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1、色谱分析平面色谱法色谱分析平面色谱法第1页，此课件共30页哦第五章第五章 平面色谱法平面色谱法第一节第一节 概 述1938年俄国人首先实现了在氧化铝薄层上分离一种天然药物。1965年德国化学家出版了“薄层色谱法”一书，推动了这一技术的发展。因TLC法设备简单，分析速度快，分离效率高，结果直观，很快被用作定性和半定量的方法。70年代中后期发展了高效薄层色谱。80年代以后发展了薄层色谱光密度扫描仪，和各步操作的仪器化，并实现了计算机化。第2页，此课件共30页哦1.Thin-layer chromatography of standard PL samples Fig.1Description:Th
2、e thermo-stability of phospholipids and lysophospholipids was determined by one dimensional thin-layer chromatography(TLC).A chloroform-methanol-28%aqueous ammonia solvent system(65:35:8,v/v)provided clear separation of major phospholipids(PL)and their lyso forms.The 5%(w/v)dodecamolybdophosphoric a
3、cid solution in ethanol was used as spray reagent.The thermo stability of phospholipids was evaluated by compare the spots density and area of PL samples with varying heat treatment.Rapid determination of thermo-stability of phospholipids by TLC第3页，此课件共30页哦第五章第五章 平面色谱法平面色谱法定义：平面色谱法(plane chromatogra
4、phy)是在平面上进行分离的一种色谱方法。一、平面色谱法的分类和原理平面色谱法的分类和原理分类纸色谱法：滤纸为载体，纤维素的羟基与水结合形成液-液分配色谱固定相，展开剂由于毛细作用沿滤纸向上运动。-分配色谱薄层色谱法：将吸附材料均匀固定在载板上，由于吸附剂颗粒间的毛细作用，展开剂（流动相）上行。-吸附色谱薄层电泳法：荷电组分样品负载于惰性支持介质（纸、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等），在电场作用下进行分离。第4页，此课件共30页哦二、平面色谱法的基本流程二、平面色谱法的基本流程确定样品的预处理方法选择吸附剂和展开剂制备层析用薄板点样层析分离显色定性或定量分析分析结果，给出结论第5页，此课件共30页哦
5、三、平面色谱法参数三、平面色谱法参数（一）定性参数（一）定性参数1.比比移移值值Rf (retardation factor;Rf)溶溶质质移移动动的的距距离离与与流流动相移动距离之比动相移动距离之比 Rf范围：范围：0 Rf 1Rf =0.20.8（常用）（常用）Rf =0.30.5（最佳）（最佳）第6页，此课件共30页哦Lds1ds2图图181第7页，此课件共30页哦2.相对比移值相对比移值Ris 讨论讨论参考物与被测组分在完全相同条件下展开 可以消除系统误差，大大提高重现性和可靠性；参考物可以是后加入纯物质，也可是样品中已知组分相对比移值Ris与组分、参考物性质及色谱条件有关，范围可以大
