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1、基因工程试题及答案1.标记（探针）（已知一个克隆在质粒载体上的500bpDNA 外源片段，请设计并用3种标记方法方案来对这个外源片段进行标记。带有能检测的标记物的DNA或RNA叫探针。使DNA或RNA带有可检测的标记物的过程叫探针标记。1）切口平移标记: 控制DNaseI的浓度，就可以在双链DNA分子的一条链的有限位置上打开切口，形成3-OH末端（这条链即成为引物）。DNA聚合酶I把一个带有标记物的dNTP就加在这引物的3-OH末端，而它的5-3的核酸外切酶活性将切除5-单核苷酸，同时依次添加新的核苷酸到3一侧，其结果使切口沿着DNA平移，这就叫切口平移（Nick translation)2）
2、随机引物标记: 能及任何DNA配对互补的一小段DNA序列叫随机引物。DNA聚合酶klenow大片段能在随机引物的引导下以带有标记物的dNTP为原料合成新的及模板DNA互补的探针。3) PCR标记:针对目的片段，设计好引物，以标记号的dNTP为原料合成新的及模板DNA互补的探针4）末端核苷酸转移法: P32和多核苷酸激酶在5端标记DNA或RNA。先用碱性磷酸酶处理去除DNA 5的磷酸基团，多核苷酸激酶用于对缺乏 5-磷酸的 DNA 或合成接头进行磷酸化,同时可对末端进行标记。补充：1） 常用的标记物包括：P32的同位素标记；荧光探针标记的dNTP；生物素；地高辛2） 应用：定性（是否转入该基因）
3、；定量（含量的高低）；定位；成分（配对的程度、是否同源）2.PCR技术（试述PCR技术的基本原理，如果想通过PCR技术从一个生物基因组中扩增一个约500bp的基因片段，再和载体连接克隆，然后转入大肠杆菌中，请描述其克隆过程（包括检测）。）（1）PCR的概念：又称为聚合酶链反应,能在体外特异快速扩增DNA片段。组成：DNA单链模板、引物和DNA聚合酶（包括缓冲液）（2）PCR技术的原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于及靶序列两端互补的寡核苷酸引物。双链DNA在高温时也可以发生变性解链，随即退火使引物及模板DNA单链的互补序列配对结合，之后在DNA聚合酶的参及下，根据
4、碱基互补配对原则进行子链的延伸。重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板，在很短的时间内特异性的快速扩增DNA片段。 (3) 克隆过程：A、设计合适的引物，大小在15-25个核苷酸之间，两个引物及模板的结合点之间要包含需扩增的片段的序列，而且引物中要含有合适的酶切位点。B、根据引物和目标片段的性质，设定各步骤反应的温度和时间进行PCR，扩增目标片段。C、用琼脂糖凝胶电泳的方法检测PCR产物，并回收目标片段。D、用相同的（或者能够得到相同末端的）限制性内切酶对PCR获得的目标片段和选择的载体进行酶切，之后将片段和切开的载体放置在同一EP管中
5、，加入T4连接酶进行连接。E、用普通钙转或者电转的方法将连接产物转化至大肠杆菌中。F、根据载体含有的性质，选择合适的筛选标记选出转入载体的菌株。G、若基因片段无明显筛选标记，则可通过将提取的质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测、菌落PCR或者DNA探针杂交的方法检测载体上是否含有目标片段，排除空载体的干扰。(4)PCR技术的应用A、基因组DNA PCR克隆和cDNA的RT-PCR克隆B、基因组的RAPD(随机扩增多态DNA分析，random amplified polymorphic DNA)标记分析。使用随机的短核苷酸引物，在低的退火温度下进行扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳所呈显的带型，反映着用作扩增模板
