组成和结构 四、DNA的高级结构 DNA的高级结构是指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。超螺旋结构是DNA高级结构的主要形式，可分为正超螺旋与负超螺旋两大类，它们在特殊情况下可以相互转变，如：
24、DNA分子的这种变化可以用一个数学公式来表示：L=T+W其中，其中为连接数，是指环形DNA分子两条链间交叉的次数。只要不发生链的断裂，L是个常量。T为双螺旋的盘绕数(twistingnumber)，W为超螺旋数(writhingnumber)，它们是变量。第二十三页，讲稿共四十八页哦第三节第三节 DNADNA的复制的复制 一、DNA的半保留复制机理 二、DNA复制的起点、方向和速度 DNA在复制时，首先在一定位置解开双链，这个复制起点呈现叉子的形式，称为复制叉。一般把生物体能独立进行复制的单位称为复制子。实验证明，复制在起始阶段进行控制，一旦复制开始，就连续进行下去，直到整个复制子完成复制。每
25、个复制子由一个复制起点控制。原核生物的复制起始点通常在它染色体的一个特定位点，并且只有一个起始点，因此，原核生物的染色体只有一个复制子。真核生物染色体的多个位点可以起始复制，有多个复制起始点，因此是多复制子（表2-2）。且多个复制子不是同时起作用，而是在特定时间，只有一部分复制子（不超过15%）在进行复制过程。关于DNA复制的方向和速度，最为普遍的就是双向等速进行（图2-5）。某些环状DNA偶尔从一个复制起始点形成一个复制叉，单向复制。而腺病毒则从两个起始点相向进行复制。第二十四页，讲稿共四十八页哦第三节第三节 DNADNA的复制的复制 表2-2部分生物复制子的比较第二十五页，讲稿共四十八页哦
26、第三节第三节 DNADNA的复制的复制 图2-5放射性实验证明DNA的复制是从固定的起始点双向等速进行的第二十六页，讲稿共四十八页哦第三节第三节 DNADNA的复制的复制 三、三、DNADNA复制的几种主要方式复制的几种主要方式 1线性DNA双链的复制 复制叉生长方向有单一起点的单向(如腺病毒)及双向(如噬菌体)，和多个起始点的双向几种，DNA双向复制时复制叉处呈“眼”型。线性DNA复制中RNA引物被切除后，留下5端部分单链DNA，不能为DNA聚合酶所作用，使子链短于母链。T4和T7噬菌体DNA通过其末端的简并性,使不同链的3端因互补而结合，其缺口被聚合酶作用填满，再经DNA连接酶作用生成二联
27、体。这个过程可重复进行直到生成原长20多倍的多联体，并由噬菌体DNA编码的核酸酶特异切割形成单位长度的DNA分子。290噬菌体和腺病毒基因组的末端含反向重复序列，复制时，5端首先与末端蛋白共价结合，开始互补链的合成。当另一条链完全被置换后，两端通过发卡结构相连，形成一个大部分序列互补的单链环形DNA分子，复制从其内部的起始位点开始按前导链方式双向进行，经过环形结构到达分子的另一部分，经双链结构交错切割后生成完整的子链病毒。除了环形部分发生重排之外，所生成的新DNA分子带有母链的全部遗传信息。第二十七页，讲稿共四十八页哦第三节第三节 DNADNA的复制的复制 2环状DNA双链的复制 （1）型复制
28、 型（图2-6）复制可以是双向或单向的，大多为等速双向，少数为不等速双向复制。两个共价封闭的互相盘绕的DNA双链在拓扑异构酶作用下从起始点（ori）开始形成DNA切口和封闭，DNA的一条或两条主链骨架有暂时的切断，是DNA超旋或解旋，有利于复制叉向前移动。前导链DNA开始复制前，复制原点的核酸序列被转录生成短RNA链，作为起始DNA复制的引物。（2）滚动环复制 它是很多病毒、细菌因子以及真核生 物中基因放大的基础。如：X174，T4噬菌体等的DNA都以如图2-7所示 第二十八页，讲稿共四十八页哦第三节第三节 DNADNA的复制的复制 图2-6DNA复制的型结构第二十九页，讲稿共四十八页哦第三节
