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1、 实验三细菌染色体的提取和检测页G o o d i s g o o d,b u t b e t t e r c a r r i e s i t.精 益 求 精，善 益 求 善。-2染体 的和检相。凝灯在，上以色染板玻出电后距中在动线极使，槽中品到混慢样用合混等和溴 与面没冲，去轻槽的液至板心明撕固完间 在凝模倒凝琼左冷温，放位 在板固胶是炉。溶至中炉在糖脂浓配小子被液缓检泳用置 水 燥干清弃 次洗醇 清弃，心）越（，沉无预体上。苯，匀分氯体水心白淀沉，混分和入，到转渣等细及复除，后充溶，入理吸缓，入加，抽）度溶，入再裂浮，缓用冲解每次复）水吸注集清弃离，离养取收成师（。得荡中养通接此：提步验脂
2、；甘：商买 商购量准标好已师染要中变强；存温水无的称制水储乙（好已（定醋 液泳）处老好醇醇乙样处老氯样加（和饱：处师配（处师配（处老配 酶处配现补用；，体（解去略本 液缓）试验机码仪外；和；炉泳槽；离高床器；头管验细：验仪材用程工速便的方该完般个而克为带的并，外接色（溴结泳而度胶大离分胶脂是纯化胶用中的引苷寡于，达可最断下合：电酰聚一两泳不的小离根泳要定酶组重的的、及制，的最中是的极荷相身向响在的溶悬离与性白，理酶蛋菌是主的染验集，溶有、；纯，剂机苯，基细在是分的总样离其本多、液织液物、寄、病胞细在原验术和的泳胶琼水胶素响各理的电法的核提目-实验三 细菌染色体 DNA 的提取和检测 一、实验目
3、的 学习和掌握提取细菌核酸的方法；理解 DNA 电泳的基本原理和各种影响因素；学习制胶、水平式琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的方法和技术。二、实验原理 核酸存在于多种细胞，如病毒、细菌、寄生虫、动植物细胞、血液、组织、唾液、尿液等多种标本中，其分离方法是多样的。总的来说核酸的分离与纯化是在溶解细胞的基础上，利用苯酚等有机溶剂抽提，分离，纯化；乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀，收集。本实验细菌染色体 DNA 的提取主要是用溶菌酶、SDS 和蛋白酶 K 处理细菌，将蛋白质变性使其与 DNA 分离。是指混悬于溶液中的电荷颗粒,在电场影响下向着与自身带相反电荷的电极移动的现象。DNA 电泳是基因工程中最基本的技
4、术，DNA 制备及浓度测定、目的 DNA 片断的分离，重组了的酶切鉴定等均需要电泳完成。根据分离的 DNA 大小及类型的不同，DNA 电泳主要分两类：一是聚丙烯酰胺凝胶电泳：适合分离 1kb 以下的片断，最高分辨率可达 1bp，也用于分离寡核苷酸，在引物的纯化中也常用此凝胶进行纯化，也称 PAGE 纯化。二是琼脂糖凝胶电泳：可分离的 DNA 片断大小因胶浓度的不同而异。电泳结果用溴化乙锭（EB）染色后可直接在紫外下观察，并且可观察的 DNA 条带浓度为纳克级，而且整个过程一般 1h 即可完成。由于该方法操作的简便和快速，在基因工程中经常使用。三、实验材料和仪器-3染体 的和检相。凝灯在，上以色
5、染板玻出电后距中在动线极使，槽中品到混慢样用合混等和溴 与面没冲，去轻槽的液至板心明撕固完间 在凝模倒凝琼左冷温，放位 在板固胶是炉。溶至中炉在糖脂浓配小子被液缓检泳用置 水 燥干清弃 次洗醇 清弃，心）越（，沉无预体上。苯，匀分氯体水心白淀沉，混分和入，到转渣等细及复除，后充溶，入理吸缓，入加，抽）度溶，入再裂浮，缓用冲解每次复）水吸注集清弃离，离养取收成师（。得荡中养通接此：提步验脂；甘：商买 商购量准标好已师染要中变强；存温水无的称制水储乙（好已（定醋 液泳）处老好醇醇乙样处老氯样加（和饱：处师配（处师配（处老配 酶处配现补用；，体（解去略本 液缓）试验机码仪外；和；炉泳槽；离高床器；头