6、的DNA分子的总体结构特征。C、临床诊断和法医鉴定。如男女性别鉴定，病毒性感染病的诊断，对单根毛发或单个精子作遗传学鉴定等。3.转基因动物的安全性问题正面观点：（1）转基因工程是不可阻挡的.基因工程将影响当代重大的环境问题:人口过剩/污染/生物多样性急剧减退等等.保护土壤/水/能源成为发展可持续农业的目标。（2)转基因食品的功效: 改良植物的食用品质；增加果蔬贮藏、保鲜性能；生产特殊食品食品疫苗。（3）迄今为止并没有发现转基因食品危害人体健康和环境的确切证据。如果转基因生物技术得不到社会支持，这一研究将被扼杀。反面观点：转基因的潜在危害：转基因动植物安全性评价主要集中在环境安全性，食品安全性以
7、及对人动物健康的影响三方面。环境安全性分析包括：（1）生存竞争性：转基因植物在生存竞争方面具有的优势可能导致生物多样性的减少，影响了生物多样性；（2）生殖隔离距离:基因不可控制的水平转移的可能性；及近缘野生种的可交配性：外源基因是否会漂流扩散至亲缘野生种中，从而破坏自然生态平衡；（3）对非靶生物的影响：转基因植物花粉通过风，雨，鸟，昆虫，真菌，细菌以至整个生物链传播使外源基因逃逸，从而造成基因污染。（4）病毒发生异缘重组或异缘包装的可能性：自然界中存在着植物病毒之间的异缘重组。（5）对农业和生态环境的影响，生态平衡. 如产生超级杂草的可能性；种植抗虫转基因作物后可能使害虫产生免疫并遗传、从而产
8、生更加难以消灭的“超级害虫”；食品安全性：（1）转基因毒性.如英国发现转基因马铃薯会减弱老鼠免疫系统功能，美国发现转基因玉米会危害蝴蝶幼虫及其相关生态环境；（2）人的毒理反应或过敏反应. 大肠杆菌细胞膜间隙中含有大量的内毒素，痕量的内毒素即可导致人体热原反应。（3）实质等同性的原则，即某一种生物技术产品或其成分能够及市场上现有的对应产品进行比较。如果一种转基因产品能够及现存的一种产品进行比较，并且发现具有实质同等性，便能用现产品安全性同种方法对待它。转基因植物所引入的蛋白对人体可能是异性蛋白质，在部分人中可能发生食物过敏，特别是幼儿和某些过敏体质的人。对人动物健康的影响：转入传统食品或作物中的
9、基因可能来自各种物种，有些是人们不能或者极少食用的，是否会对人体造成危害；转基因植物食品中的新基因会不会传递给人畜的肠道微生物，插入表达，然后危害健康。动物：1.外源基因在动物基因组中的随机整合，可能会引起宿主细胞基因的插入突变、缺失突变及宿主基因的扩增重排和移位，也可能激活正常状态下处于关闭状态的基因，从而导致动物表型的改变甚至造成动物不育或死亡；2.插入的外源基因是否会影响宿主动物自身的基因表达及表达水平；3.转基因动物是否可能会把外源基因传递给生活在其周围的其它种群及环境，造成基因污染；4.在病毒等致病基因的转基因研究中，不可避免地会产生一些有害的转基因动物，是否可能因为使用转基因动物制
10、品而将一些动物性疾病传递给人类。 5.未知的.总的来说：就目前而言，还没有发现转基因食品对人类有害，但同时也缺乏证据证明它的无害性，因此产生了一些争论。4.如何区分重组DNA和空载体自连：（一）检测方法（1）双抗性筛选：具有四环素和氨苄青霉素两种抗生素抗性基因作为选择标记，一种抗性标记用来正选择转化子，另一种通过插入失活而可以鉴定重组子。Ori位于Amp+和tet+这两个基因之间，在四环素平板上出现的菌落一定是获得了质粒的转化子，在此基础上，如果四环素抗性转化子对氨苄青霉素敏感，则说明在载体中有外源片段的插入而使氨苄青霉素抗性失活，即重组子；若对氨苄青霉素有抗性，则此转化子的质粒是空载体。（2
11、)抗生素插入失活法：如BamHI可以从四环素位点切开，使该基因不能表达，但仍能表达氨苄抗性基因，对四环素是敏感的。筛选重组pBR322 按照以下方法进行，将转化细胞培养于氨苄培养基中，只有转化细胞可以生长形成克隆，影印到四环素培养基上，不能在该培养基上生长的菌落可能就是目的克隆。（3）限制性内切酶法：外源片段通过特定的酶切位点插入到载体上，因此，可以通过这些限制性酶酶切重组质粒，电泳分析插入片段长度是否正确。（抗生素+酶切检测+测序）（4）蓝白斑筛选：多克隆位点存在于编码-半乳糖苷酶的N端的DNA序列中，及pUC载体一起使用的宿主菌携带编码-半乳糖苷酶的C端序列的基因片段。通过互补机制，两个片
