原药材质量标准分析方法验证.pdf

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1、原药材质量标准分析方法验证 1仪器与材料 UV1601 紫外可见分光光度计 (日本岛津)AB204-N电子天平 (万分之一天平，METTLER TOLEDO)BP211D 电子天平 十万分之一天平，Sarlorius 葡萄糖 (分析纯，天津市化学试剂一厂)苯酚 (分析纯，天津市化学试剂一厂)蒽酮 分析纯，国药集团化学试剂 硫酸 (分析纯，天津市凯信化学试剂)当归药材购于甘肃岷县，经天津药物研究院中药现代研究部张铁军研究员鉴定为伞形科植物当归 Angelica sinensis(Oliv)Diels 的干燥根，经检测符合中华人民共和国药典2020 版一部的有关规定。黄芪药材购于甘肃岷县，经天津药

2、物研究院中药现代研究部张铁军研究员鉴定为蒙古黄芪 Astragalus membranaceus(Fisch)BgeVarmongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根，经检测符合中华人民共和国药典2020 版一部的有关规定。2方法与结果 2.1 药材中多糖含量测定方法 本试验采纳比色法对药材中的多糖含量进行测定，并建立了含量测定方法。2.1.1 对比品溶液的制备 周密称取 105干燥至恒重的无水葡萄糖对比品30.43mg，置 100ml 量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每 1ml 中含无水葡萄糖 0.3043mg。2.1.2 5苯酚试剂的配制 取苯酚 100g，加铝片 0.

3、1g 和碳酸氢钠 0.05g，蒸馏，收集 182馏分，称取此馏分 5g 置棕色容量瓶中溶解后定容，存冰箱备用。2.1.3 供试品溶液制备方法的考察与确定 水提时刻的考察 分别取 60干燥至恒重的当归及黄芪药材细粉5 份，每份约 0.50g，周密称定，置索氏提取器中，用 80%乙醇回流提取 2 小时，残渣挥干溶剂后，再连续以水分别回流提取 1.0h、2.0h、3.0h、4.0h、5.0h，反复洗至 250ml 量瓶中，加水至刻度，摇匀，周密量取 1ml，置 10ml 具塞干燥试管中，采纳改良后的苯酚-硫酸法测定吸光度，运算含量，结果见表 1-1。表 1-1 水提不同提取时刻对当归含量测定的阻碍结

4、果 样品 提取时刻h 当归多糖含量%黄芪多糖含量%1 1.0 7.568 5.501 2 2.0 8.599 6.511 3 3.0 8.583 6.600 4 4.0 8.594 6.589 5 5.0 8.580 6.590 从表 1-1 可知，水提提取时刻为 2.0h 时，药材含量达到最大值且保持恒定，延长提取时刻药材含量变化不大，应选择提取时刻为 2.0h。2.1.4 供试品溶液的制备 分别取 60干燥至恒重的当归及黄芪药材细粉约 0.5g，周密称定，置索氏提取器中，用 80%乙醇回流提取 1 小时，残渣挥干溶剂后，再连续以水回流提取2 小时，反复洗涤残渣及烧瓶至 250ml 量瓶中，

5、定容至刻度，摇匀，备用。2.1.5 最大吸取波长选择 取2.1.1 项下对比品溶液，在 200nm-700nm 波长间进行紫外吸取光谱扫描，最大吸取波长为 490nm，确定选择 490nm 作为检测波长。2.1.6 标准曲线的制备 周密量取对比品溶液 1.0ml，2.0ml，3.0ml，4.0ml，5.0ml，6.0ml，分别置50ml 量瓶中，加水至刻度，摇匀。周密量取上述各溶液 1ml，置具塞试管中，分别加 5苯酚溶液 0.6ml，混匀，迅速加入硫酸 3.0ml，摇匀，于 90水浴中15 分钟，取出，置冰水浴中 15 分钟，取出，以相应试剂为空白，照紫外可见分光光度法附录 VA，在 490

