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1、光谱分析技术hu第一页，讲稿共一百一十八页哦光是电磁波，可用波长“”表示，电磁波谱是由不同性质的连续波长的光谱所组成，对于生物化学来说，最重要的波长区域是可见光和紫外光。光的波长是二个相邻的波峰之间的距离。光的传播是由相互垂直的电场分量“E”和磁场分量“H”所构成。C/波长 C光速 频率，单位时间通过一个定点的波数。第二页，讲稿共一百一十八页哦紫外可见吸收光谱的形成 按照量子力学原理，分子能态按一定的规律跳跃式地变化，物质在入射光的照射下，分子吸收光时，其能量的增加是不连续的，物质只能吸收一定能量的光，吸收光的频率和两个能级间的能量差要符合下列关系：EE2 E1h第三页，讲稿共一百一十八页哦E
2、1、E2分别表示初能态和终能态的能量，初能态与终能态之间的能量差愈大，则所吸收的光的频率愈高（即波长愈短），反之则所吸收的光的频率愈低（即波长愈长）。由于吸收是不连续的，因此在光的一定部位出现一系列吸收暗带。因为分子转动、振动及电子能级跃迁的能量差别较大，因此，它们的吸收光谱出现在不同的光谱区域。分子转动能级级差小，E0.05电子伏特（ev），分子转动光谱的吸收出现在远红外或微波区。振动能级纵间的差别较大，E0.051.0 ev，振动光谱出现在中红外区。电子能级的级差更大，E120 ev，所以由电子跃迁得到的光谱出现在可见、紫外或波长更短的光谱区。第四页，讲稿共一百一十八页哦可见光、紫外光吸收
3、光谱，是由于分子中联系较松散的价电子被激发产生跃迁从而吸收光辐射能量形成的，即分子由基态变为激发态，电子由一个低能级的轨道（即成键轨道），吸收了光能量跃迁到高能级轨道（称为反键轨道）。第五页，讲稿共一百一十八页哦若逐渐改变照射某物质的入射光的波长，并测定物质对各种波长光的吸收程度（吸光度“A”或光密度“O.D”）或透射程度（透光度“T”），以波长作横坐标，“A”或“T”为纵座标，画出连续的“A”或“T”曲线，即为该物质的吸收光谱曲线。第六页，讲稿共一百一十八页哦第七页，讲稿共一百一十八页哦曲线上“A”处称最大吸收峰，它所对应的波长称最大吸收波长，以max表示。曲线上“B”处有一谷，称最小吸收，
4、它所对应的波长，所对应的波长，称最小吸收波长，以min 表示。曲线上在最大吸收峰旁边有一小峰“C”，称肩峰。在吸收曲线的波长最短的一端，曲线上“D”处，吸收相当强，但不成峰形，此处称为末端吸收。第八页，讲稿共一百一十八页哦max是化合物中电子能级跃迁时吸收的特征波长，不同物质有不同的最大吸收峰，所以它对鉴定化合物极为重要。吸收光谱中，max、min、肩峰以及整个吸收光谱的形状决定于物质的性质，其特征随物质的结构而异，所以是物质定性的依据。测定某物质的紫外吸收光谱的曲线，可与已知标准的紫外光谱图相对照，对照时须注意测定的条件，如溶剂、浓度等。第九页，讲稿共一百一十八页哦常用标准的紫处吸收光谱是萨
5、德勒研究实验公司编制的“Sadtler”紫外标准图谱集，到七十年代末为止已收集28585个化合物紫外光谱图，此外还有药物和非极性溶剂紫外光谱图2000多幅。第十页，讲稿共一百一十八页哦由于化合物紫外吸收峰较少，而且峰形都很宽，不象红外光谱是许多指纹峰，所以在用紫外吸收光谱进行化合物定性鉴定时，应注意：化合物相同，其紫外光谱应完全相同；但是紫外光谱相同不一定化合物就相同，可能仅是存在某些相同的发色团或基团，因此在鉴定时应与红外光谱相结合。第十一页，讲稿共一百一十八页哦常用的术语 紫外光谱中常用的术语有发色团、助色团、增色效应和减色效应。发色团：发色团：凡是与饱和碳氢化合物连接能引起n*、*、n*
6、等电子跃迁的基团称为发色团。例如：CC、CO等发色团。助色团：助色团：助色团是一些具有非共价键的基团（如OH、NH2、SH等）。这些基团在波长200 nm处没有吸收，当它与发色团相连接时，使发色团的吸收带向长波移动，称为红移（或浅色效应），红移的同时吸收带的强度增加。若助色团与发色团相连接，产生 n*跃迁，使吸收波长向短波移动，称为兰移（或深色效应）。第十二页，讲稿共一百一十八页哦增色效应（增色效应（hyperchromic effect）:核酸变性或降解，使得DNA或RNA溶液对紫外光的吸收明显增加，即 值（吸光系数或称消光系数）显著升高，此现象称为增色效应。此效应是由于碱基之间电子相互作用
