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1、-免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结 1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决.这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的相对，其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反响的速度、时间决定反响的量。就拿温度来说，可以有 4 度、室温、37 度，我推荐 4 度最正确，反响最温和，背景较浅；而 37 度反响速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的围，否则，尽量选择前两者。2、免疫组化最大的优势是定位和定性。相比于其他蛋白检测方
2、法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用 PBS 或非一抗替代一抗来进展反响，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。如今发 SCI 论文
3、时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢送，可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反响条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。7、实验方法需要动手+动脑。如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那，这是因为
4、我经过了反复的动手+动脑，把理论原理运用于实践，在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯穿。一、概念和常用方法介绍 1、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中*些化学成分的分布和含量进展组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学immunohistochemistry技术或免疫细胞化学immunocytochemistry技术。2、原理根据抗原抗体反响和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进展反响，前者再用标记辣根过氧化物酶 HRP或碱性磷酸酶AKP等的抗生物素如链霉亲和素等结合，最后通过呈
5、色反响或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞发生的抗原抗体反响产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定*些化学成分的分布和含量。3、分类 1按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。2按染色步骤可分为直接法又称一步法和间接法二步、三步或多步法。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。3按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶PAP法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物ABC法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结SP法
6、等，其中 SP 法是比拟常用的方法；聚合物，如即用型二步法，此方法尤其适合于源性生物素含量高的组织抗原检测。4、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1 免疫荧光方法是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出-一定波长的荧光，从而可确定组织中*种抗原的定位，进而还可进展定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。2免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于 60 年代开展起来的技术。根本原理是先以酶标记的
7、抗体与组织或细胞作用，然后参加酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞外表和细胞的各种抗原成分进展定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是：定位准确，比照度好，染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的开展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，且随着方法的不断改良和创新，其特异性和灵敏度都在不断提高，使用也越来越方便。目前在病理诊断中广为使用的有 ABC 法、SP 三步法、即用型二步法检测系统等。3免疫胶体金技术免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地
8、吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌 A 蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞的抗原进展定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进展光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。5、被检测的物质组织或细胞中但凡能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激 素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进展检测。6、特点 1特异性强。免疫学的根本原理决定抗原
9、与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白keratin显示上皮成分，LCA 显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在穿插抗原时，才会出现穿插反响。2敏感性高。在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍；现在由于 ABC 法或 SP 三步法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反响，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。3定位准确、形态与功能相结合。该技术通过抗原抗体反响及呈色反响，可在组织和细胞中进展抗原的准
10、确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进展定位观察，这样就可以进展形态与功能相结合的研究，对病理学领域开展深入研究是十分有意义的。7、从蛋白水平检测角度，免疫组化技术与 Western blotting、ELISA 的异同 1Western blotting：蛋白质免疫印迹，也是利用抗体抗原反响原理，结合化学发光等技术来检查组织或细胞样品蛋白含量的检测方法。与免疫组化技术相比，定量可能更加准确；当然 Western blotting 也可定性和定位通过提取膜蛋白或核蛋白、胞浆蛋白分别检测其中抗原含量，进而间接反映它们的定位，但敏感性远远低于免疫组化技术。2ELISA：酶联免疫吸附试验，