6、nm 的波长处测定吸光度，结果见表 1-2。以吸光度为纵坐标，葡萄糖取样量为横坐标，绘制标准曲线，可得回来方程：y=0.0045x-0.0011，r=0.9995(n=6)。葡萄糖在 24.24145.44 g 范畴内，与吸光度呈良好的线性关系，结果见图1-1。表 1-2 葡萄糖线性范畴考察 取样量(g)吸光度 24.24 0.115 48.48 0.209 72.72 0.330 96.96 0.433 121.20 0.554 145.44 0.655 葡萄糖标准曲线y=0.0045x-0.0011R2=0.99900.10.20.30.40.50.60.7050100150200取样量（

7、g）吸光度A 图 1-1 葡萄糖标准曲线 Fig 1-1 Standard Curve of glucose 2.1.6 周密度试验 周密量取同一供试品溶液，按标准曲线项下方法操作测吸光度，重复测定 6次，求得吸光度值的 RSD 值为 0.33%。结果见表 1-3，说明仪器的周密度符合要求。表 1-3 周密度试验结果 测定次数 吸光度 A 1 0.387 2 0.386 3 0.389 4 0.388 5 0.386 6 0.386 RSD%0.33 2.1.7 稳固性试验 周密量取同一供试品溶液，按标准曲线项下方法操作，每 10分钟测定一次吸光度，到 1 小时后改为 30 分钟测一次，求得多

8、糖含量的 RSD 值为 1.02，结果见表 1-4，测定值在 120 分钟内保持稳固。以下吸光度的测定均在 120 分钟内完成。表 1-4 稳固性试验结果 测定时刻(min)多糖含量 0 8.491 10 8.380 20 8.602 30 8.447 40 8.647 50 8.624 60 8.536 90 8.491 120 8.513 RSD%1.02 2.1.8 重现性试验 取 60干燥至恒重的当归药材细粉6 份，周密称定，按 2.1.3项下方法制备供试品溶液，按标准曲线项下方法操作分别测定吸光度，运算多糖含量，求得多糖含量值 RSD 值为 1.68，结果见表 1-5，说明方法重现性

9、良好。表 1-5 重现性试验结果 样品 多糖含量%1 8.710 2 8.895 3 8.505 4 8.602 5 8.609 6 8.519 平均含量 8.640 RSD%1.68 2.1.9 加样回收率试验 取上述多糖含量的当归药材细粉 6 份，每份约 0.125g，周密称定，周密加入浓度为 2.111 mg/ml 标准葡萄糖对比品溶液 5 ml 按 2.1.3 项下方法制备供试品溶液，按标准曲线项下方法操作分别测定吸光度，运算多糖含量，运算回收率，结果见表 1-6。平均回收率为 99.12%，RSD 值 1.96%。结果说明：本法回收率较好，方法可行。表 1-6 加样回收率试验结果 样

10、品 取样量g 样品含量mg 对比品加入量mg 实测量mg 回收率 平均回收率 RSD%1 0.1242 10.70 10.56 20.97 97.25 2 0.1256 10.82 10.56 21.61 102.18 3 0.1257 10.83 10.56 21.33 99.43 99.12 1.96 4 0.1254 10.80 10.56 21.22 98.67 5 0.1255 10.81 10.56 21.39 100.19 6 0.1250 10.77 10.56 21.01 96.97 2.1.10 当归药材中多糖含量测定 取 60干燥至恒重的当归药材细粉三份，每份约 0.25

11、g，周密称定，按 2.1.3 项下方法制备供试品溶液，按标准曲线项下方法操作测定吸光度，运算多糖含量，求得当归药材中平均多糖含量为 8.58，结果见表 1-7。表 1-7 当归药材中多糖含量测定结果 样品 取样量g 多糖含量 平均多糖含量 1 0.2501 8.44 2 0.2498 8.54 8.58 3 0.2500 8.76 2.2 黄芪药材中多糖含量测定方法 本试验采纳比色法对药材中的含量进行测定，建立了含量测定方法。2.2.1 对比品溶液的制备 周密称取经 105干燥至恒重的无水葡萄糖对比品0.03260g，置 100ml 量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每 1ml 中含无水

