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1、关于混合菌种接种与关于混合菌种接种与接种比例接种比例对酶活的影活的影响响第一页，讲稿共十八页哦实验前言实验前言纤维素是自然界中合成量最大的有机物之一，约占植纤维素是自然界中合成量最大的有机物之一，约占植物秸秆的物秸秆的30%50%，但是利用率较低，核心问，但是利用率较低，核心问题是纤维素酶的活性低。题是纤维素酶的活性低。纤维素酶是具有不用酶活性的酶复合物，主要包括外纤维素酶是具有不用酶活性的酶复合物，主要包括外切纤维素酶（切纤维素酶（C1酶）、内切纤维素酶（酶）、内切纤维素酶（Cx酶），酶），-葡萄糖苷酶（葡萄糖苷酶（CB酶）。当酶）。当3中酶的活性比例适当，中酶的活性比例适当，就能完成对纤维
2、素的降解。就能完成对纤维素的降解。已知绿色木霉和黑曲霉的上述已知绿色木霉和黑曲霉的上述3种作用于纤维素的位种作用于纤维素的位点不同，对其降解程度也不同。用混合发酵可充分发点不同，对其降解程度也不同。用混合发酵可充分发挥各酶之间的协同作用，提高酶活性从而提高对纤维挥各酶之间的协同作用，提高酶活性从而提高对纤维素的利用率。素的利用率。第二页，讲稿共十八页哦菌种简介菌种简介黑曲霉黑曲霉：丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌：丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌 广泛分布。可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、广泛分布。可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子果胶
3、酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等，是重要的发酵工业菌种。生长适温酸等，是重要的发酵工业菌种。生长适温37，最，最低相对湿度为低相对湿度为88%，能引致水分较高的粮食霉变，能引致水分较高的粮食霉变和其他工业器材的霉变。和其他工业器材的霉变。绿色木霉绿色木霉：丝孢纲、丝孢目，粘孢菌类，是一种普：丝孢纲、丝孢目，粘孢菌类，是一种普遍存在的真菌。可产生纤维素酶、几丁质酶、木聚遍存在的真菌。可产生纤维素酶、几丁质酶、木聚糖酶等，是产纤维素酶活性最高的菌株之一。湿度糖酶等，是产纤维素酶活性最高的菌株之一。湿度生长适温为生长适温为2028，营养生长的相对湿度要求，营养生长的相对湿度要求92%以上
4、。以上。第三页，讲稿共十八页哦 实验流程介绍实验流程介绍实验思路实验思路 实验步骤实验步骤 Step 1 Step 2 Step 3 实验数据的处理实验数据的处理 列表法列表法 作图法作图法预期实验结果预期实验结果 实验结果实验结果 分析讨论分析讨论第四页，讲稿共十八页哦LogoLogo控制变量法：控制变量法：本实验室验证与探究混合菌种的接种本实验室验证与探究混合菌种的接种与接种比例对酶活性的影响，其他所有无关变量（与接种比例对酶活性的影响，其他所有无关变量（例如例如:温度，湿度和培养时间）都应相同且适宜。温度，湿度和培养时间）都应相同且适宜。实验思路实验思路1设置对照法：设置对照法：一是将绿
5、色木霉，黑曲霉单菌株发酵一是将绿色木霉，黑曲霉单菌株发酵的酶活性与混合菌株发酵的酶活性进行比较；而是的酶活性与混合菌株发酵的酶活性进行比较；而是在保持接种菌株总量一定的前提下，改变各组分所在保持接种菌株总量一定的前提下，改变各组分所比例，设置多个对照组相互对照。比例，设置多个对照组相互对照。2做图法：做图法：将实验数据用图像表示出来，令实验结果将实验数据用图像表示出来，令实验结果更清楚明白，便于得出实验结论。更清楚明白，便于得出实验结论。3第五页，讲稿共十八页哦LogoLogoCONTAIN实验步骤实验步骤 StepStep 2：菌种孢子的培菌种孢子的培养养 Step 3：粗酶液的制备粗酶液的