12、段在体内相互弥补，产生一个有活性的-半乳糖苷酶。以X-gal作为指示剂。若通过插入外源DNA到多克隆位点中而打断了-半乳糖苷酶的部分基因，不能产生有活性的-半乳糖苷酶，X-gal不会反应，重组子菌落为白色，而自连空载体转化的菌落则是蓝色的。（5）PCR法：如果已知插入DNA片段的某些序列，就可以通过PCR的方法进行鉴定（6）菌落原位杂交：把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上，然后溶菌，变性并固定DNA，最后用标记的DNA或RNA探针进行杂交来检测这些被转移的菌落或噬菌斑。（7）测序法：若通过前面这些方法鉴定之后还是有疑虑，不知道是否阳性者确为真阳性而不是空载体自连，可以将其送到生物公司进行测序以
13、最终确定之。（8）基因产物检测法：如果使用的是表达载体，那么就可以通过鉴定基因产物的方法鉴定正确的克隆。（二）避免方法：（1）. 碱性磷酸酶处理载体在DNA重组实验中，用碱性磷酸酶对载体DNA的5末端除磷，可以防止载体自连，提高重组率（2）. 噬菌体包装蛋白包装下限的限制：选用噬菌体或者柯氏载体，含有cos位点，包装3551kb的片段，空载体片段太小，不会被包装（3）. 利用某些基因(改基因存在时质粒不能在一定的菌株中存在,而此被基因为外源DNA取代时则能存在)等预防措施.5.质粒载体vs噬菌体载体： 单纯以噬菌体为基础构建的载体:装载量大,能获得单链DNA,转染效率高;操作较难,DNA不稳定
14、单纯以质粒为基础构建的载体:有天然的抗性选择标记,操作容易(宜于分离和纯化),较稳定;装载量小,转化效率较低(一)优缺点比较载体优点缺点质粒载体1.分子量非常小2.具有较高的拷贝数 3.易分离4.易改造1.不稳定：分离不稳定，结构不稳定，易丢失噬菌体载体1.具有质粒性质，便于外源DNA的克隆及重组子的筛选2.有利于提高装载量3.较稳定，重组至宿主基因组4.转化效率高噬菌体可能会变化而恢复毒性对转基因动物有害等；宿主范围窄(二)异同点比较相同点：1、复制子：一段具有特殊结构的DNA序列，载体有多个复制起点才能使及它结合的外源基因在宿主细胞中独立复制繁殖。2、选择性标记：一般情况下，所要扩增的基因
15、不便于选择，所以作为载体要求具有选择标记。易于识别和筛选，如抗药性、显色表型反应等；3、限制性酶切位点：具有一个或者几个限制性内切核酸酶的单一识别位点，便于外源基因的插入；4、载体的大小适当，可以插入一段较大的外源DNA,又不影响本身的复制；5、均有适当的拷贝数，既有利于载体的制备，还要使外源基因大量表达；6、载体的安全性：要求载体不能随便转移不同点：1、质粒载体多为双链共价闭合的环状DNA分子，而噬菌体的核酸一般为双链线性DNA分子，也有双链环形DNA、单链线性DNA、单链环形DNA及单链REN等多种形式。2、质粒多能独立于染色体之外自主复制，而噬菌体的DNA整合到寄主细胞染色体DNA上，成
16、为一个组成部分。3、质粒常含有一些编码对细菌生存有利的基因，包含抗生素抗性基因等，而噬菌体基因一般不具有抗性基因。4、噬菌体载体的结构要比质粒复杂，噬菌体作为基因克隆载体在克隆实验时具有天然的优势，他们感染细胞比质粒转化细胞更为有效，所以噬菌体的克隆产量通常要高一些。6.如何在大肠杆菌中高效表达外源基因：涉及三个方面：（1）强化蛋白质的生物合成（重组质粒的拷贝数，转录水平和翻译速率）；（2）抑制蛋白质产物降解；（3)恢复维持蛋白质特异性空间结构。（一）强化蛋白质的生物合成1） 启动子：影响表达效率的主要因素之一是启动子的强度。高水平表达的最佳启动子必须具备的条件：（1）它必须是一种强启动子，能