6、于或小于1第8页，此课件共30页哦（二）面效参数（二）面效参数1、理论塔板数 N=16(ds/W)2 ds:原点到斑点中心的距离 W：组分斑点的纵向宽度2、塔板高度 H=ds/N=(Rf L)/N ds：原点到展开剂前沿的距离 N越大，H越小。与展开剂的速率常数、组分在展开剂中的扩散系数、吸附剂的平均粒径及其粒度分布等因素有关。第9页，此课件共30页哦（三）容量因子（三）容量因子k与比移值与比移值Rf的关系的关系容量因子：k=ts/tmts、tm 分别为组分在固定相和展开剂中的保留时间保留值的定义：第10页，此课件共30页哦（四）分离参数（四）分离参数1、分离度分离度(resolution;R
7、)两相邻斑点中心的距离与两相邻斑点中心的距离与两斑点平均宽度的比值两斑点平均宽度的比值 R=2(ds2-ds1)/(W1+W2)=2d/(W1+W2)ds1、ds2:分别为原点至两半斑点中心的距离，分别为原点至两半斑点中心的距离，W1、W2斑点的宽度。斑点的宽度。第11页，此课件共30页哦2.分离数分离数(separation number;SN)定义：定义：相邻斑点分离度为相邻斑点分离度为1.177时，在时，在Rf=0(原点原点)到到Rf=1(溶剂前沿溶剂前沿)之间能容纳的之间能容纳的色谱斑点数。色谱斑点数。W(1/2)0,W(1/2)1为实验测得的某组分色谱峰的半峰宽对ds作图外推至在原点
8、处和溶剂前沿处的半峰宽。一般薄层板的分离数为一般薄层板的分离数为 710，高效薄层板可达，高效薄层板可达1020。SN是衡量分离容是衡量分离容量的重要参数。量的重要参数。第12页，此课件共30页哦第二节第二节 薄层色谱法薄层色谱法一、主要类型一、主要类型二、吸附剂与展开剂二、吸附剂与展开剂三、操作方法三、操作方法 四、定性与定量分析四、定性与定量分析 五、高效薄层色谱法五、高效薄层色谱法六、薄层扫描法六、薄层扫描法七、应用实例七、应用实例Thin Layer chromatography TLC第13页，此课件共30页哦概述概述1TLC定义定义：将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上，将固定相均匀
9、涂布在表面光滑的平板上，形成薄层而进行色谱分离和分析的方法形成薄层而进行色谱分离和分析的方法2操作过程操作过程：铺板铺板 活化活化 点样点样 展开展开 定位定位(定性定性)/洗脱洗脱(定量定量)3分离机制分离机制：吸附吸附*、分配、分配*、离子交换、空间排阻离子交换、空间排阻4特点特点；分离能力强、灵敏度高、展开时间较短、显色分离能力强、灵敏度高、展开时间较短、显色 方便。方便。5应用应用：药物杂质检查、纯度测定、定性及定量等。：药物杂质检查、纯度测定、定性及定量等。第14页，此课件共30页哦第15页，此课件共30页哦一、主要类型一、主要类型（一）吸附薄层色谱 固定相为吸附剂的薄层色谱。利用吸
10、附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离.经过吸附、解吸、再吸附、再解吸最后混合物得到分离.K大，Rf值小，移动慢；K小，Rf大，移动快。（二）分配薄层色谱 固定相为液体，吸留在载体上的薄层色谱。利用被分离组分在固定相与流动相中的分配系数不同而被分离。常用的是反相薄层色谱法，固定相是烷基化学键合相，展开剂是水及与水相溶的有机溶剂。第16页，此课件共30页哦二、吸附剂与展开剂二、吸附剂与展开剂(一）吸附剂一）吸附剂1.硅胶：硅胶硅胶：硅胶H-不含黏合剂 硅胶硅胶G-含煅石膏（13-15%）硅胶硅胶F254-既含煅石膏，又含荧光指示剂2.氧化铝氧化铝：可分为：可分为中性中性（pH7.5)、碱性碱性（
11、pH9.0）和）和酸性酸性（pH4.0）（二）展开剂二）展开剂 常用的有：常用的有：石油醚石油醚环己烷环己烷二硫化碳二硫化碳四氯化碳四氯化碳三氯乙烷三氯乙烷苯苯甲苯甲苯二氯甲烷二氯甲烷乙醚乙醚氯仿氯仿乙酸乙酯乙酸乙酯正正丁醇丁醇丙酮丙酮乙醇乙醇甲醇甲醇吡啶吡啶酸酸水水第17页，此课件共30页哦吸附剂与展开剂的选择吸附剂与展开剂的选择展开剂的选择：展开剂的选择：根据被测组分、吸附剂和展开剂本身的极性 吸附剂的选择：根据被测物极性和吸附剂的吸附能力 被测物极性强弱极性吸附剂 被测物极性弱强极性吸附剂图183第18页，此课件共30页哦三、操作方法三、操作方法定性分析窄条定量分析1020cm 硅胶G自