11、也是利用抗体-抗原-抗原结合反响原理来检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测。与免疫组化技术相比，定量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一。二、实验流程简介 1、SP 三步法 1石蜡切片，常规脱蜡至水。20.3%或 3%H2O2 去离子水无色液体孵育 10-30 分钟，以灭活源性过氧化物 酶活性。3 蒸馏水冲洗，PBS 浸泡 5 分钟 4候选步骤：采用抗原修复：微波建议 30 分钟 4 次中火、高压、酶修复方法。自然冷却，再用 3 分钟3 次.5血清封闭：室温 15-30 分钟，尽可能与二抗来源一致。倾去，勿洗。6滴加适当比例稀释的一抗，37孵育 23 小时或 4过夜最好复温。PBS 冲洗，3 分
12、钟5 次。7滴加生物素标记的二抗，室温或 37孵育 30 分钟-1h。8PBS 冲洗，3 分钟5 次。9滴加 SP链霉亲和素-过氧化物酶，室温或 37孵育 30 分钟-1h。10PBS 冲洗，3 分钟5 次。-11显色剂显色DAB 等。12自来水充分冲洗。13可进展复染，脱水，透明。14选择适当的封片剂封片。2、即用型二步法 1脱蜡、水化组织切片。2根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进展预处理。30.3%或 3%H2O2 去离子水孵育 5 分钟-30 分钟，以阻断源性过氧化物酶，PBS 或 TBS 冲洗。4滴加一抗，室温或 37孵育 3060 分钟，或 4过夜，PBS或 TBS 浸洗 3
13、分钟5 次。5滴加 enhangcer 增强剂，37 度 30min，PBS 或 TBS 浸洗 3 分钟5 次。6滴加通用型 IgG 抗体-Fab 段-HRP 多聚体，室温/37孵育 30 分钟-1h，PBS/TBS 冲洗，3 分钟5 次。7应用 DAB 溶液显色。8蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片。三、免疫荧光技术 1、免疫荧光方法中的重要环节 1冰冻切片制备：建议用新鲜组织，否则组织细胞部构造破坏，易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。2组织切片固定：切好片风干后立即用冰西奈山环保组织固定液固定5-10min，尤其要较长时间保存的白片，一定要及时固定
14、和适当保存。3血清封闭：为防止源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清与二抗来源一致封闭，减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般 10-30min。4一抗孵育条件：在免疫组化反响中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4 度、室温、37 度，其中 4 度效果最正确；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般 37 度 1-2h，而 4 度过夜和从冰箱拿出后 37 度复温 45min。具体条件还要摸索。5二抗孵育条件：二抗一般室温或 37 度 30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，假设是浓缩液还要摸索浓度，切记要避光反响。但在免疫荧光中我们一般先把
15、二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。最后，荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素残留，需要注意配制时小包装和并进展适当的离心。6复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进展定位。一般常用 DAPI 复染。7封片：为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。防止产生气泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片*一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。8切片清洗：为了防止一抗、二抗等试剂残
16、留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗延长时间和增屡次数尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是 3min*3 次，而一抗孵育后的清洗均为 5 次*5min。注意1单独冲洗，防止穿插反响造成污染。2温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式；3冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。4PBS 的 PH 和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄未见特异性染色，建议 PH 在 7.4-7.6 浓度是 0.01M。中性及弱硷性条件PH7-8有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解 9拍照：有
17、条件的话最好立即拍照，假设不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。使用荧光显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进展操作，不要随意改变程序；应在暗室中进展检查；防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜；检查时间每次以 12h 为宜，超过 90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射 35min 后，荧光也明显减弱或褪色；激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象；所以最多不得超过 23h；荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开场就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时，须待灯光充分
18、冷却后才能点燃。一天中应防止数次点燃光源。关闭汞灯至少在开启 15-30 分钟后；标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。假设将标本放在聚乙烯塑料袋中 4保存，可延缓荧光减弱时间，防-止封裱剂蒸发；使用的玻片等载体，都必须厚度均匀，无明显的自发荧光，如果使用油镜，还必须保证镜油为无荧光镜油；电源最好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。已有的常见免疫组化难题集锦 1、石蜡切片和冰冻切片的比拟.1要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，这是今天我向一教师请教得出的结论。因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求