7、的改变所致，通常在260nm处测量。减色效应（减色效应（hypochromic effect）:在一定的条件下，变性的核酸又可以复性，此时值又明显减少，回复到原来的核酸分子值较低的水平，即此时DNA或RNA溶液的紫外光吸收显著降低，此现象称为减色效应，此效应也是由于碱基之间电子相互作用的变化所引起的，通常在260nm条件下测量。第十三页，讲稿共一百一十八页哦有色溶液对溶液对溶液对溶液对可见光线有选择性的吸收作用光线有选择性的吸收作用光线有选择性的吸收作用光线有选择性的吸收作用，有些无色溶液，所含物质可以吸收特定波长的紫外线或红外线。不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同，因
8、此，每种物质都具有其特异的吸收光谱每种物质都具有其特异的吸收光谱每种物质都具有其特异的吸收光谱每种物质都具有其特异的吸收光谱。利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法，称为分光光度法或分光光度技术，分光光度法或分光光度技术，分光光度法或分光光度技术，分光光度法或分光光度技术，使用的仪器称为分光光度计。分光光度计。分光光度计。分光光度计。分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广。灵敏度高，测定速度快，应用范围广。灵敏度高，测定速度快，应用范围广。灵敏度高，测定速度快，应用范围广。第十四页，讲稿共一百一十八页哦第二章第二章 光
9、谱分析技术光谱分析技术第一节第一节第一节第一节 朗伯朗伯朗伯朗伯-比尔（比尔（比尔（比尔（Lambert-beerLambert-beer）光吸收定律）光吸收定律）光吸收定律）光吸收定律第二节第二节第二节第二节 分光光度计基本结构分光光度计基本结构分光光度计基本结构分光光度计基本结构 第三节第三节第三节第三节 光度法的误差光度法的误差光度法的误差光度法的误差第四节第四节第四节第四节 分光光度法的应用分光光度法的应用分光光度法的应用分光光度法的应用第五节第五节第五节第五节原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法第六节第六节第六节第六节荧光分析法荧光分析法荧光分析法
10、荧光分析法第七节第七节第七节第七节散射光谱分析法散射光谱分析法散射光谱分析法散射光谱分析法第十五页，讲稿共一百一十八页哦第一节第一节朗伯朗伯-比尔（比尔（Lambert-beer）1.1朗伯朗伯-比尔（比尔（Lambert-beer）光吸收定律：）光吸收定律：A：吸光度，又称光密度：吸光度，又称光密度“OD”T：透光度，：透光度，TI/I0I0：照射到吸收池上的光强：照射到吸收池上的光强It：透过吸收池的光强。：透过吸收池的光强。第十六页，讲稿共一百一十八页哦1.2吸光度、溶液浓度及液层厚度之间关系：吸光度、溶液浓度及液层厚度之间关系：A=bCA=bC ：摩尔吸光系数或克分子吸光系数，：摩尔吸
11、光系数或克分子吸光系数，：摩尔吸光系数或克分子吸光系数，：摩尔吸光系数或克分子吸光系数，LmolLmol-1-1cmcm-1-1 b b：样品光程（：样品光程（：样品光程（：样品光程（cmcm），通常使用），通常使用），通常使用），通常使用1.0cm1.0cm的吸收地。的吸收地。的吸收地。的吸收地。C C：样品浓度，：样品浓度，：样品浓度，：样品浓度，molLmolL-1-1摩尔吸光系数是物质对某波长的光的吸收能力的量度。越大，吸收光的能力越越大，吸收光的能力越越大，吸收光的能力越越大，吸收光的能力越强，相应的分光度法测定的灵敏度就越高强，相应的分光度法测定的灵敏度就越高强，相应的分光度法测定
12、的灵敏度就越高强，相应的分光度法测定的灵敏度就越高。值越大，说明电子跃迁的几率大，通常 10105：一般认为 104为强吸收；103104 为较强吸收；102 为弱吸收，此时分光光度法不灵敏。第十七页，讲稿共一百一十八页哦1.3应用朗伯应用朗伯-比耳定律的条件：比耳定律的条件：入射光波长应为max，且单色性好；单色性好；单色性好；单色性好；被测溶液具有均匀性、非散射性被测溶液具有均匀性、非散射性被测溶液具有均匀性、非散射性被测溶液具有均匀性、非散射性(不浑浊，也不呈胶体)；被测物质的浓度应在一定范围内；被测物质的浓度应在一定范围内；被测物质的浓度应在一定范围内；被测物质的浓度应在一定范围内；朗