12、含粘和剂硅胶H不含粘和剂，铺板时另加入CMC硅胶FH254含荧光剂，254nm紫外光照发绿光硅胶FH365含荧光剂，365nm紫外光照发光（一）薄层板的制备（二）点样：用毛细管或微量注射器，几微升，24mm（三）展开：见续页（四）显色方法：日光、紫外光(254、365nm)显色剂等第19页，此课件共30页哦 连续展开：层析缸，预饱和，防止边缘效应浸入展开剂深度0.51.0cm，展开至整板3/4距离,标记。1,2样品样品 3 标准品标准品前沿前沿原点原点 1.5-2.0cm2.0cm1 2 3展开方式展开方式第20页，此课件共30页哦展开方式展开方式二维展开在两个垂直的方向上进行展开。将样品点在
13、薄层板的一个角上，展开适当距离后，挥干溶剂，再将薄层板以与原展开方向成90 的方向进行展开。原点12第21页，此课件共30页哦四、定性和定量分析四、定性和定量分析定性分析利用保留值测定Rf值测定相对Rf值，即Ris值。利用二维色谱（改变色谱条件，比较Rf值是否一致）sb1b2b2sb1sb1b2点样第一次展开第二次展开第22页，此课件共30页哦定量分析1.目视比较半定量2.测量斑点面积3.洗脱法4.薄层扫描法第23页，此课件共30页哦五、高效薄层色谱法五、高效薄层色谱法高效薄层色谱法（high performance thin layer chromatography；HPTLC)所用的吸附剂
14、颗粒很小 （5m或10m），用喷雾法制成高效薄层板。常用的有硅胶、氧化铝、纤维素和化学键合相预制薄层板。第24页，此课件共30页哦六、薄层扫描法六、薄层扫描法薄层扫描法是用一定强度光束照射薄层上的斑点，用仪器测量照射前后光束强度的变化，从而求得物质含量的方法。检测方法 紫外-可见吸收测定法和荧光测定法 测量方法 投射法和反射法扫描方式 单波长和双波长影响薄层扫描定量的因素 均匀度 展开距离 随行标准及点样次序 显色均匀度及稳定性第25页，此课件共30页哦第四节第四节 纸色谱法纸色谱法 以纸做载体的色谱法，分离原理属于液-液分配色谱法，操作与薄层法类似。选纸 点样 展开 显色(定性)/洗脱(定量
15、)固定相：纸纤维吸附的水流动相：与水不互溶的有机溶剂（水饱和正丁醇）分离机制：同液-液分配色谱定性参数：讨论：Rf与组分性质、流动相及溶解度有关 极性组分易保留，Rf 小（流动相极性，Rf）非极性组分易流出，Rf大（流动相极性，Rf）第26页，此课件共30页哦本章小结本章小结掌掌握握:平平面面色色谱谱法法的的基基本本分分离离原原理理及及相相关关参参数数的的计计算算（比比移移值值、相相对对比比移移值值，分分离离度度）；薄薄层层色色谱谱法法的的特特点点；吸吸附附薄薄层层色色谱谱中中吸附剂和展开剂的选择原则。吸附剂和展开剂的选择原则。熟悉熟悉:薄层色谱法的主要操作步骤。薄层色谱法的主要操作步骤。了了
16、解解:薄薄层层扫扫描描法法的的应应用用及及技技术术；纸纸色色谱谱法法的的分分离离原原理理及及实实验验条条件。件。第27页，此课件共30页哦参考书及文献参考书及文献1.分析化学（第四版）下册，孙毓庆主编，人民卫生出版社 2周同惠等纸色谱和薄层色谱。分析化学丛书第三卷第五册北京：科学出版社，19893林珍安等译高效薄层色谱上海：上海科技出版社，19844.孙毓庆主编薄层扫描法及其在药物分析中的应用北京，人民卫生出版社，19905.Fried Band Sherma JThin-layer ChromatographyNew York：Marcel Dekker lnc，19826.Grinberg NModern Thin-layer ChromatographyNew York：Marcel Dekker lnc，1990。7.Sherma J and Fried BHandbook of Thin-Layer Chromatography.New York：Marcel Dekker lnc，1991.第28页，此课件共30页哦第29页，此课件共30页哦第30页，此课件共30页哦