19、做石蜡切片的，可作冰冻切片。2冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。缺点是细胞易形成冰晶而破坏细胞构造，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。3石蜡切片的优点可以保持组织细胞的形态构造，且容易存放在室温，而冰冻切片比拟麻烦，一定要存在-80 度的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的的切片，为了防止 RNA 降解，保存一贯很重要。由于石蜡切片可以切到 4 微米左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形
20、态都较冰冻切片好。2、一抗的选择要点和技巧是什么.1单克隆和多克隆抗体的选择。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹准确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反响中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色可以通过封闭等防止。2应用围的选择。有的一抗只能用于 Western blotting，或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等；甚至说明石蜡
21、切片或冰冻切片。3种属反响性的选择species reactivity。这一点很重要，说明这种抗体可能存在种属差异，且这种抗体适合检测哪种种属动物体的抗原。(4)种属来源，一般兔来源的多是多克隆；而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。根据此来源来选择相应的二抗。(5)生产厂家的选择。如 santa Cruz 公司抗体一般 1ml，价格 2100元左右；而 chemicon 公司一抗一般 100ul，价格 2800 元左右。这两个厂家的同一种抗体它的实际效价稳定是不同的，我一般用后者抗体做免疫组化效果较好，而前者做 Western blotting 效果还可以。3、在什么情况下使用 Triton*
22、-100.1Triton*-100 化学名称为聚乙二醇辛基苯基醚，是一种去污剂。在免疫组织化学(10um 厚切片)和免疫细胞化学中一般用 Triton*-100 作为细胞通透剂，在膜上打孔。2其作用原理：Triton*-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子构造的物质进入胞浆和胞核，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞与相应抗原结合。3)Triton*-100 既是一种外表活性剂，也有抗氧化作用，具体参阅：.d*y./bbs/post/viewbid=68&id=12301317&sty=1 4、封闭血清的选择原则是什么.1膜上或切片上有剩余的位点
23、可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性！2封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有穿插反响的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。3也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。5、抗体孵育条件的比拟.1一抗孵育温度有几种：4 度、室温、37 度，其中 4 度效果最正确；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般 37 度 1-2h，而 4 度过夜和从冰箱拿出后 37 度复温 45min。2二抗一般室温或 37 度 30min-1h，具体时间需要摸索。6、一抗 4 度孵育后为什么要进展 37 度复温.1一方面，防止切片从 4
24、度直接放入 PBS易脱片；2另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要,但对表达较弱的抗原可能有用,4 度和 37 度时分子运动方式不同,前者分子碰撞机率和运动速度小于后者,后者结合更-快,但敏感性也提高了并易造成非特异染色。3其实，我更赞同后一种说法，因为我尝试把肝脏或睾丸片子从 4 度过夜拿出后，直接用 PBS 洗没发生过脱片现象。事实胜于雄辩！7、DAB 显色时间如何把握.1DAB 显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；2DAB 显色时间很短如几秒或几十秒就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗
25、体孵育时间；3此外，假设很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；4DAB 显色时间很长如超过十几分钟才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短 最好一抗 4 度过夜；另一方面就是封闭时间过长。8、免疫组化结果如何分析.1阳性着色细胞计数法。在 40*光镜下，随机选择不重叠的10 个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组 36 不同动物组织切片，然后进展组间比拟即可。2灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择一样区域、一样条件下用 image j 进展灰密度分析，然后进展统计分析即可。3评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别
26、按染色程度03 分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色、阳性围进展评分14 分为 025%、2650%、5175%、76100%，最终可以分数相加，再进展比拟。对于以上这几种方法，各有利弊，请细心选择。要想得到正确结果的前提是你要做出着色均匀、背景很浅的高质量切片。9、在什么情况下进展组织抗原修复，抗原修复的条件是什么.1由于组织中局部抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性。通过抗原修复，使得细胞抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。2修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为假设干种具体的可以查阅相关资料，大量的：中性的、
27、高 pH 的等。3微波修复，我们一般用 6min*4 次，效果不错。10、源性过氧化物酶的灭活时间和浓度是什么.1一般 3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min 左右；而 0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般 1030min。2用西奈山环保组织固定液配置过氧化氢比双蒸水或 PBS 能更好保护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片。3现用现配，配好后 4 度避光保存。11、如何才能充分脱蜡.1蜡不溶于水，如果脱蜡不干净，少许蜡存留于切片上，将会引起染色不均匀、阳性物时隐时现、真假难辨、背景染色增加等。为了解决上述的问题，切片在染色前必须彻底脱蜡，目前用于脱蜡的试剂主要是二甲苯