13、伯-比耳定律不仅适用于可见光，适用于可见光，适用于可见光，适用于可见光，也适用于红外光和紫外光；红外光和紫外光；红外光和紫外光；红外光和紫外光；朗伯-比耳定律不仅适用于均匀非散射的液体，均匀非散射的液体，均匀非散射的液体，均匀非散射的液体，也适用于固体和气体。固体和气体。固体和气体。固体和气体。因此，它是各类吸光光度法定量的依据，用途很广。因此，它是各类吸光光度法定量的依据，用途很广。因此，它是各类吸光光度法定量的依据，用途很广。因此，它是各类吸光光度法定量的依据，用途很广。第十八页，讲稿共一百一十八页哦第二节第二节 分光光度计基本结构分光光度计基本结构 2.1常见的分光光度计类型常见的分光光
14、度计类型2.2分光光度计基本结构分光光度计基本结构 2.2.1电光源系统电光源系统2.2.2样品室样品室2.2.3单色器单色器第十九页，讲稿共一百一十八页哦2.1 2.1 常见的分光光度计类型常见的分光光度计类型 2.1.1单光束分光光度计单光束分光光度计2.1.2双光束分光光度计双光束分光光度计2.1.3双波长分光光度计双波长分光光度计2.1.4光多道二极管阵列检浏分光光度计光多道二极管阵列检浏分光光度计第二十页，讲稿共一百一十八页哦第二十一页，讲稿共一百一十八页哦2.1.1单光束分光光度计单光束分光光度计早期的分光光度计都是单光束的，例如751型、75lG型，有些仍为手动操作，即固固固固定
15、在某一波长定在某一波长定在某一波长定在某一波长，分别测量比较样品、空白或参比液的透光率或吸光度，操作比较费时，要求光源和检测器的供电电压稳定性高，用于绘制吸收光谱图时很不方便，但其光路简单，能量损失小，适用于物质的定量分析。第二十二页，讲稿共一百一十八页哦2.1.2双光束分光光度计双光束分光光度计双光束分光光度计是目前发展最快，应用最为普遍的一种。应用最为普遍的一种。应用最为普遍的一种。应用最为普遍的一种。既可直接读数，又可扫描图谱。因为单色光能在很短的时间内交替通过空白和样品因为单色光能在很短的时间内交替通过空白和样品溶液，所以可以减小因光源强度不稳带来的误差。溶液，所以可以减小因光源强度不
16、稳带来的误差。双光束分光光度计在测量过程中不需移动吸收池，可双光束分光光度计在测量过程中不需移动吸收池，可双光束分光光度计在测量过程中不需移动吸收池，可双光束分光光度计在测量过程中不需移动吸收池，可在随意改变波长的同时记录吸光度。其操作简单，测在随意改变波长的同时记录吸光度。其操作简单，测在随意改变波长的同时记录吸光度。其操作简单，测在随意改变波长的同时记录吸光度。其操作简单，测量快速，自动化程度高。量快速，自动化程度高。量快速，自动化程度高。量快速，自动化程度高。测定含量时，为准确起见，仍宜用固定波长测量方式。宜用固定波长测量方式。宜用固定波长测量方式。宜用固定波长测量方式。第二十三页，讲稿
17、共一百一十八页哦第二十四页，讲稿共一百一十八页哦2.1.3双波长分光光度计双波长分光光度计 双波长分光光度计是双波长分光光度计是将光源发出的光分成两束，将光源发出的光分成两束，将光源发出的光分成两束，将光源发出的光分成两束，分别进人分别进人各自的单色器，获得各自的单色器，获得两束波长可任意调节的单色光，两束波长可任意调节的单色光，然后交替照射到然后交替照射到同一个吸收池，到达同一检测器，测得同一个吸收池，到达同一检测器，测得同一个吸收池，到达同一检测器，测得同一个吸收池，到达同一检测器，测得在两个波长处的吸光度差值在两个波长处的吸光度差值在两个波长处的吸光度差值在两个波长处的吸光度差值A A，
18、A与被测组分的与被测组分的量成正比。量成正比。此法可消除参比和样品溶液组成不一致及比色池不匹配带来的误差，此法可消除参比和样品溶液组成不一致及比色池不匹配带来的误差，主要用于存在干扰组分的样品、浑浊样品和多组分主要用于存在干扰组分的样品、浑浊样品和多组分混合样品的测定。但仪器价格昂贵，体积较大。混合样品的测定。但仪器价格昂贵，体积较大。第二十五页，讲稿共一百一十八页哦第二十六页，讲稿共一百一十八页哦2.1.4光多道二极管阵列检浏分光光度计光多道二极管阵列检浏分光光度计光多道二极管阵列检测分光光度计是一种具有全新光路系统的仪器。具有光谱响应宽、数字化扫描准确、性能光谱响应宽、数字化扫描准确、性能
19、比较稳定等优点。比较稳定等优点。由于全部波长同时被检测，而且光二极管的响应很快，一般可在0.1s的极短时间内获得190820nm范围的全光光谱，可作为追踪化追踪化学反应和反应动力学研究学反应和反应动力学研究的重要工具。第二十七页，讲稿共一百一十八页哦随着仪器的改进和计算机的应用，又出现了随着仪器的改进和计算机的应用，又出现了许多新的测量技术，如许多新的测量技术，如14阶导数光谱测阶导数光谱测量技术、三波长分光光度法、速率分析或量技术、三波长分光光度法、速率分析或动力学分析等。动力学分析等。第二十八页，讲稿共一百一十八页哦2.2 2.2 分光光度计基本结构分光光度计基本结构光源单色器吸收池检测器