29、第三节 DNADNA的复制的复制 （3）D型复制 线粒体和叶绿体具有双链环状DNA，在电镜中观察到，线粒体DNA的复制叉曾呈现出D形。在复制开始时，双链环状DNA在特定ori位点出现一个复制泡(replicative bubble)，双链解链。复制泡的亲代分子中以（）链作为模板，合成一条新链，并且将亲代分子的（+）链置换出来，新链与它的模板形成部分双链。这样，在线粒体DNA的复制过程中，出现一条单链和一条双链组成的三元泡结构，称为置换环(displacement loop)或D环。（图2-8）。第三十页，讲稿共四十八页哦第三节第三节 DNADNA的复制的复制 图2-7环状DNA可以通过滚环式复
30、制产生多单元DNA第三十一页，讲稿共四十八页哦第三节第三节 DNADNA的复制的复制 图2-8D型复制的模型第三十二页，讲稿共四十八页哦第四节 原核生物和真核生物DNA的复制特点 一、原核生物DNA的复制特点 1DNA双螺旋的解旋 DNA双螺旋分子具有紧密缠绕的结构，编码碱基位于分子的内部，因此在复制时，母本DNA的两条链应至少分开一部分，才能使DNA复制酶系统“阅读”模板链的碱基顺序。使DNA双螺旋解旋并使两条链保持分开的状态是个极其复杂的过程，现在已找到一些酶和蛋白质，它们或者能使DNA双链变得易于解开，或者可以使超螺旋分子松弛。2冈崎片段与半不连续复制 按照Watson-Crick假说，
31、DNA的两条链的方向相反，所以复制时，如新生DNA的一条链从5向3端合成，则另一条链必须从3端向5端延伸。可是，迄今发现的DNA聚合酶都只能催化DNA链从5端向3端延长。第三十三页，讲稿共四十八页哦第四节 原核生物和真核生物DNA的复制特点 图2-9DNA的半不连续复制 第三十四页，讲稿共四十八页哦第四节 原核生物和真核生物DNA的复制特点 3DNA复制的引发与终止 在细胞提取物中合成冈崎片段时，不仅需要dATP、dGTP、dCTP和dTTP四种前体，还需要一个与模板DNA的碱基顺序互补的RNA短片段当作引物。有许多实验结果能证明RNA引物的存在。在多瘤病毒的体外系统中合成的冈崎片段是一个5端
32、约10核苷酸长的，以3三磷酸为结尾的RNA。这是一个强有力的证据。第三十五页，讲稿共四十八页哦第四节 原核生物和真核生物DNA的复制特点 图2-10大肠杆菌染色体DNA双向复制示意图 第三十六页，讲稿共四十八页哦第四节 原核生物和真核生物DNA的复制特点 4DNA聚合酶 DNA聚合酶不是复制大肠杆菌染色体的主要聚合酶，它有35核酸外切酶活性，这种活性和聚合酶活性紧密结合在一起，既可合成DNA链，又能降解DNA，保证了DNA复制的准确性。另外，它还有53核酸外切酶的功能，可作用于双链DNA，又可水解5末端或距5末端几个核苷酸处的磷酸二酯键，因而该酶被认为在切除由紫外线照射而形成的嘧啶二聚体中起着
33、重要的作用。它也可用以除去冈崎片段5端RNA引物，使冈崎片段间缺口消失，保证连接酶将片段连接起来。DNA聚合酶具有53方向聚合酶活性，但酶活性很低。若以每分钟酶促核苷酸掺入DNA的效率计算，只有DNA聚合酶的5，故也不是复制中主要的酶。其35核酸外切酶活性可起校正作用。目前认为DNA聚合酶的生理功能主要是起修复DNA的作用。DNA聚合酶包含有7种不同的亚单位和9个亚基，其生物活性形式为二聚体。它有53方向聚合酶活性，也有35核酸外切酶活性。它的活力较强，为DNA聚合酶的15倍，DNA聚合酶的300倍。它能在引物的3OH上以每分钟约5万个核苷酸的速率延长新生的DNA链，是大肠杆菌DNA复制中链延
34、长反应的主导聚合酶。表2-3介绍了上述DNA聚合酶的性质。第三十七页，讲稿共四十八页哦第四节 原核生物和真核生物DNA的复制特点 第三十八页，讲稿共四十八页哦第四节 原核生物和真核生物DNA的复制特点 二、真核生物二、真核生物DNADNA的复制特点的复制特点 1真核细胞的每条染色体含有多个复制起始点。复制子的大小变化很大，约5-300kbp。复制可以在几个复制起始点上同时进行，复制起始点不是一成不变的。在发育过程中，活化的细胞有更多的复制起始点。例如，果蝇在胚胎发育早期，其最大染色体上有6000个复制叉，大约每10 kbp就有一个。2真核生物染色体在全部复制完成之前，各个复制起始点不能开始新一
