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1、实验四 血液的组成和红细胞比容 的测定 目的 了解血液的组成，学习和掌握测定红细胞比容 的方法。原理 血液由血浆和血细胞组成，加抗凝剂使血液成为抗凝血，静置或经过离心，可将血浆和血细胞分离。上面无色（或淡黄色）半透明的部分为血浆，下面红色部分为红细胞，在血浆和红细胞之间有一薄层灰白色部分为白细胞和血小板。若不加抗凝剂，任其自然凝固则析出血清。血液脱去纤维蛋白后则不会凝固，称脱纤血。红细胞占全血的体积百分比叫红细胞比容（hematocril value），可用分血管，如温氏分血管（Wintrob es hematocrit tube）离心分离。实验中将一定量的抗凝血灌注于特制有刻度的毛细玻璃管中
2、（或溫氏分血管）中，用离心沉淀的方法使血细胞与血浆分离。离心后血细胞下沉，彼此压紧而又不改变细胞的正常形态。根据分血管上刻度，可计算出红细胞在全血中的容积比值，即为红细胞比容（压积）（图 6.1-1）。实验对象 哺乳动物（种类不限）实验材料 草酸盐抗凝剂、或 10 gL-1 肝素，75%酒精，温氏分血管,酒精灯，离心机，天平，注射器，长针头，干棉球，带有开叉橡皮管的玻棒，烧杯等。实验方法与步骤 1温氏分血管比容测定 1.草酸盐抗凝剂配成水溶液，取适量该溶液（根据取血量确定抗凝剂溶液用量，如草酸钾，每 1ml 血需加 1-2mg。配制 10%水溶液，每管加 0.1ml 则可使 5-10ml 血液
3、不凝固），放入大试管，烘干后备用。2.取血：可采取静脉取血或心脏取血，将血液沿大试管壁缓慢放入管内，用涂有凡仕林的大拇指堵住试管口，缓慢颠倒试管 23 次，让血液与抗凝剂充分混匀，并不使血细胞破碎，制成抗凝血。用带有长注针头的注射器，取抗凝血 2 ml 将其插入分血管的底部，缓慢放入，边放边抽出注射针头，使血液至刻度 10 cm 处。1.离心：将分血管以 3000 rmin-1 离心 30 min，取出分血管，读取红细胞柱的高度，再以同样的转速离心 5 min，第二次读取红细胞柱的高度，如果读数与前次相同，表明红细胞已被压紧。该读数即为红细胞比容值。例如，读数为 4.2 cm，即表示 100m
4、l 血液中红细胞容积占 42ml，或者以4.2 乖以 10 即得到红细胞比容的数值。2取新鲜血 20ml 放在小烧杯中，用顶端带有开叉橡皮管的玻璃棒搅动数分钟后，可见开叉的橡皮管上有许多丝状物缠绕，此即为纤维蛋白。经水冲洗后，观察其颜色及韧性。脱去纤维蛋白的血液则称为脱纤维蛋白血液，简称脱纤血。3取新鲜血 2ml,加入到无抗凝剂的试管中，静置数分钟，可发生血液凝固现象，血凝块回缩，挤出的液体即为血清。注意事项 1选择抗凝剂必须考虑到不使红细胞变形、溶解。草酸钾使红细胞皱缩，而草酸銨使红细胞膨胀，二者配合使用可互相缓解。2血液与抗凝剂混合时应避免剧烈振动，引起红细胞破裂。3操作过程应在 2 小时
5、内完成，以免溶血和水分蒸发。抗凝血加入到分血管中应避免产生气泡，影响读数的准确性。思考题 1血液由哪些成分组成，各有什么生理作用。2血浆和血清有何区别，如何制备？3测定红细胞比容的实际意义是什么？实验六 血红蛋白的测定 目的 掌握用直接比色法测定动物血红蛋白的含量。原理 血红蛋白的颜色常与氧的结合量多少有关，因而不利于比色。但当用氧化剂，如盐酸将其氧化时，可使其转变为稳定、棕色的高铁血红蛋白，而且颜色与血红蛋白（或高铁血红蛋白）的浓度成正比。与标准比色板比色，从而测得血红蛋白含量。通常以每 100ml 血液中含血红蛋白克数来表示。实验对象 哺乳动物（种类不限）实验材料 沙里血红蛋白计、抗凝血、