20、显示系统2.2.12.2.1电光源系统电光源系统电光源系统电光源系统2.2.22.2.2样品室样品室样品室样品室2.2.32.2.3单色器单色器单色器单色器第二十九页，讲稿共一百一十八页哦2.2.1电光源系统电光源系统 可见光源：钨可见光源：钨可见光源：钨可见光源：钨/卤钨灯卤钨灯卤钨灯卤钨灯(320-2500nm)(320-2500nm)，卤钨灯更好。，卤钨灯更好。，卤钨灯更好。，卤钨灯更好。紫外光源：氢灯和氘灯发光二极管，氘灯紫外光源：氢灯和氘灯发光二极管，氘灯紫外光源：氢灯和氘灯发光二极管，氘灯紫外光源：氢灯和氘灯发光二极管，氘灯(160-375nm)(160-375nm)，氘灯产生的光
21、谱强度比氢灯大，氘灯产生的光谱强度比氢灯大，氘灯产生的光谱强度比氢灯大，氘灯产生的光谱强度比氢灯大3 35 5倍，而且寿命也比倍，而且寿命也比倍，而且寿命也比倍，而且寿命也比氢灯长。氢灯长。氢灯长。氢灯长。红外光源：红外光源：红外光源：红外光源：碘钨灯碘钨灯碘钨灯碘钨灯(近红外近红外近红外近红外)、能斯持灯能斯持灯能斯持灯能斯持灯(中红外中红外中红外中红外)、汞灯、汞灯、汞灯、汞灯(远红外远红外远红外远红外)。线光源：空心阴极灯线光源：空心阴极灯线光源：空心阴极灯线光源：空心阴极灯/金属金属金属金属(汞汞汞汞/钠钠钠钠)蒸汽灯蒸汽灯蒸汽灯蒸汽灯激光光源：固体激光光源：固体激光光源：固体激光光源
22、：固体/气体气体气体气体/染料激光器染料激光器染料激光器染料激光器 荧光分光光度计多用球形荧光分光光度计多用球形荧光分光光度计多用球形荧光分光光度计多用球形氙灯氙灯氙灯氙灯原子吸收光谱仪多用原子吸收光谱仪多用原子吸收光谱仪多用原子吸收光谱仪多用原子光谱灯原子光谱灯原子光谱灯原子光谱灯，要求辐射的原子光谱，要求辐射的原子光谱，要求辐射的原子光谱，要求辐射的原子光谱线半宽度要窄，以利于提高仪器的灵敏度。线半宽度要窄，以利于提高仪器的灵敏度。线半宽度要窄，以利于提高仪器的灵敏度。线半宽度要窄，以利于提高仪器的灵敏度。第三十页，讲稿共一百一十八页哦能斯特灯是由铈、锆、钍和钇等氧化物烧结而成的长约能斯特
23、灯是由铈、锆、钍和钇等氧化物烧结而成的长约能斯特灯是由铈、锆、钍和钇等氧化物烧结而成的长约能斯特灯是由铈、锆、钍和钇等氧化物烧结而成的长约2cm2cm、直径约、直径约、直径约、直径约1mm1mm的实心或空心棒组成，工作温度可的实心或空心棒组成，工作温度可的实心或空心棒组成，工作温度可的实心或空心棒组成，工作温度可达达达达1300130017001700，其发射的波长范围约为，其发射的波长范围约为，其发射的波长范围约为，其发射的波长范围约为1 130m30m，它的寿命较长、稳定性好。对短波范围辐射效率优它的寿命较长、稳定性好。对短波范围辐射效率优它的寿命较长、稳定性好。对短波范围辐射效率优它的寿
24、命较长、稳定性好。对短波范围辐射效率优于硅碳棒，但价格较贵，操作不如硅碳棒方便。于硅碳棒，但价格较贵，操作不如硅碳棒方便。于硅碳棒，但价格较贵，操作不如硅碳棒方便。于硅碳棒，但价格较贵，操作不如硅碳棒方便。硅碳棒是由碳化硅烧结而成的实心捧，工作温度达硅碳棒是由碳化硅烧结而成的实心捧，工作温度达硅碳棒是由碳化硅烧结而成的实心捧，工作温度达硅碳棒是由碳化硅烧结而成的实心捧，工作温度达1200120015001500。对于长波，其辐射效率高于能斯特灯，。对于长波，其辐射效率高于能斯特灯，。对于长波，其辐射效率高于能斯特灯，。对于长波，其辐射效率高于能斯特灯，其使用波长范围比能斯特灯宽，发光面大，操作
25、方便、其使用波长范围比能斯特灯宽，发光面大，操作方便、其使用波长范围比能斯特灯宽，发光面大，操作方便、其使用波长范围比能斯特灯宽，发光面大，操作方便、廉价。廉价。廉价。廉价。第三十一页，讲稿共一百一十八页哦岛岛津津荧荧光分光光度光分光光度计计RF-5301PC荧光分光光度计在越来越多的领域发挥着巨大的作用，比如生命科学中的定性定量分析，化学中的光化学反应的研究，食品中的残留农药检测和环境中大气、水质、土壤的污染评估。相比于吸光度法，荧光法的灵敏度更高，选择性也更好，把激发光、荧光波长相结合，可以测定混合物。RF5301PC作为新一代的荧光分光光度计具有高水平的性价比和功能强大的软件，从日常分析