35、轮的复制。而原核生物中，复制起始点上可以连续开始新的复制事件，表现为一个复制子内套叠有多个复制叉。3真核生物DNA的复制子被称为自主复制序列（ARS），长约150bp左右，含有几个复制起始必须的保守区。并且其复制起始需起点识别复合物（ORC）参与，并需ATP。真核生物复制叉的移动速度大约只有50bp/s，还不到大肠杆菌的1/20。因此，人类DNA中每隔3x1043x105就有一个复制起始位点。第三十九页，讲稿共四十八页哦第四节 原核生物和真核生物DNA的复制特点 4真核生物有多种DNA聚合酶，分别为在真核细胞中主要有5种DNA聚合酶，分别称为DNA聚合酶、和，真核细胞的DNA聚合酶和细菌DNA
36、聚合酶基本性质相同，均以dNTP为底物，需Mg2+激活，聚合时必须有模板链和具有3OH末端的引物链，链的延伸方向为53。但真核细胞的DNA聚合酶一般都不具有核酸外切酶活性，推测一定有另外的酶在DNA复制中起校对作用。DNA聚合酶的功能主要是引物合成。DNA聚合酶活性水平稳定，可能主要在DNA损伤的修复中起作用。DNA聚合酶是主要负责DNA复制的酶，参与先导链和滞后链的合成。而DNA聚合酶的主要功能可能是在去掉RNA引物后把缺口补全。5端粒的复制 线性染色体的末端DNA称为端粒，端粒的功能主要是稳定染色体末端结构，防止染色体之间的末端连接。复制由一种特殊的酶-端粒酶所催化。真核生物线性染色体在复
37、制后，不能原核生物那样填补5末端的空缺，从而会使5末端序列因此缩短。而端粒酶可以外加重复单位到5末端上，维持端粒一定的长度。第四十页，讲稿共四十八页哦第四节 原核生物和真核生物DNA的复制特点 三、三、DNADNA复制的调控复制的调控 1大肠杆菌染色体DNA的复制调控 染色体的复制与细胞分裂一般是同步的，但复制与细胞分裂不直接偶联。复制起始不依赖于细胞分裂，而复制的终止则能引发细胞分裂。在一定生长速度范围内，细胞与染色体的质量之比相对恒定，这是由活化物、阻遏物和去阻遏物及它们的相互作用所制约的。复制的功能单位，即复制子，由起始物位点和复制起点两部分组成。起始物位点编码复制调节蛋白质，复制起点与
38、调节蛋白质相互作用并启动复制。起始物位点突变使复制停止并导致细胞死亡。2ColE1质粒DNA的复制调控 ColE1是一个6646bp的小质粒，在宿主细胞内拷贝数为2030。ColE1 DNA复制不依赖于其本身编码的蛋白质，而完全依靠宿主DNA聚合酶。质粒DNA编码两个负调控因子Rop蛋白和反义RNA(RNA1)，它们控制了起始DNA复制所必需的引物合成。第四十一页，讲稿共四十八页哦第四节 原核生物和真核生物DNA的复制特点 3真核细胞DNA的复制调控 真核细胞的生活周期可分为4个时期：G1、S、G2和M期。G1是复制预备期，S为复制期，G2为有丝分裂准备期，M为有丝分裂期。DNA复制只发生在S
39、期。真核细胞中DNA复制有3个水平的调控：（1）细胞生活周期水平调控 也称为限制点调控，即决定细胞停留在G1期还是进入S期。许多外部因素和细胞因子参与限制点调控。促细胞分裂剂、致癌剂、外科切除等都可诱发细胞由G1期进入S期。一些细胞质因子如四磷酸二腺苷和聚ADP核糖也可诱导DNA的复制。（2）染色体水平调控 决定不同染色体或同一染色体不同部位的复制子按一定顺序在S期起始复制，这种有序复制的机理还不清楚.（3）复制子水平调控 决定复制的起始与否。这种调控从单细胞生物到高等生物是高度保守的。此外，真核生物复制起始还包括转录话化、复制起始复合物的合成和引物合成等阶段，许多参与复制起始蛋白的功能与原核
40、生物中相类似。酵母染色体复制只发生于S期,各个复制子按专一的时间顺序活化，在S期的不同阶段起始复制。第四十二页，讲稿共四十八页哦第五节第五节 DNADNA的损伤与修复的损伤与修复 一、一、DNADNA的损伤来源的损伤来源1DNA分子的自发性损伤（1）互变异构 DNA分子中的4种碱基自发地使氢原子改变位置，产生互变异构体，进一步使碱基配对的方式发生改变，这样在复制后的子链上就可能出现错误。例如：腺嘌呤的互变异构体A可以与C配对，胸腺嘧啶的互变异构体T与G配对，当DNA复制时，如果模板链上存在这些互变异构体，在子链上就可能发生错误，形成损伤。（2）脱氨试剂及自发脱嘌呤和脱嘧啶 包括羟胺，是一种体外