6、0.1N HCl、蒸镏水、棉球等。实验方法与步骤 1 沙里血红蛋白计 主要由标准褐色玻璃比色箱和 1 只方形刻度测定管组成。比色管两侧通常有两行刻度；一侧为血红蛋白量的绝对值，以 gdl-1(每 100 ml血液中所含血红蛋白的克数)表示，从 222 g；另一侧为血红蛋白相对值，以%（即相当于正常平均值的百分数）来表示，从 10%160%。为避免所使用的平均值不一致，因此一般采用绝对值来表示。实验前应先检查血红蛋白计和测定管是否清洁，如不清洁要洗涤干净，待清洁后方可开始实验。2具体测定方法如下：用滴管加 56 滴 0.1 mol/L HCl 到刻度测定管内,至管下方刻度“2”或 10%处。用血
7、红蛋白吸管吸取血液至 20 l 处，用脱脂棉仔细揩去吸管外的血液。将吸血管中的血液轻轻吹到测定管底部的盐酸中，反复以上清吸吹 3 次，使吸管壁上的血液全部进入测定管中。在吸吹时尽量避免产生气泡,以免影响比色。用细玻棒轻轻搅动，将血液与盐酸充分混合，静置 10 min，使管内的盐酸和血红蛋白完全作用，形成棕色的高铁血红蛋白。把比色管插入标准比色箱，使无刻度的两面位于空格的前后方向，便于透光和比色。用滴管向比色管内逐滴加入蒸馏水，并不断搅匀，同时对着自然光用肉眼进行比色，直至溶液的颜色与标准比色板的颜色相同为止。读出管内液体凹面所在的刻度，可以是相对值，也可以是绝对值，可参照血红蛋白计的使用说明书
8、。国产沙里氏血红蛋白计通常 100%相当于 14.5 克，如液体表面在刻度 70%处，要计算其绝对克数，可用下列比例求得：x:14.5=70:100,x=10.15。注意事项 1要准确用吸血管吸取和转移 20 l 血液至比色测定管中，若吸入过快，有盐酸或血液被吸入采血管的乳胶头，则应将吸管洗涤干净，重新吸血。洗涤过程是：先用清水将血迹洗去，然后再依次吸取蒸馏水、95%酒精、乙醚洗涤采血管 12次，使采血管内干净、干燥。2 血液和稀盐酸的作用时间不能少于 10 分钟，不然血红蛋白不能充分变成高铁血红蛋白，使结果偏低。3比色应在散射自然光下进行，避免在黄色灯光下进行比色，以免影响结果。4加蒸馏水时
9、，开始可以多加几滴，随后逐滴加入，并用玻棒不断混匀，以防稀释过度。思考题 测定血红蛋白的方法有哪些？实验八 红细胞沉降率（血沉）测定 目的 了解红细胞沉降率的意义并掌握其测定方法。原理 将加有抗凝剂的血液置于一特制的具有刻度的玻璃管（血沉管）内，置于血沉架上，由于红细胞的比重比血浆大，经过一定时间，红细胞因重力作用而逐渐下沉。通常以第 1 小时末红细胞下降的距离,作为红细胞沉降速率（ESR），简称为血沉。血沉的快慢取决于红细胞是否相互叠连，红细胞叠连后，表面积与容积减少，因而与血浆的磨擦力减少，沉降加快。而红细胞叠连的形成，主要取决于血浆的成分。临床上某些疾病可引起血沉加快，因此血沉具有临床诊
10、断意义。实验对象 哺乳动物（种类不限）实验材料 抗凝血、魏氏血沉管、血沉管架，试管，采血针，2ml 移液管，消毒 5ml 注射器及 8 号针头，棉签，75%的酒精棉球，碘酒，3.8%柠檬酸钠溶液等。实验方法与步骤 1取血：静脉取血 1.6 ml，加入含 3.8%柠檬酸钠 0.4 ml 的小试管中，轻轻颠倒小试管 34 次，使血液与抗凝剂充分混匀。2吸血：用干燥的魏氏沉降管从小试管内吸血至至刻度“0”处，管内不能有气泡，试去血沉管下端外面的血液，将血沉管直立于血沉架上，并计时。3观察结果：1 h 末，准确读出红细胞下沉后暴露出的血浆段高度，即为红细胞沉降率（mm/h）。注意事项 1抗凝剂与血液比