17、够使克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的10-30；（2）这种启动子应该是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。2）终止子：有效的转录终止子的必要性：（1）转录产物越长，所需时间就多，外源基因本身的转录效率下降；（2）转录通读进入质粒功能区，可能干扰质粒的复制和其他生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；（3）转录终止子能增强mRNA分子的稳定从而大大提高了蛋白质产物的水平；（4）转录产物过长影响翻译效率。3）核糖体结合位点（RBS）的结构要素：外源基因在大肠杆菌中的高效表达不仅取决于转录启动频率，而且在很大程度上还及mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌mRNA的翻译起
18、始效率主要由其5端的结构序列所决定，即核糖体结合位点（RBS），它包括4个结构要素：（1）起始密码子上游的6-8个核苷酸序列UAAGGAGG,即Shine-Dalgarno (SD)序列；（2）起始密码子AUG；（3）SD及起始密码子之间的距离及碱基组成；（4）基因编码区5端若干密码子的碱基序列，至少这一序列不能及mRNA的5端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位。4）密码子由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有不同程度的差异性，因此，外源基因尤其是哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。有两种策略可以使外源基因上的密码子在大
19、肠杆菌细胞中获得最佳表达：（1），采用外源基因全合成的方法，按照大肠杆菌密码子偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并密码子；（2）对于那些含有不和谐密码子种类单一，出现频率较高而本身分子量又较大的外源基因而言，则选择相关tRNA编码基因同步克隆表达的策略较为有利。5）质粒拷贝数可以通过构建高拷贝载体增加质粒拷贝数以增加基因的剂量。质粒的稳定性对工程菌株高效表达产物非常重要。在寄主细胞快速生长期间质粒易于丢失，出现无质粒细胞。减少质粒丢失的措施：（1）保持抗生素的选择压力；（2）在载体中保留或连接质粒分配功能区bar；（3）避免质粒多体的形成；（4）将重组质粒的扩增纳入可控制轨道。(5)
20、对于分子量较小的蛋白或多肽可采用将多拷贝的外源基因克隆在一个低拷贝质粒上，以取代单拷贝外源基因克隆在高拷贝载体上表达的策略。 二)抑制蛋白质产物降解1）包涵体异源蛋白的表达外源基因在大肠杆菌中高效表达的蛋白质常形成包涵体，包涵体是由一群不溶性蛋白质聚集在一起形成的晶体结构物，被膜包裹或无膜裸露。大肠杆菌形成的包涵体大部分存在于细胞质中。以包涵体形式表达异源蛋白的优点：（1）易于分离；（2）蛋白质受到保护而免受胞内蛋白酶的降解；（3）蛋白质没有生物活性，对寄主细胞没有影响。2）分泌型异源蛋白的表达这种蛋白质分泌定位于细胞周质，或分泌到胞外培养基中。优点: (1)易于纯化，因为周质和胞外的蛋白质种
21、类较少；（2）蛋白酶活性较低，蛋白质较稳定；（3）N端甲硫氨酸残基被切除。3）融合型异源蛋白的表达将外源基因和受体菌自身蛋白质编码基因拼接在一起，作为一个阅读框架进行表达，这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白质。优点：（1）位于融合蛋白的N端受体菌自身蛋白质可使蛋白质产物稳定性增加，阻止包涵体地形成；（2）分离纯化程序简单；（3）表达效率高。在构建融合蛋白表达系统时，所选用地受体菌基因通常是高效表达的。三)恢复维持蛋白质特异性空间结构将表达出来的蛋白质在体外加工使其拥有正确的空间构象。例如（1）在生产胰岛素时，或者分别表达A/B链，在体外进行二硫键连接；或者（2）表达前胰岛素蛋白，在体外进行