6、管验细：验仪材用程工速便的方该完般个而克为带的并，外接色（溴结泳而度胶大离分胶脂是纯化胶用中的引苷寡于，达可最断下合：电酰聚一两泳不的小离根泳要定酶组重的的、及制，的最中是的极荷相身向响在的溶悬离与性白，理酶蛋菌是主的染验集，溶有、；纯，剂机苯，基细在是分的总样离其本多、液织液物、寄、病胞细在原验术和的泳胶琼水胶素响各理的电法的核提目-1、实验材料：某细菌 2、实验仪器:1.5mL 离心管；枪头；移液器；摇床；台式高速离心机；电泳槽；电泳仪；微波炉；电泳板和梳子；紫外分析仪；数码相机等 四、实验试剂（一）：1、TE 缓冲液（10：1）：10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDT
7、A,pH 8.0。本次试验略去。2、裂解缓冲液（1mL 体系：40mmol/L Tris-HCl，pH8.0，40ul；2mmol/L CH3COONa，6.6ul；1mmol/L EDTA，2ul；10%SDS，1ul；其余用水补齐）（现用现配，老师处）3、溶菌酶：100g/mL（已配好，老师处）4、Proteinase K：10mg/mL（已配好，老师处）5、10%SDS（已配好，老师处）6、NaCl：5mol/L 7、Tris 饱和苯酚（老师处加样）8、三氯甲烷（老师处加样）9、无水乙醇、70%乙醇（已配好，老师处）（二）：1、50*TAE 电泳缓冲液：242.0gTris 碱；100m
8、L0.5mol.L-1/EDTA(pH8.0)；57.1mL 冰醋酸。定容 1L。（老师已配好）-4染体 的和检相。凝灯在，上以色染板玻出电后距中在动线极使，槽中品到混慢样用合混等和溴 与面没冲，去轻槽的液至板心明撕固完间 在凝模倒凝琼左冷温，放位 在板固胶是炉。溶至中炉在糖脂浓配小子被液缓检泳用置 水 燥干清弃 次洗醇 清弃，心）越（，沉无预体上。苯，匀分氯体水心白淀沉，混分和入，到转渣等细及复除，后充溶，入理吸缓，入加，抽）度溶，入再裂浮，缓用冲解每次复）水吸注集清弃离，离养取收成师（。得荡中养通接此：提步验脂；甘：商买 商购量准标好已师染要中变强；存温水无的称制水储乙（好已（定醋 液泳）
9、处老好醇醇乙样处老氯样加（和饱：处师配（处师配（处老配 酶处配现补用；，体（解去略本 液缓）试验机码仪外；和；炉泳槽；离高床器；头管验细：验仪材用程工速便的方该完般个而克为带的并，外接色（溴结泳而度胶大离分胶脂是纯化胶用中的引苷寡于，达可最断下合：电酰聚一两泳不的小离根泳要定酶组重的的、及制，的最中是的极荷相身向响在的溶悬离与性白，理酶蛋菌是主的染验集，溶有、；纯，剂机苯，基细在是分的总样离其本多、液织液物、寄、病胞细在原验术和的泳胶琼水胶素响各理的电法的核提目-2、EB 母液（溴化乙锭，储存液用水配制为 1mg.mL-1）：称取一定量的 EB 溶于无菌水中，室温闭光保存；EB 为强诱变剂，实