11、例为 1：4，并充分混匀。2血沉管放置要垂直，不得有气泡和漏血。3沉降率随温度的升高而加快，故应在室温 2227左右为宜，全部测定过程应在采血后 2 h 内完成。4血沉管必须清洁，如内壁不清洁可使血沉显著变慢。思考题 影响红细胞沉降率的因素是什么？实验七 红细胞脆性的测定 目的 学习测定红细胞渗透脆性的方法，理解细胞外液渗透张力对维持细胞正常形态与功能的重要性。原理 红细胞在高渗溶液内会因失去水分而皱缩；反之，在低渗溶液内，则水分进入红细胞，使红细胞膨胀。如溶液渗透压继续下降，红细胞会膨胀而破裂，并释放血红蛋白，称之为溶血。红细胞膜对低渗溶液的抵抗力称为红细胞渗透脆性。其大小可用 NaCl 溶
12、液浓度的高低来衡量，对低渗盐溶液抵抗力大的其渗透脆性较小，抵抗力小的其渗透脆性较大。将血液滴入不同浓度的低渗NaCl 溶液中，开始出现溶血的 NaCl 溶液浓度为该血液红细胞的最小抵抗力。而刚出现完全溶血的 NaCl 溶液浓度为该血液红细胞的最大抗力。最小抵抗力代表其最大脆性，而最大抵抗力代表其最小脆性。生理学上将与血浆渗透压相等的溶液称为等渗溶液，而将能使悬浮于其中的红细胞保持正常形态和大小的溶液称为等张溶液，等渗溶液不一定是等张溶液（如1.99%的尿素溶液）。实验对象 动物种类不限。实验材料 抗凝血，1%氯化钠溶液，蒸馏水，10ml 小试管，试管架，滴管，1 ml移液管，1.99%尿素。实
13、验方法与步骤 1 溶液配制：取口径相同 10 支小试管编号排列于试管架上，按下表将 1%的 NaCl稀释成不同浓度的低渗溶液，每管溶液均为 2ml。试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1%NaCl(ml)1.40 1.30 1.20 1.10 1.00 0.90 0.80 0.70 0.60 0.50 蒸馏水（ml）0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 NaCl 浓度（%）0.70 0.65 0.60 0.55 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 2加抗凝血：用滴管吸取抗凝血，在各试管中各加一滴
14、，轻轻摇匀（用拇指堵住试管口，顺序将试管缓慢倒置二次。3在室温下静置 12 h。4观察结果：依据各管中液体颜色和浑浊度的不同，判断红细胞溶血程度。试管内液体下层为浑浊红色，上层为无色透明，表明无红细胞破裂，未发生溶血。试管内液体下层为浑浊红色，上层出现透明红色，表示部分红细胞破裂，称为不完全溶血。试管内液体完全变成透明红色，管底无红细胞沉淀，表明红细胞完全破裂，称为完全溶血。5红细胞渗透脆性范围：根据前述原理判断出开始溶血及刚开始完全溶血的试管，前者的NaCl 浓度为红细胞的最小抗力，后者为红细胞的最大抗力。6等渗溶液和等张溶液：另取两支试管，分别加入 0.85%和 1.99%尿素各 2ml,