26、到科学研究都发挥了极大的作用第三十二页，讲稿共一百一十八页哦原子吸收光谱仪的光源原子吸收光谱仪的光源主要采用主要采用空心阴极灯。空心阴极灯。空心阴极灯的结构如左空心阴极灯的结构如左图所示。图所示。1 1紫外玻璃窗口；紫外玻璃窗口；紫外玻璃窗口；紫外玻璃窗口；2 2石英窗口，石英窗口，石英窗口，石英窗口，3 3密封密封密封密封4 4玻璃套，玻璃套，玻璃套，玻璃套，5 5云母屏蔽；云母屏蔽；云母屏蔽；云母屏蔽；6 6阳极；阳极；阳极；阳极；7 7阴极；阴极；阴极；阴极；8 8支架；支架；支架；支架；9 9管座，管座，管座，管座，1010连接管脚连接管脚连接管脚连接管脚第三十三页，讲稿共一百一十八页
27、哦2.2.2样品室样品室紫外紫外-可见分光光度计和荧光分光光度计的可见分光光度计和荧光分光光度计的样品室内装有比色皿，可以是玻璃或石英样品室内装有比色皿，可以是玻璃或石英比色皿。比色皿。可见光范围用可见光范围用玻璃比色皿玻璃比色皿。紫外光范围用紫外光范围用石英比色皿石英比色皿。原子吸收光谱仪的样品室为原子化器，常用原子吸收光谱仪的样品室为原子化器，常用的原子化器有火焰和石墨炉。的原子化器有火焰和石墨炉。第三十四页，讲稿共一百一十八页哦2.2.3单色器单色器凡能把复合光分解为按波长顺序排列的单色凡能把复合光分解为按波长顺序排列的单色光，并能通过出射狭缝分离出某一波长单光，并能通过出射狭缝分离出某
28、一波长单色光的仪器，称为单色器。色光的仪器，称为单色器。分光光度计中所用的单色器有两种类型：棱分光光度计中所用的单色器有两种类型：棱镜单色器和光栅单色器。镜单色器和光栅单色器。第三十五页，讲稿共一百一十八页哦单色器单色器单色器单色器主要部分都是由入光狭缝、出光狭缝、色散元件、主要部分都是由入光狭缝、出光狭缝、色散元件、主要部分都是由入光狭缝、出光狭缝、色散元件、主要部分都是由入光狭缝、出光狭缝、色散元件、准直镜以及附属机械装置所组成。准直镜以及附属机械装置所组成。准直镜以及附属机械装置所组成。准直镜以及附属机械装置所组成。入光狭缝起着限制复合光进入单色器的作用；入光狭缝起着限制复合光进入单色器
29、的作用；入光狭缝起着限制复合光进入单色器的作用；入光狭缝起着限制复合光进入单色器的作用；色散元件起着把复合光分解为单色光的作用；色散元件起着把复合光分解为单色光的作用；色散元件起着把复合光分解为单色光的作用；色散元件起着把复合光分解为单色光的作用；准直镜的作用一是把来自入光狭缝的光转变为平行光，准直镜的作用一是把来自入光狭缝的光转变为平行光，准直镜的作用一是把来自入光狭缝的光转变为平行光，准直镜的作用一是把来自入光狭缝的光转变为平行光，投射到色散元件上，作用二是把来自色散元件的平行光投射到色散元件上，作用二是把来自色散元件的平行光投射到色散元件上，作用二是把来自色散元件的平行光投射到色散元件上
30、，作用二是把来自色散元件的平行光束聚焦于出光狭缝上，形成光谱像；束聚焦于出光狭缝上，形成光谱像；束聚焦于出光狭缝上，形成光谱像；束聚焦于出光狭缝上，形成光谱像；出光狭缝是单色光的出口。它只让光谱带中额定波长出光狭缝是单色光的出口。它只让光谱带中额定波长出光狭缝是单色光的出口。它只让光谱带中额定波长出光狭缝是单色光的出口。它只让光谱带中额定波长的光从狭缝中透出，而将其他波长的光挡住，不许其的光从狭缝中透出，而将其他波长的光挡住，不许其的光从狭缝中透出，而将其他波长的光挡住，不许其的光从狭缝中透出，而将其他波长的光挡住，不许其通过。通过。通过。通过。第三十六页，讲稿共一百一十八页哦1、棱镜单色器、
31、棱镜单色器3030利特罗（利特罗（利特罗（利特罗（LitrowLitrow）式（自准式）式（自准式）式（自准式）式（自准式）6060棱镜利特罗（棱镜利特罗（棱镜利特罗（棱镜利特罗（LitrowLitrow）式）式）式）式瓦兹渥斯（瓦兹渥斯（瓦兹渥斯（瓦兹渥斯（WadsworchWadsworch）式）式）式）式泽尼特（泽尼特（泽尼特（泽尼特（Czerny-TurnerCzerny-Turner）式）式）式）式第三十七页，讲稿共一百一十八页哦 光从一种介质射到另一种介质时，一部分光从界面反光从一种介质射到另一种介质时，一部分光从界面反光从一种介质射到另一种介质时，一部分光从界面反光从一种介质射到