10、验中要防止污染。（老师已配好）3、DNA 标准分子质量:购买商品 4、10*Loading buffer(pH 7.0)：购买商品（包含：EDTA 50mmol.L-1；甘油 60；Xylene Cyanol FF(W/V)0.25；Bromophenol Blue(W/V)0.25）5、琼脂糖 五、实验步骤（一）DNA 的提取（1）菌体培养：将此菌接种于普通液体培养基中，37振荡培养 18h，获得足够菌体。（由老师完成）（2）菌体收集：取 1 mL 培养液于 1.5mL 离心管中，12000r/min 离心5min，弃上清，收集菌体（注意吸干多余水分）。重复一次。（3）向每管加入 200L
11、裂解缓冲液，用吸管头缓慢抽吸，悬浮和裂解细胞，再加入 50L，100g/mL 溶菌酶（-20 度保存），缓慢抽吸，37处理30min。（4）加入 10L，10mg/mL 蛋白酶 K，缓慢抽吸，37处理 30min。（5）加入 66L，5mol/L NaCl 溶液，充分混匀后，12000r/min，10min。除去蛋白质复合物及细胞壁等残渣。（6）将上清转移到新管中，加入等体积 Tris 饱和苯酚，充分混匀后，12000r/min，5min，进一步沉淀蛋白。-5染体 的和检相。凝灯在，上以色染板玻出电后距中在动线极使，槽中品到混慢样用合混等和溴 与面没冲，去轻槽的液至板心明撕固完间 在凝模倒凝琼
12、左冷温，放位 在板固胶是炉。溶至中炉在糖脂浓配小子被液缓检泳用置 水 燥干清弃 次洗醇 清弃，心）越（，沉无预体上。苯，匀分氯体水心白淀沉，混分和入，到转渣等细及复除，后充溶，入理吸缓，入加，抽）度溶，入再裂浮，缓用冲解每次复）水吸注集清弃离，离养取收成师（。得荡中养通接此：提步验脂；甘：商买 商购量准标好已师染要中变强；存温水无的称制水储乙（好已（定醋 液泳）处老好醇醇乙样处老氯样加（和饱：处师配（处师配（处老配 酶处配现补用；，体（解去略本 液缓）试验机码仪外；和；炉泳槽；离高床器；头管验细：验仪材用程工速便的方该完般个而克为带的并，外接色（溴结泳而度胶大离分胶脂是纯化胶用中的引苷寡于，达
13、可最断下合：电酰聚一两泳不的小离根泳要定酶组重的的、及制，的最中是的极荷相身向响在的溶悬离与性白，理酶蛋菌是主的染验集，溶有、；纯，剂机苯，基细在是分的总样离其本多、液织液物、寄、病胞细在原验术和的泳胶琼水胶素响各理的电法的核提目-（7）取离心后水层，加等体积氯仿，充分混匀，12000r/min，5min，（除苯酚。）（8）取上清，加 2 倍体积预冷的无水乙醇沉淀，30min 以上（时间越长越好）。之后 15000r/min 高速离心 15min，弃上清。（9）用 200L 70%乙醇洗涤 2 次，12000r/min，2min，弃上清。（10）干燥后，20-50L 超纯水溶解 DNA，-20
14、放置备用。（二）电泳检测 1、用 1*TAE 电泳缓冲液按照被分离 DNA 分子的大小配制一定浓度（1.0）的琼脂糖凝胶 30-50mL，在微波炉中加热至琼脂糖溶解。(电炉，小胶是25mL)2、用透明胶封固玻璃板两头，在距底板 0.51.0mm 的位置上放置梳子，将温热（冷却至 50左右）的琼脂糖凝胶倒入胶模中，凝胶厚度在35mm 之间。3、在凝胶完全凝固后，撕去透明胶，小心将玻璃板移至装有1*TAE 缓冲液的电泳槽中，轻轻的拔去梳子，且使缓冲液没过胶面约 1mm。4、DNA 样品与 10*Loading buffer（含有溴酚蓝和甘油等物质）混合后，用微量取样器慢慢将混合物加到样品槽中。5、盖上电泳槽并通电，使 DNA 向阳极（红线）移动，电压为 80100V。6、溴酚蓝在凝胶中移出适当距离后切断电流，取出玻璃板。7、溴化乙锭染色，30min 以上。8、保鲜膜垫好，在紫外灯下观察凝胶。照相。