15、随后分别各加一滴抗凝血，轻轻颠倒混匀，观察比较其溶血情况并分析原因。注意事项 1.小试管要干燥，加抗凝血的量要一致，滴管握持角度尽可能一致。2.血液滴入试管后，立即轻轻混匀，避免人为溶血。3.配制不同浓度的 NaCl 溶液必须准确。NaCl 溶液的浓度梯度可根据畜禽特点进行调整。思考题 1.为什么同一个体不同红细胞的渗透脆性存在差异？2.等渗溶液和等张溶液的区别？3.测定红细胞渗透脆性有何临床意义？实验五 红细胞和白细胞细胞计数 目的 了解红细胞、白细胞人工计数原理，并学习其测定方法。原理 血液中血细胞数很多，无法直接计数，需要将血液稀释后，置于血细胞计数板的计数室内，在显微镜下计数一定容积的
16、稀释血液中的红、白细胞数量，然后将之换算成每升血液中所含的红、白细胞数。白细胞稀释液可破坏血细胞膜，但白细胞中有核，故可通过在计数室内计数一定体积血液中所有的白细胞核数，来进行白细胞计数。实验材料 抗凝血，血红蛋白吸管，试管架，小试管，移液管，洗耳球，显微镜，血细胞计数板（包括盖玻片），计数器，蒸馏水，75%酒精，95%酒精，乙醚，1%氨水，红细胞和白细胞稀释液 哺乳动物红细胞稀释液：NaCl 0.5g，Na2SO410H2O 2.5g，HgCl 0.25g，蒸馏水加至 100 ml。也可用生理盐水做稀释液 哺乳动物白细胞稀释液：冰醋酸 1.5 ml,1%结晶紫 1 ml 加蒸馏水至 100
17、ml。鱼用血细胞稀释液：NaCl 0.7g（在遇到病鱼或红细胞脆性较大的鱼易出现溶血现象时，NaCl 可调整到 0.70.8 g）,中性红 3 mg,结晶紫 1.5 mg,甲醛 0.4 ml,加蒸馏水至 100 ml。白细胞核被染成兰色，红细胞核呈非常淡的浅灰色或基本不染色，红细胞形态基本不变。在显微镜下容易区分。此液有效期较长。实验方法和步骤 1血细胞计数板的构造：计数板为一块长方形厚玻璃板。每块计数板由“H”型凹槽分为两个同样的长方形平台 6.5-1)。平台比整个玻璃板的平面低 0.1 mm，所以当盖上一块盖玻片时，平台与盖玻片之间的距离（即高度）为 0.1mm。在低倍显微镜下观察，两平台
18、的中心部位各有一计数室，为边长是正方形的3.00 mm的方格，平均分成边长为 1 mm 的 9 个大格。每个大格容积为 0.1mm3。在 9个大格中，位于四角的四个大方格是计数白细胞的区域，每个大方格又用单线分为 16 个中方格；位于中央的大方格用双线分成 25 个中方格，其中位于正中及四角的 5 个中方格是计数红细胞和血小板的区域，每个中方格又用单线分为16 个小方格(图 6.5-2)。实验前检查血细胞计数室是否清洁。计数室只能用自来水和蒸馏水相继冲洗，然后用丝绢轻轻试净，切不可用酒精和乙醚洗涤。2血液的稀释 采血与血液的稀释：(1)加稀释液：用 5 ml 移液管取红细胞稀释液（或生理盐水）
19、4 ml 加入一小试管中，备用。用 1 ml 移液管取白细胞稀释液 0.38 ml 于另一小试管中，备用。(2)用血红蛋白吸管吸取混匀的抗凝血 20l，用脱脂棉擦去吸管外壁多余血液后，分别加至有红细胞稀释液和白细胞稀释液试管的底部，并抽吸数次，以洗去血红蛋白吸管内粘附的血液。然后分别颠倒小试管数次，使稀释液与血液混匀。这样使红细胞稀释了 200 倍，白细胞稀释了 20 倍。(3)将计数室上的盖玻片放妥并置于显微镜的载物台上，用吸管吸取稀释血液，弃去 12 滴，然后沿盖玻片边缘滴入，让其自然流入计数室内，静置 3 分钟即可计数。3计数：（1）计数红细胞：把计数室中央的大方格置于视野内，在高倍镜下