6、制备与酶活性的测与酶活性的测定定 Step 1:培养基的配置与培养基的配置与菌种孢子悬浊液菌种孢子悬浊液的制取的制取 第六页，讲稿共十八页哦Step 1:培养基的配置培养基的配置：斜面培养基（马铃薯，葡萄糖，斜面培养基（马铃薯，葡萄糖，琼脂，水等）琼脂，水等）固体发酵培养基（稻草秸秆粉，水固体发酵培养基（稻草秸秆粉，水等）等）孢子悬浊液的制取孢子悬浊液的制取：在：在2个斜面培养基上分别在适宜个斜面培养基上分别在适宜条件下培养绿色木霉与黑曲霉菌株条件下培养绿色木霉与黑曲霉菌株2天，并制得一定且天，并制得一定且相同浓度的孢子悬浊液。相同浓度的孢子悬浊液。第七页，讲稿共十八页哦黑曲霉的孢子黑曲霉的孢
7、子孢子头状如孢子头状如菊花菊花第八页，讲稿共十八页哦绿色木霉的孢子绿色木霉的孢子第九页，讲稿共十八页哦LogoLogoCONTAIN实验步骤实验步骤 StepStep 2：菌种孢子的培菌种孢子的培养养 Step 3：粗酶液的制备粗酶液的制备与酶活性的测与酶活性的测定定 Step 1:培养基的配置与培养基的配置与菌种孢子悬浊液菌种孢子悬浊液的制取的制取 第十页，讲稿共十八页哦Step 2:菌种孢子的培养菌种孢子的培养：取等体积两种霉菌的孢子取等体积两种霉菌的孢子培养液培养液V分别接种于分别接种于2个相同的固体培养基中个相同的固体培养基中使混合孢子培养液的体积也为使混合孢子培养液的体积也为V，改变
8、绿，改变绿色木霉与黑曲霉孢子培养液的比例为色木霉与黑曲霉孢子培养液的比例为1：9，2：8，3：7，4：6，5：5，6：4,7：3,8：2,9：1，分别接种于，分别接种于9个相同的固体个相同的固体培养基中培养基中将上述将上述11个培养基置于相同且适个培养基置于相同且适宜的环境中培养宜的环境中培养3天，每天翻曲一次天，每天翻曲一次第十一页，讲稿共十八页哦PICTURES绿色木霉绿色木霉第十二页，讲稿共十八页哦PICTURES黑曲霉黑曲霉第十三页，讲稿共十八页哦LogoLogoCONTAIN实验步骤实验步骤 StepStep 2：菌种孢子的培菌种孢子的培养养 Step 3：粗酶液的制备粗酶液的制备与
9、酶活性的测与酶活性的测定定 Step 1:培养基的配置与培养基的配置与菌种孢子悬浊液菌种孢子悬浊液的制取的制取 第十四页，讲稿共十八页哦Step 3：粗酶液的制备粗酶液的制备：在固体发酵产物中加入：在固体发酵产物中加入6倍的倍的柠檬酸缓冲液，经过摇床，离心，过滤，静置柠檬酸缓冲液，经过摇床，离心，过滤，静置后，其上清液即为粗酶液，放于后，其上清液即为粗酶液，放于4C冰箱保存冰箱保存备用备用酶活性的测定酶活性的测定：采用一定的方法对：采用一定的方法对11组粗酶组粗酶液进行液进行CMC 酶活性测定，酶活性测定，FPA酶活性测定，酶活性测定，-葡萄糖苷酶活性测定，绘制表格，记录实葡萄糖苷酶活性测定，
10、绘制表格，记录实验数据（具体方法可以参考时珍国医国药验数据（具体方法可以参考时珍国医国药2010年第年第21卷第卷第12期期3330至至3331页）页）第十五页，讲稿共十八页哦实验数据的处理实验数据的处理1：单菌株与混合菌株酶活性的比较单菌株与混合菌株酶活性的比较柱状柱状图法图法 以菌株种类为横坐标，酶活性为纵坐标；观察以菌株种类为横坐标，酶活性为纵坐标；观察比较不同菌株同类酶的图柱高度判断其酶活性比较不同菌株同类酶的图柱高度判断其酶活性的大小的大小 2：混合菌株接种比例对酶活性的影响混合菌株接种比例对酶活性的影响折线图法折线图法以酶比为横坐标，酶活性为纵坐标；观察折以酶比为横坐标，酶活性为纵坐标；观察折线走向判断各种酶的活性变化趋势，并找出线走向判断各种酶的活性变化趋势，并找出最佳接种比例最佳接种比例第十六页，讲稿共十八页哦预期实验结果预期实验结果混合菌发酵产生的各酶活性均高于单菌发酵所混合菌发酵产生的各酶活性均高于单菌发酵所产酶的活性产酶的活性当混合菌当混合菌绿色木霉与黑曲霉的比例接绿色木霉与黑曲霉的比例接近时，发酵产生的酶的活性越高近时，发酵产生的酶的活性越高实际生产中可用混合菌提高对纤维素的利用实际生产中可用混合菌提高对纤维素的利用第十七页，讲稿共十八页哦感谢大家观看第十八页，讲稿共十八页哦