12、葡萄糖 0.3260mg。2.2.2 0.2%蒽酮-硫酸溶液的配制 称取蒽酮粉末 0.2g，置 100ml 棕色量瓶中，加硫酸至刻度，摇匀，即得。2.2.3 供试品溶液的制备67 取黄芪药材粗粉约 1g，周密称定，置圆底烧瓶中，加水 100ml，加热回流 1.5h，用脱脂棉滤过，再重复提取 2 次，三次滤液合并，浓缩，移至 100 ml 量瓶中，加水至刻度，摇匀。周密量取 2 ml，加乙醇 10 ml，搅拌，离心，取沉淀加水溶解，置 25 ml 量瓶中，并稀释至刻度，周密量取 2 ml，置 10ml 具塞干燥试管中，备用。2.2.4 供试品溶液制备方法的考察与确定 2.2.4.1 加水量的考察

13、 取黄芪药材粗粉 4 份，每份约 1g，周密称定，置圆底烧瓶中，分别加水 50ml、100ml、150ml、200ml，加热回流 1h，用脱脂棉滤过，滤液浓缩，移至 100 ml 量瓶中，加水至刻度，摇匀。周密量取 2 ml，加乙醇 10 ml，搅拌，离心，取沉淀加水溶解，置 25ml 量瓶中，并稀释至刻度，周密量取2 ml，测定吸光度，运算含量，结果见表 1-8 和图 1-2。表 1-8 不同溶剂用量对含量测定的阻碍结果 样品 加水量ml 多糖含量%1 50 4.812 2 100 7.874 3 150 7.702 4 200 7.774 加水量的考察0123456789501001502

14、00加水量（ml）多糖含量（）图 1-2 不同溶剂用量对含量测定的阻碍结果 从表 1-8 和图 1-2 可知，加水量为 100ml 时，药材含量达到最大值且保持恒定，应选择加水量为 100ml。2.2.4.2 提取时刻的考察 取黄芪药材粗粉 5 份，每份约 1g，周密称定，置圆底烧瓶中，加水 100ml，分别加热回流 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，用脱脂棉滤过，滤液浓缩，移至 100 ml 量瓶中，加水至刻度，摇匀。周密量取 2 ml，加乙醇 10 ml，搅拌，离心，取沉淀加水溶解，置 25ml 量瓶中，并稀释至刻度，周密量取2 ml，测定吸光度，运算含量，结果见表 1-9 和图

15、 1-3。表 1-9 不同提取时刻对含量测定的阻碍结果 样品 提取时刻h 多糖含量%1 0.5 7.598 2 1.0 8.125 3 1.5 8.594 4 2.0 8.597 5 2.5 8.585 提取时间的考察77.27.47.67.888.28.48.68.80.511.522.5提取时间（h）多糖含量（）图 1-3 不同提取时刻对含量测定的阻碍结果 从表 1-9 和图 1-3 可知，提取时刻为 1.5h 时，药材含量达到最大值且保持恒定，延长提取时刻药材含量变化不大，应选择提取时刻为1.5h。2.2.4.3 提取次数的选择 取黄芪药材粗粉 5 份，每份约 1g，周密称定，置圆底烧瓶

16、中，加水 100mll，加热回流 1.5h，分别再重复提取 0、1、2、3、4 次，用脱脂棉滤过，滤液浓缩，移至 100 ml 量瓶中，加水至刻度，摇匀。周密量取 2 ml，加乙醇 10 ml，搅拌，离心，取沉淀加水溶解，置 25ml 量瓶中，并稀释至刻度，周密量取 2 ml，测定吸光度，运算含量，结果见表 1-10 和图 1-4。表 1-10 不同提取次数对含量测定的阻碍结果 样品 提取次数次 多糖含量%1 1 7.869 2 2 8.750 3 3 10.130 4 4 9.973 5 5 9.702 提取次数的考察02468101212345提取次数（次）多糖含量（）图 1-4 不同提取