20、计数中间大方格内四角及中央的 5 个中方格内红细胞总数。计数视野的移动路线如图 8.5-3所示。如果细胞压边线，则按数上不数下，数左不数右原则进行。如果各中方格内的红细胞数相差 20 个以上，则说明血细胞分布不均匀，需振荡稀释液，重新布血。（2）白细胞计数：在低倍镜下，计数计数室四角 4 个大方格中所有的白细胞总数，四角各大方格内的白细胞数相差 8 个以上，亦需重新布血。4计算：血细胞数/mm3=血细胞计数值计数体积（mm3）稀释倍数 （1）红细胞：红细胞数L-1=N20010106255-1=N1010 N：表示 5 个中方格内数得的红细胞数；255-1：将五个中方格红细胞数换算为一个大方格
21、内红细胞数；10：将一个大方格内红细胞数换算为 1l 血液内红细胞数。106：1L=106l。200：为血液稀释倍数。(2)白细胞:白细胞数L-1=N4-12010106=N5107 N：表示 4 个大方格内数得的白细胞数；N4-1:换算成每个大方格内的白细胞数；10：将一个大方格内白细胞数换算为 1l 血液内白细胞数。106：1L=106l。20：为血液稀释倍数。注意事项 1.吸取血样前应轻摇混匀，避免溶血。2.吸取血液时,采血管中不得有气泡,吸血和稀释液的体积一定要准确。3.显微镜载物台需保持水平，不得倾斜。思考题 1.操作过程中有哪些因素可能影响血细胞计数的准确性？2.红细胞和白细胞稀释
22、液对血细胞的作用有何不同？实验九 血液凝固 目的 了解血液凝固的基本过程及加速和延缓血液凝固的一些因素。原理 血液由流动的溶胶状态变成不能流动的凝胶状态，这一过程称血液凝固。是由多种凝血因子参与的化学连锁反应，大致可分为三个步骤，即：凝血酶原激活物的形成；凝血酶原激活物催化凝血酶原转变为凝血酶；凝血酶催化纤维蛋白原转变为纤维蛋白，最后形成血凝块。这三个步骤都需要Ca2+的参与。根据血液凝固的凝血因子的不同，血液凝固又有内源性凝血和外源性凝血之分，前者参与血液凝固的因子全部存在于血浆，而后者则有来源于组织的组织因子参与。通过测定不同条件下的血液凝固时间，可以了解温度、接触面光滑程度等因素对血液凝
23、固的影响。实验对象 家免 实验材料 采血器具（动脉夹、兔动脉插管）、25%氨基甲酸乙酯溶液，肝素（8 U/ml）、2%草酸钾溶液、生理盐水，液状石蜡、试管架、试管 8 支、冰块、秒表、小烧杯等。实验方法与步骤 1静脉注射氨基甲酸乙酯溶液，按 5 ml/kg 的量，将兔麻醉，仰卧固定于兔手台上。正中切开颈部，分离一侧颈总动脉，远心端用线结扎阻断血流，近心端夹上动脉夹。在动脉上斜向剪一小切口，插入动脉插管(或细塑料导管)，结扎固定，以备取血，需要放血时开启动脉夹即可。2制备肺组织浸液 取新鲜兔肺脏，洗净血液，剪成小碎块置于烧杯中。在烧杯中加入 3-4 倍生理盐水混匀，放冰箱中备用。3取 8 支试管
24、，按下列要求准备各种不同的实验用品。表 6.8-1 血液凝固及其影响因素 实验管号 实验处理 凝血时间 1 不加任何处理（对照管）2 用液状石蜡润滑整个试管内表面 3 放少许棉花 4 置于有冰块的小烧杯中 5 置于盛有 3740温水的小烧杯中 6 加肝素 8U（加血后摇匀）7 加 2%草酸钾 12 ml（加血后摇匀）8 加肺组织浸液 0.1 ml 4每管加入血液 2 ml。5记录凝血时间 每个试管加血 2 ml 后，即刻开始计时，每隔 30 s 倾斜一次，观察血液是否发生凝固，至血液成为凝胶状不再流动为止，记录所经历的时间，并填入上表。注意事项 1.采血和加血样的过程尽量要快，以减少操作计时误