22、酶切。7.植物转基因两种方法的比较：（一）农杆菌介导法：一种载体介导法，是通过农杆菌介导感染受体植物将外源基因转入植物细胞的技术。农杆菌介导法的优点:1. 转化效率高2. 能够插入非重排的外缘DNA长片断3. 外缘转化DNA主要以单拷贝或是低拷贝形式插入4. 不需要特殊的专用设备缺点:1. 转化的寄主范围有限,特别是对许多单子叶植物不适用，主要适用于双子叶系统2. 外源的转基因只能以T-DNA插入的方式被导入寄主细胞（二）基因枪法：也称微粒轰击法，是一种快速有效的植物DNA转移系统之一。其基本原理是利用带有外源DNA的金粉或钨粉微粒经过放电或机械加速后对细胞射击。生物弹击法的优点:1. 基因转
23、移不受物种界限的约束2. 可适用于不同的转化样品,如根,镜,叶培养细胞愈伤组织,甚至种子等3. 很有可能用于培育转基因的禾谷类作物缺点:1. 需要复杂的专用设备2. 外源转化DNA重排频率高,并经常以多拷贝形式插入8.试述动物转基因的方法并比较它们的优缺点：1)逆转录病毒法逆转录病毒法是将外源目的基因和逆转录病毒载体重组，再使之包装成为高滴度病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，也可直接将胚胎及能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的。携带外源基因的反转录病毒DNA依靠逆转录病毒的整合酶及其末端特异性核苷酸序列可以整合到宿主染色体上，经过杂交筛选即可获得含有目的基因的动物。优点：
24、操作简便、可大量感染细胞、形成单拷贝和高转化率（可达100）缺点：病毒载体可能从整合位点上脱落，恢复病毒特性，对宿主细胞的功能造成影响，甚至使动物死亡。逆转录病毒载体构建技术路线LTRLTREgag pol env逆转录病毒基因组+gag pol env+外源基因引入病毒蛋白编码区缺失病毒蛋白和调控区插入外源基因gag pol env病毒蛋白ELTRLTRELTRLTR载体结构辅助细胞gag pol env病毒蛋白收集病毒载体载体病毒感染目的细胞D17细胞2）体细胞核移植法将外源目的基因导入能传代培养的动物体细胞（包括动物成体体细胞、胎体成纤维细胞等），以这些动物体细胞为核供体，通过显微操作或
25、电融合使核供体及相应的核受体（去核的原核胚或成熟的卵母细胞）不经过有性繁殖过程，在体外直接进行重组融合，对重组的胚进行胚胎移植，进而得到带有外源基因的转基因动物。优点：（1）基因转移效率高，转基因动物后代数目也迅速扩增，所需动物数大幅度减少，比显微注射法所需动物数减少2.5倍；（2）在胚胎移植之前，它就筛选阳性细胞作为核供体，这样核移植产生的胚胎为阳性，最终产生的后代个体100%为转基因个体；（3）可以预先选择雄性或雌性性别克隆，从而预定胚胎和后代的性别；（4）可以实现大片段基因的转移。3）显微注射法在显微操作仪下用极细的微吸管将在体外构建的外源目的基因注射到处于原核时期的受精卵的原核中，外源
26、基因在受精卵繁殖过程中通过DNA的复制而整合到动物基因组中，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体的子宫内继续发育，进而得到转基因动物 。缺点：(1)外源基因整合的效率低（尤其是大家畜）； (2)不能控制转基因的整合位点； (3)整合的拷贝数未知； (4)一个转基因可形成几个基因型或显型的品系； (5)显微操作复杂、设备昂贵、技术性强; (6)胚胎高死亡率及大型农场动物原核的定位困难。 4）胚胎干细胞法胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是从哺乳动物早期胚胎的内细胞团（inner cell mass，ICM）中分离出来的一种二倍体细胞，可在体外培养并保持全能