32、另一种介质时，一部分光从界面反射回去称为反射，射回去称为反射，射回去称为反射，射回去称为反射，另一部分光则改变前进方向进入第另一部分光则改变前进方向进入第另一部分光则改变前进方向进入第另一部分光则改变前进方向进入第二种介质称为折射。若入射角为二种介质称为折射。若入射角为二种介质称为折射。若入射角为二种介质称为折射。若入射角为i i、折射角为、折射角为、折射角为、折射角为，则其，则其，则其，则其折射率折射率折射率折射率n n为：为：为：为：n=sini/sinn=sini/sin。不同的光学材料具有不同。不同的光学材料具有不同。不同的光学材料具有不同。不同的光学材料具有不同的折射率，即便是同一种
33、光学材料以相同的入射角的折射率，即便是同一种光学材料以相同的入射角的折射率，即便是同一种光学材料以相同的入射角的折射率，即便是同一种光学材料以相同的入射角照射，若波长不同，得到的折射角也不一样。照射，若波长不同，得到的折射角也不一样。照射，若波长不同，得到的折射角也不一样。照射，若波长不同，得到的折射角也不一样。第三十八页，讲稿共一百一十八页哦第三十九页，讲稿共一百一十八页哦2 2、光栅单色器光路图、光栅单色器光路图 光栅色散均匀、谱线清晰、工作波段宽，是棱镜无法比拟的。再加上它所组成的单色器的结光栅色散均匀、谱线清晰、工作波段宽，是棱镜无法比拟的。再加上它所组成的单色器的结光栅色散均匀、谱线
34、清晰、工作波段宽，是棱镜无法比拟的。再加上它所组成的单色器的结光栅色散均匀、谱线清晰、工作波段宽，是棱镜无法比拟的。再加上它所组成的单色器的结构比较简单，所以近年来逐步取代了棱镜，而成为色散元件的主角。构比较简单，所以近年来逐步取代了棱镜，而成为色散元件的主角。构比较简单，所以近年来逐步取代了棱镜，而成为色散元件的主角。构比较简单，所以近年来逐步取代了棱镜，而成为色散元件的主角。第四十页，讲稿共一百一十八页哦光栅光栅原是指大量等宽、等间距的平行狭缝所原是指大量等宽、等间距的平行狭缝所组成的光学元件，组成的光学元件，是一种多狭缝部件，光栅是一种多狭缝部件，光栅光谱的产生是多狭缝干涉和单狭缝衍射两
35、者光谱的产生是多狭缝干涉和单狭缝衍射两者联合作用的结果。多缝干涉决定光谱线出现联合作用的结果。多缝干涉决定光谱线出现的位置，单狭缝衍射决定谱线的强度分布。的位置，单狭缝衍射决定谱线的强度分布。光栅分为平面透射光栅和反射光栅，反射光光栅分为平面透射光栅和反射光栅，反射光栅应用更广泛。反射光栅又可分为平面反射栅应用更广泛。反射光栅又可分为平面反射光栅（或称闪耀光栅）和凹面反射光栅。光栅（或称闪耀光栅）和凹面反射光栅。第四十一页，讲稿共一百一十八页哦b为狭缝宽度为狭缝宽度d为光栅常数，为光栅常数，它等于狭缝宽度它等于狭缝宽度加两狭缝之间的加两狭缝之间的距离，即相邻两距离，即相邻两刻痕间的距离。刻痕间
36、的距离。为衍射角。为衍射角。i为入射角为入射角光栅的色散原理图光栅的色散原理图光栅的色散原理图光栅的色散原理图光栅光栅光栅光栅会聚透镜会聚透镜会聚透镜会聚透镜透镜焦平面上透镜焦平面上透镜焦平面上透镜焦平面上的受光屏的受光屏的受光屏的受光屏平面透射光栅平面透射光栅 第四十二页，讲稿共一百一十八页哦当光以垂直方向照射光栅即当光以垂直方向照射光栅即i0，则，则n=0，1，2，n称为干涉的级。可以得到称为零级、一级、称为干涉的级。可以得到称为零级、一级、二级、二级、的光栅光谱。的光栅光谱。若入射光不是垂直地照射在光栅上，而是有若入射光不是垂直地照射在光栅上，而是有一定的角度，则上式写为：一定的角度，则
37、上式写为：该式称为平面衍射光栅方程，简称光栅方程。该式称为平面衍射光栅方程，简称光栅方程。第四十三页，讲稿共一百一十八页哦反射型复制光栅，它是在平面玻璃上粘结上一定反射型复制光栅，它是在平面玻璃上粘结上一定角度刻槽的铝反射膜而制成的。角度刻槽的铝反射膜而制成的。铝膜很薄铝膜很薄(约约0.11.5um)、很亮，故从外表看不、很亮，故从外表看不出和一般的反射镜有什么明显的差异。出和一般的反射镜有什么明显的差异。第四十四页，讲稿共一百一十八页哦光栅表面的铝膜质地很松软，极易擦伤，所以在维护时，光栅表面的铝膜质地很松软，极易擦伤，所以在维护时，光栅表面的铝膜质地很松软，极易擦伤，所以在维护时，光栅表面
38、的铝膜质地很松软，极易擦伤，所以在维护时，严禁用任何擦拭物擦拭，更不能用手去触摸，否则会造成严禁用任何擦拭物擦拭，更不能用手去触摸，否则会造成严禁用任何擦拭物擦拭，更不能用手去触摸，否则会造成严禁用任何擦拭物擦拭，更不能用手去触摸，否则会造成永久性损坏。万一光栅上落上了灰尘，只能用吹气球吹去。永久性损坏。万一光栅上落上了灰尘，只能用吹气球吹去。永久性损坏。万一光栅上落上了灰尘，只能用吹气球吹去。永久性损坏。万一光栅上落上了灰尘，只能用吹气球吹去。不同波长的光具有不同的衍射角，两者成比例关系。不同波长的光具有不同的衍射角，两者成比例关系。不同波长的光具有不同的衍射角，两者成比例关系。不同波长的光