41、诱变剂；亚硫酸盐，主要改变DNA分子单链区的CU，亚硝酸盐主要使CU，也使A和G脱去氨基，但特异性较差，可引起体内外的广泛诱变。（3）活性氧引起的诱变 活性氧为氧分子电子数大于O2的O2。8oxoG(GA)是一种氧化碱基(7，8、二氢8氧代鸟嘌呤)，可与C、A配对，而DNA聚合酶、的校正活性不能校正其错配，造成GCTA的颠换，这种损伤可以积累。H202是细胞呼吸的副产物，非常活跃，造成DNA氧化损伤时，产生胸腺嘧啶乙二醇、胸苷乙二醇和羟甲基尿嘧啶等，此类损伤一般能被修复。第四十三页，讲稿共四十八页哦第五节第五节 DNADNA的损伤与修复的损伤与修复 2物理因素引起的DNA损伤 紫外线（UV）照
42、射引起的DNA损伤主要是形成嘧啶二聚体，DNA分子最易于吸收的波长在260nm左右，当受到大剂量的UV照射后，一条链上相邻的两个嘧啶核苷酸共价结合，形成环丁烷嘧啶二聚体。形成二聚体的反应可逆较长的波长（280nm）有利于二聚体的形成，较短波长（240 nm）利于其解聚。二聚体的生成位置和频率与侧翼的碱基序列有一定关系。当人的皮肤暴露在阳光下，每小时由于UV照射产生嘧啶二聚体的频率为5x104细胞。由于UV穿透力有限，故对人的伤害主要是皮肤。紫外线照射影响微生物的存活。电离辐射对DNA的损伤有直接效应和间接效应两种途径。前者指辐射对DNA分子直接聚积能量，引起理化性质改变；后者指电离辐射对DNA
43、存在的环境中其他成分(主要是水)沉积能量，引起DNA分子的变化。第四十四页，讲稿共四十八页哦第五节第五节 DNADNA的损伤与修复的损伤与修复 3化学因素引起的DNA损伤 （1）烷化剂对DNA的损伤 烷化剂是一类亲电子的化合物，极容易与生物体中的有机物大分子的亲核位点起反应。当烷化剂和DNA作用时，就可以将烷基加到核酸的碱基上去。DNA中的亲核位点主要有：腺嘌呤中的N1，N3，N6，N7；鸟嘌呤中的N1，N2，N3N7和06；胞嘧啶中的N3，N4和O4；胸腺嘧啶中的N3，O2和O4。其中鸟嘌呤的N7位和腺嘌呤的N3位最容易被烷化，DNA链上的磷酸二酯键中的氧也容易被烷化。（2）碱基类似物对DN
44、A的损伤 碱基类似物是一类结构与碱基相似的人工合成化合物，由于它们的结构与碱基相似，进入细胞后能替代正常的碱基掺入到DNA链中，干扰DNA的正常合成。5溴尿嘧啶(5BU)是胸腺嘧啶环上的甲基被溴取代的一种最常见的碱基类似物，与U的结构非常相似,能与A配对，5BU有酮式和烯醇式两种形态，当处于烯醇式时，可与G配对，且存在机率高于酮式形态，因此一旦掺入到DNA链中，通过互变异构在复制中产生突变，引起ATCC的转换。另一个常见的碱基类似物是2氨基嘌呤(2AP)，在正常的酮式状态时与T配对，在烯醇式状态时与C配对。在某些植物体的代谢过程中，能产生个别的毒性化合物，其中包括DNA损伤剂。第四十五页，讲稿
45、共四十八页哦第五节第五节 DNADNA的损伤与修复的损伤与修复 二、二、DNADNA的修复的修复 1错配修复 E.coli避免突变的主要途径之一就是甲基指导的错配修复系统。这个系统是非特异性的，它能修复引起DNA双螺旋轻微扭曲的任何扭伤，包括错配、移码、碱基类似物的掺人和某些类型微小扭曲的烷基化损伤。2碱基切除修复 是一种在细胞中存在较普遍的修复过程。在细胞中都有不同类型、能识别受损核酸位点的糖苷水解酶，它能特意性切除受损核苷酸上的N-糖苷键，在DNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位点（AP位点）。DNA分子中一旦产生了AP位点，核酸内切酶就会把受损核酸的糖苷-磷酸键切开，并移去包括AP位点核苷酸在内
46、的小片段DNA，由DNA聚合酶I合成新的片段，最终由DNA连接酶把两者连成新的被修复的DNA链。第四十六页，讲稿共四十八页哦第五节第五节 DNADNA的损伤与修复的损伤与修复 图2-11甲基介导的错配修复模型 第四十七页，讲稿共四十八页哦第五节第五节 DNADNA的损伤与修复的损伤与修复 3核苷酸切除修复 核苷酸切除修复系统几乎能够修复紫外线照射引起的各种损伤。包括环丁烷二聚体、64损伤、碱基-糖基交联等引起DNA双螺旋大扭曲(major distortion)，而不能修复由于碱基错配、O6甲基鸟嘌呤、O4甲基胸腺嘧啶、8oxoG或碱基类似物引起的DNA双螺旋微小扭曲，对提高DNA损伤细胞的存活能力是非常重要的。第四十八页，讲稿共四十八页哦