25、差。2.记时、加血样、倾斜试管等可以多个同学参与，各负其责，分工合作。思考题 1.分析上述各项处理影响血液凝固时间的机理。2.为什么正常动物体内的血液不会凝固。实验十 红细胞凝集现象 目的 了解红细胞凝集现象。学习 ABO 血型鉴定和交叉配血的方法。原理 红细胞膜上含有凝集原，血浆内含有凝集素。当相应的凝集原和凝集素相互作用时，就产生红细胞凝集。不同种动物的血液相互混合时，有时会产生红细胞凝集，称异族血细胞凝集作用；同种不同个体间的红细胞凝集，称同族血细胞凝集作用。ABO 血型系统是根据红细胞表面有无 A 或（和）B 抗原，而将其分为 A、B、AB 和 O 四种基本血型。当不同血型的红细胞与血
26、清在玻片上混合，会发生凝集反应，同时伴有溶血。一般 A 型标准血清中含有抗 B 凝集素，B 型标准血清中含有抗 A 凝集素，因此可以用标准血清中的凝集素与被测者红细胞反应，来进行血型鉴定。临床上血型鉴定后需做交叉配血试验，即将受血者的血清与红细胞分别与供血者的红细胞和血清混合），观察有无凝集反应，无凝集现象才可以输血。实验对象 正常人或动物 实验材料 A 型、B 型标准血清。双凹玻片，采血针，竹签，75%酒精棉球，干棉球，玻璃蜡笔（记号笔），尖头滴管，显微镜等。实验方法与步骤 1同族血细胞凝集现象 将某种动物的血清分两处滴于载玻片上，然后将别种动物的血液各一滴分别加入上述血清内，轻轻摇动载玻片
27、，或用牙签搅拌混匀，使血液与血清充分混合。静置 5-10 分种，在显微镜下（或肉眼）观察是否发生凝集。2异族血细胞凝集现象 将某一动物的血清滴于载玻片上，然后用同种不同个体的血液加入，并使其混合均匀。同上法观察是否发生凝集现象。3ABO 血型的鉴定：（1）取双凹玻片一块，在两端分别标上 A 和 B，中央标记受试者的号码。（2）在 A 端和 B 端的凹面中分别滴上相应标准血清少许。（3）75%酒精棉球消毒无名指端，用采血针刺破指端，用消毒后的尖头滴管吸取少量血（也可用红细胞悬浮液，见下述），分别与 A 端和 B 端凹面中的标准血清混合，放置 1015 min 后，能肉眼观察有无凝血现象，肉眼不易
28、分辨的用显微镜观察。（4）根据凝集现象的有无判断血型（图 6.9-1）。4交叉配血实验 图 6.9-1 ABO 血型鉴定示意图 （1）以碘酒和酒精消毒皮肤后，以消毒的注射器分别抽取供血动物和受血动物静脉血 2ml，取一滴加入盛有 1ml 生理盐水的小试管中，制成 2%红细胞悬浮液，其余血液注入另一小试管中，待血液凝固后离心析出血清。（2）在双凹玻片两端分别标上供血动物和受血动物的名称或代号，分别滴上它们的血清少许。（3）将供血者的红细胞悬浮液吸取少量，滴到受血者的血清中（称为主侧配血,图 6.9-2）；将受血者的红细胞悬浮液吸取少量，滴入供血者的血清中（称为次侧配血），混合。放置 1030 min 后，肉眼观察有无凝集现象，肉眼不易分辨的用显微镜观察。如果两侧交叉配血均无凝集反应，说明配血相合，能够输血。如果主侧发生凝集反应，说明配血不合，不论次侧配血如何都不能输血。如果仅次侧配血发生凝集反应，只有在紧急情况下才有可能考虑是否输血。注意事项 1吸 A、B 型标准血清及红细胞悬液时，应使用不同的专用滴管。2肉眼不能做出判断是否发生凝集现象时，应在低倍显微镜下观察。3用牙签将血液与标准血清混匀时，谨防两种血清接触。思考题 1.除了 ABO 血型外还有有什么血型系统？分类标准是什么？2.同型血型相输时，是否需做交叉配血试验？为什么？