28、，因它脱蜡力强，脱蜡时间较短；2脱蜡的时间要根据季节，室温和试剂的新鲜谋面是在不同。如果在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5 分钟就已足够。如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较旧，则脱蜡时间需要延长，10-20 分钟或更长。3当天切的切片，烧烤 2小时后进展染色，切片带有温度进展脱蜡这将可加速脱蜡的过程，如果预先切好烤好的切片，在染色前，还必须对切片进展加温 10-20 分钟，然后再行脱蜡，这样脱蜡速度加快，效果魁伟更好。总之，操作时应根据不同的季节，不同的室温，不同的试剂来决定，脱蜡的时间，原则上是要彻底、干净、完全地脱去切片上的蜡。12、如何最大限度地降低组织非特异性
29、染色.1缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。2一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。3 源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高 含血细胞多的组织，需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；4非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；5缩短 DAB 孵育时间或降低 DAB 浓度/过氧化氢浓度等；6适当增加 PBS 冲洗-次数和浸洗时间，在一抗、二抗或 SP 孵育之后的浸洗尤为重要；7防止标本染色过程中出现干片，这容易增强非特异性着色。13、木素复染时间的把握.1木素复染时间要看
30、当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况，一般数秒-数分钟。不过这个如果染色不理想可以补救的。即：染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置于木素中染色即可。2盐酸酒精是分化，氨水是返兰。作用不同。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒一定动作要快后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。3如果分化的颜色过浅，可以复置于木素中染色。14、PBS 的清洗方式选择、次数和时间的选择.1 单独冲洗，防止穿插反响造成污染。临床上每天检测的病例很多，所用的抗体种类及工程也多，如果在参加一抗孵育完后，将它们在一个缸洗，这样就会造成穿插污染，影响最后的结果。正确的做法是单独地进展冲洗，冲洗的 PBS 为
31、一次性，保证切片没有相互穿插污染的时机。2温柔冲洗，防止切片的脱落。冲洗切片，取出切片，将 PBS 从上轻轻地冲洗，让 PBS 自上而下流下来，不要拿起切片将 PBS 对准切片冲洗，这样由于冲出的 PBS 有一定的冲击力，很容易使切片周边引起松动，导致切片的脱落。3冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。冲洗切片有人提出用微振荡器振染，振下未结合的各种物，使之不产生背景，此种做法一是浪费时间，二是很容易导致切片的脱落。切片的冲洗据实践认为，用一小烧杯柔和地于切片上冲洗，就能彻底冲洗去未结合的物质，无需附加其它条件，冲洗好于切片上再注入 PBS，持续 2 分钟左右就完全足够了。4PBS 的 P
32、H 和离子强度的使用和要求。彦仿指出：中性及弱硷性条件PH78有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解。免疫组化 PBS 我们目前常用的 PBS 的PH 在 7.4-7.6 浓度是 0.01M，根据本室十几年来的使用情况，认为该溶液价格廉价配制方面，使用效果好。5常用试剂的配制和使用。在免疫组织化学的染色过程中，用得最多的试剂就是缓冲液，因为切片在整个染色中，抗体的加、换、切片的冲洗，DAB 的配制都离不开缓冲液。可见缓冲液在整个染色中都起至关键的作用，缓冲液的过酸或偏碱，都将影响染色的结果。15、脱片产生的原因和如何防止脱片.
33、1多聚赖氨酸玻片质量的问题。我原先是买的，迈新按说也是不错的，可是都脱成什么样子了。后面补做第二批时用的病理科教师自己做的片子，要好一点。2组织切的不好，切片机的问题例如比拟老的旧的机器切的厚或者不均匀，或者切片者手法不好等。3组织的问题，我用的组织癌症的很多，越是癌症组织有坏死之类越容易脱。4没烤好，时间短温度不够之类。5操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水。6修复的问题：抗原修复的时候高压时间过长了，或者放进 100 度的修复液时手法不好，咚的一声就丢进去了，这样超容易脱片。此外，用 EDTA 修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到 EDTA 的时候
34、也没方法，只有从另外的问题上着手。7此外，一旦见到有组织漂起来操作就更加要慎重，用 PBS 的时候尽量用泡的，不要冲。根本上把这些方面都注意到了，能改善的尽量改善，脱片可以减少很多。16、背景染色较深的原因有哪些.1抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决方法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进展测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进展染色。2抗体孵育时间过长或温度较高：解决方法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，防止因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法Polymer敏感性很高，要求一抗孵
35、育的时间不是传统的 1 小时，而是 30 分钟，因此，要根据染色结果进展调整。3DAB 变质和显色时间太长：DAB 最好现用现配，如有沉渣应进展过滤后再用。配制好的 DAB 不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出-氧原子与 DAB 产生反响而降低 DAB 的效力，未用完的 DAB 存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的方法是不可取的。DAB 的显色最好在显微镜下监控，到达理想的染色程度时立即终止反响。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进展监控，防止显色时间过长。4组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、
36、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的方法是操作要认真仔细，采用 DAKO 笔或 PAP Pen 在组织周围画圈，可以有效的防止液体流失，也能提高操作速度。5切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长大于 24小时：原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进展免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在 4C 冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。6一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比拟。17、木素复染后氨水返蓝这一步如何做、浓度多少、时间多长答：返蓝可以用碱性溶液PBS/Na2HPO4/淡氨水或 45 度温水、冷水蓝化均可。一般蓝化 510 min。淡氨水有人用 50ml 自来水三四滴的氢氧化铵