17、次数对含量测定的阻碍结果 从表1-10和图1-4可知，次数对多糖提取有阻碍，随着次数增加多糖含量上升，提取次数为三次时，药材含量达到最大值且保持恒定，增加提取次数药材含量变化不大，应选择提取次数为三次。2.2.5 标准曲线的制备66 周密量取对比品溶液 0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml，分别置 10ml 具塞刻度试管中，各加水至 2.0ml，摇匀，在冰水浴中慢慢滴加 0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度，混匀，放冷后置水浴中保温 10 分钟，取出，赶忙置冰水浴中冷却 10 分钟，取出，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法附录 VA，在 582nm 波长处测定吸

18、光度，结果见表1-11。以吸光度为纵坐标，葡萄糖取样量为横坐标，绘制标准曲线，可得回来方程：y=0.0041x+0.0337，r=0.9992(n=6)。葡萄糖在 32.60195.60 g 范畴内，与吸光度呈良好的线性关系，结果见图 1-5。表 1-11 葡萄糖线性范畴考察 取样量(g)吸光度 A 32.60 0.158 65.20 0.312 97.80 0.426 130.40 0.573 163.00 0.685 195.60 0.833 葡萄糖标准曲线y=0.0041x+0.0337R2=0.998400.20.40.60.81050100150200250取样量（g）吸光度A 图

19、1-5 葡萄糖标准曲线 2.2.6 周密度试验 周密量取同一供试品溶液，按标准曲线项下方法操作测吸光度，重复测定 6 次，求得吸光度值的 RSD 值为 0.14%。结果见表 1-12，说明仪器的周密度符合要求。表 1-12 周密度试验结果 测定次数 吸光度 A 1 0.754 2 0.753 3 0.753 4 0.753 5 0.752 6 0.755 RSD%0.14 2.2.7 稳固性试验 周密量取同一供试品溶液，按标准曲线项下方法操作，每10分钟测定一次吸光度，到 1 小时后改为 30 分钟测一次，求得多糖含量的 RSD 值为 1.17，结果见表 1-13，测定值在 120 分钟内保持

20、稳固。以下吸光度的测定均在 120 分钟内完成。表 1-13 稳固性试验结果 测定时刻(min)多糖含量 0 10.84 10 10.72 20 10.74 30 11.12 40 10.98 50 11.01 60 10.95 90 10.93 120 10.92 RSD%1.17 2.2.8 重现性试验 取黄芪药材粗粉 6 份，周密称定，按 2.2.3 项下方法制备供试品溶液，按标准曲线项下方法操作分别测定吸光度，运算多糖含量，求得多糖含量值 RSD 值为 1.14，结果见表 1-14，说明方法重现性良好。表 1-14 重现性试验结果 样品 多糖含量%1 10.77 2 11.02 3 1

21、0.93 4 11.12 5 10.97 6 11.08 平均含量 10.98 RSD%1.14 2.2.9 加样回收率试验 取上述多糖含量的黄芪药材粗粉 6 份，每份约 0.5g，周密称定，周密加入浓度为 10.978mg/ml 标准葡萄糖对比品溶液 5 ml 按 2.2.3 项下方法制备供试品溶液，按标准曲线项下方法操作分别测定吸光度，运算多糖含量，运算回收率，结果见表 1-15。平均回收率为 99.61%，RSD 值 1.73%。结果说明：本法回收率较好，方法可行。表 1-15 加样回收率试验结果 样品 取样量样品含量对比品加实测量回收率平均回收RSD%g mg 入量mg mg 率 1

22、0.4999 54.89 54.89 109.65 99.76 2 0.5005 54.95 54.89 110.18 100.62 3 0.5003 54.93 54.89 110.82 101.82 99.61 1.73 4 0.5007 54.98 54.89 110.02 100.27 5 0.4995 54.85 54.89 108.19 97.18 6 0.4998 54.88 54.89 108.66 97.98 2.2.10 黄芪药材中多糖含量测定 取黄芪药材粗粉三份，每份约 1g，周密称定，按 2.2.3 项下方法制备供试品溶液，按标准曲线项下方法操作测定吸光度，运算多糖含量，求得黄芪药材中平均多糖含量为 10.98，结果见表 1-16。表 1-16 黄芪药材中多糖含量测定结果 样品 取样量g 多糖含量 平均多糖含量 1 1.0002 10.95 2 0.9998 10.98 10.98 3 1.0003 11.01