39、具有不同的衍射角，两者成比例关系。波长长者衍射角大，波长短者衍射角小。因此，利用波长长者衍射角大，波长短者衍射角小。因此，利用波长长者衍射角大，波长短者衍射角小。因此，利用波长长者衍射角大，波长短者衍射角小。因此，利用光栅可以把不同波长的光分开，这就是光栅的色散原光栅可以把不同波长的光分开，这就是光栅的色散原光栅可以把不同波长的光分开，这就是光栅的色散原光栅可以把不同波长的光分开，这就是光栅的色散原理。理。理。理。第四十五页，讲稿共一百一十八页哦闪耀光栅闪耀光栅 光栅的宽度越大，光栅的宽度越大，总刻线数越多，总刻线数越多，分辨率越大。分辨率越大。对同一线光谱而对同一线光谱而言，光栅的分辨言，光
40、栅的分辨率是常数，不随率是常数，不随波长而变化。波长而变化。i是入射角，是入射角，是衍射角，是衍射角，是是光栅刻痕角。反射面与光栅平光栅刻痕角。反射面与光栅平面的夹角，称为闪耀角。面的夹角，称为闪耀角。第四十六页，讲稿共一百一十八页哦3、滤光片、滤光片在简易的比色计中，使用滤光片能够获得有限波长范围的在简易的比色计中，使用滤光片能够获得有限波长范围的光。滤光片分为吸收滤光片和干涉滤光片两种。光。滤光片分为吸收滤光片和干涉滤光片两种。吸收滤光片吸收滤光片由有色玻璃或内夹在两玻璃片之间的有色染料的明胶所组成，这种滤光片适用于可见光区。适用于可见光区。干涉滤光片干涉滤光片是根据光的干涉原理设计的，它
41、是由透明的电解质（如氟化钙或氟化镁），夹在两块内侧涂有一层半透明金属（如银）簿膜的玻璃或石英片之间所组成。电解质的厚度必须严格控制。这种滤光片适用于紫外光区。适用于紫外光区。第四十七页，讲稿共一百一十八页哦偏离偏离Beer定律的因素定律的因素根据根据Beer定律，当波长和入射光强度一定时，定律，当波长和入射光强度一定时，吸光度吸光度A与吸光物质的浓度与吸光物质的浓度C成正比。成正比。不同浓度的标准溶液的吸光度，不同浓度的标准溶液的吸光度，C与与A之间的之间的关系应该是一条通过原点的直线。但实际工关系应该是一条通过原点的直线。但实际工作中常常会出现偏离直线的情况，即偏离作中常常会出现偏离直线的情
42、况，即偏离Beer定律的现象。定律的现象。导致偏离的主要因素有化学因素与光学因素。导致偏离的主要因素有化学因素与光学因素。第三节第三节 光度法的误差光度法的误差第四十八页，讲稿共一百一十八页哦3.1化学因素化学因素通常只有当溶液浓度小于通常只有当溶液浓度小于0.01molL的稀溶的稀溶液时液时Beer定律才能成立。定律才能成立。随着溶液浓度的改变，溶液中吸光物质可因随着溶液浓度的改变，溶液中吸光物质可因浓度的改变而发生离解、缔合、溶剂化以及浓度的改变而发生离解、缔合、溶剂化以及配合物组成等的变化，使吸光物质存在形式配合物组成等的变化，使吸光物质存在形式发生变化，从而使吸光物质对光吸收的选择发生
43、变化，从而使吸光物质对光吸收的选择性和吸光强度也发生相应的变化。性和吸光强度也发生相应的变化。第四十九页，讲稿共一百一十八页哦随着浓度的增大，随着浓度的增大，随着浓度的增大，随着浓度的增大，660nm660nm处吸收峰减弱，而处吸收峰减弱，而处吸收峰减弱，而处吸收峰减弱，而610nm610nm处处处处吸收峰增强，吸收光谱形状改变。由于离子浓度的变化，吸收峰增强，吸收光谱形状改变。由于离子浓度的变化，吸收峰增强，吸收光谱形状改变。由于离子浓度的变化，吸收峰增强，吸收光谱形状改变。由于离子浓度的变化，使吸光度与浓度成正比的关系发生偏离。使吸光度与浓度成正比的关系发生偏离。使吸光度与浓度成正比的关系
44、发生偏离。使吸光度与浓度成正比的关系发生偏离。例例例例1 1：亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱：亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱：亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱：亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱第五十页，讲稿共一百一十八页哦例例2：重铬酸钾的水溶液：重铬酸钾的水溶液有以下平衡：有以下平衡：若溶液稀释若溶液稀释2倍，由于受稀释平衡向右移动倍，由于受稀释平衡向右移动的影响，的影响，Cr2O72-离子浓度不是减小离子浓度不是减小2倍，倍，Cr2O72-离子浓度的减少明显地多于离子浓度的减少明显地多于2倍。倍。第五十一页，讲稿共一百一十八页哦Cr2O72-、CrO42-两种离子在某一波长处吸两种离子在某一波长处吸光
45、强度相差较大，致使重铬酸钾水溶液吸光强度相差较大，致使重铬酸钾水溶液吸光度的降低与浓度的降低不成正比而偏离光度的降低与浓度的降低不成正比而偏离Beer定律。定律。若控制溶液的酸度，在强酸性条件下测定若控制溶液的酸度，在强酸性条件下测定Cr2O72-，或在强碱条件下测定，或在强碱条件下测定Cr2O72-，偏，偏离离Beer定律的现象可以避免。定律的现象可以避免。第五十二页，讲稿共一百一十八页哦3.2光学因素光学因素3.2.1非单色光非单色光Beer定律只适用于单色光，而实际用于测量定律只适用于单色光，而实际用于测量的是一定波长范围的复合光，由于吸光物的是一定波长范围的复合光，由于吸光物质对不同波
46、长的光的吸收能力不同，就导质对不同波长的光的吸收能力不同，就导致了对致了对Beer定律的偏离。定律的偏离。第五十三页，讲稿共一百一十八页哦例如，右图例如，右图例如，右图例如，右图所示的吸收光谱，所示的吸收光谱，所示的吸收光谱，所示的吸收光谱，用谱带用谱带用谱带用谱带I I所对应的波长进行分析，所对应的波长进行分析，所对应的波长进行分析，所对应的波长进行分析，造成的偏离就比较小。用谱带造成的偏离就比较小。用谱带造成的偏离就比较小。用谱带造成的偏离就比较小。用谱带所对应的波长进行分析就所对应的波长进行分析就所对应的波长进行分析就所对应的波长进行分析就会造成较大的偏离。会造成较大的偏离。会造成较大的
47、偏离。会造成较大的偏离。通常选择吸光物质的最大吸收波长作为测定波长。这样不仅通常选择吸光物质的最大吸收波长作为测定波长。这样不仅通常选择吸光物质的最大吸收波长作为测定波长。这样不仅通常选择吸光物质的最大吸收波长作为测定波长。这样不仅能保证测定有较高的灵敏度，而且此处曲线较为平坦，吸光能保证测定有较高的灵敏度，而且此处曲线较为平坦，吸光能保证测定有较高的灵敏度，而且此处曲线较为平坦，吸光能保证测定有较高的灵敏度，而且此处曲线较为平坦，吸光系数变化不大，对系数变化不大，对系数变化不大，对系数变化不大，对BeerBeer定律的偏离程度就比较小。定律的偏离程度就比较小。定律的偏离程度就比较小。定律的偏
48、离程度就比较小。在保证一定光强的前提下，应使用尽可能窄的带宽宽度，同在保证一定光强的前提下，应使用尽可能窄的带宽宽度，同在保证一定光强的前提下，应使用尽可能窄的带宽宽度，同在保证一定光强的前提下，应使用尽可能窄的带宽宽度，同时应尽量避免采用尖锐的吸收峰进行定量分析。时应尽量避免采用尖锐的吸收峰进行定量分析。时应尽量避免采用尖锐的吸收峰进行定量分析。时应尽量避免采用尖锐的吸收峰进行定量分析。第五十四页，讲稿共一百一十八页哦3.2.2杂散光杂散光从单色光器得到的单色光中，还有一些不在从单色光器得到的单色光中，还有一些不在谱带范围内的与所需波长相隔甚远的光，谱带范围内的与所需波长相隔甚远的光，称为杂
49、散光称为杂散光(straylight)。主要由仪器光学系统的缺陷或光学元件受灰主要由仪器光学系统的缺陷或光学元件受灰尘、霉蚀的影响而引起。特别是在透光率尘、霉蚀的影响而引起。特别是在透光率很弱的情况下，杂散光的影响尤为显著。很弱的情况下，杂散光的影响尤为显著。第五十五页，讲稿共一百一十八页哦杂散光杂散光杂散光杂散光I Is s常随入射光强度常随入射光强度常随入射光强度常随入射光强度I I0 0的增大而增大。若供试品的增大而增大。若供试品的增大而增大。若供试品的增大而增大。若供试品不吸收杂散光，不吸收杂散光，不吸收杂散光，不吸收杂散光，(I(Is s+I+I0 0)(I(It t+I+Is s)
50、I)I0 0/I/It t，A A变小，为负偏变小，为负偏变小，为负偏变小，为负偏离，供试品吸收杂散光，离，供试品吸收杂散光，离，供试品吸收杂散光，离，供试品吸收杂散光，A A增大，为正偏离。前一种情增大，为正偏离。前一种情增大，为正偏离。前一种情增大，为正偏离。前一种情况在分析中常会遇到。况在分析中常会遇到。况在分析中常会遇到。况在分析中常会遇到。设照射光强度为设照射光强度为设照射光强度为设照射光强度为I I00，透过光强度为，透过光强度为，透过光强度为，透过光强度为I It t，杂散光强度为，杂散光强度为，杂散光强度为，杂散光强度为I Is s，则观察到的吸光度为：，则观察到的吸光度为：，