27、分化的潜能，在适当的环境条件下可形成胚系集落。将外源目的基因转移到ES细胞中，外源基因整合到ES细胞的基因组中，把ES细胞移入胚泡期的胚胎，再把这样的胚胎移植到假孕的代孕子宫内发育，产生出嵌合体动物，进一步获得生殖系携带外源基因的纯合转基因动物。5）精子载体法它是直接用精子作为外源DNA的载体，精子直接及外源DNA混合培养时，外源DNA可直接进入精子头部，通过受精将外源基因引入动物细胞中。优点：（1）胞质内显微注射使用的微注射针大，能处理较大的DNA片段，如酵母或哺乳动物人工染色体；（2）对大型农场动物如牛、猪等而言，其合子是不透明的，原核不易见，原核显微注射较为困难，应用该法可克服此缺陷；（
28、3）不同物种中，精子可以保存并且能支持完全发育；（4）将精子及几种不同外源目的基因共注射，可通过单次注射获得同时表达多个基因的胚胎。总体看来，仍不是十分理想，效率较低。原核注射法是最常用和获得转基因动物最多的经典方法；反转录病毒载体法在禽类基因转移上应用较多，效果较好；经膜处理精子胞浆微注射法结合了原核微注射和精子载体法各自的长处；ES细胞介导法是和基因定位整合相结合的方法，可以克服外源基因随机整合所带来的一些弊端，而且可在体外条件下对外源基因的表达进行筛选。 9.southern blot的原理及应用（谈谈核酸杂交的基本原理，并举例说明Southern blot在基因工程中的应用。）1）核酸
29、分子杂交的原理：碱基的互补配对，双链DNA在一定条件下能够变性和复性。Southern杂交技术由E. Southern 于1975年发明，它现在是基因分离和鉴定中不可缺少的一个重要手段。待分析的基因组DNA或其它DNA首先用一种或几种限制性核酸内切酶消化，消化后的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳按照分子量的大小进行分离，凝胶经碱变性处理，将DNA分子变性成单链，经毛细管作用或物理方法将凝胶中的单链DNA分子从胶上转移到固相支持物上（一般使用的是尼龙膜和纤维素膜）。然后用标记的DNA或RNA探针对附着于膜上的DNA进行杂交来检测这些被转移的DNA片段，及探针有同源性的DNA片段在膜上的位置可以通过特
30、定的检测方法如放射自显影或显色而显示。Southern杂交能否检出杂交信号取决于很多原因,其中包括目的DNA在总DNA中所占的比例、探针的大小和比活性、转移到滤膜上的DNA量以及探针及目的DNA之间的配对情况等。2）Southern Blot应用：（1）可用来检测基因序列的同源性，可以分析转基因动植物的转基因在基因组上出现的情况，可以确定外源基因在植物中的组织结构，外源DNA整合的位置及拷贝数，转基因植株F1世代外源基因的稳定性等（2）遗传病诊断，DNA图谱分析，检测样品中的DNA及其含量，PCR产物分析等；绘制物理图，同源性、重组、变异的研究（3）基因工程中的应用：可以精确的检验出微量DNA
31、分子，检测转基因细胞中目标DNA的含量以及检验出转基因是否成功等等。老师的举例：通过对小麦的异源多倍体进行southern blot，判断对probe对应的DNA进行物理定位。3）如何判断转移是否完全：转移DNA以后将胶重新染色,看是否还有DNA在胶上.片断太大,转移时毛细管作用失败即溶液不是通过胶上移等10. 如果想通过PCR技术从一个生物基因组中扩增一个约500bp的基因片段，再和载体连接克隆，然后转入大肠杆菌中，请描述其克隆过程（包括检测）。1） 先从该生物的基因组中获得目的片段，利用特异的限制性核酸内切酶消化基因组，并凝胶电泳分离得到目的片段2） 针对该目的片段设计特异的引物，通过PC
32、R扩增并富集该片段3） 电泳检测PCR 结果4） 将目的片段连接到相关载体上5） 将重组质粒转化进入大肠杆菌中，并在含有氨苄青霉素的固体LB培养基上培养，加入少量X-gal涂布于培养基上，过夜培养后筛选出白色菌落6） 筛选：抗生素抗性筛选（单抗性/双抗性）、菌落PCR+双酶切+测序/蓝白斑/菌落原位杂交/双抗性筛选11.比较在大肠杆菌、植物和动物个体中表达真核生物基因时的优缺点。大肠杆菌优缺点：大肠杆菌优点:(1)结构简单，生理生化和遗传背景知识，尤其是其基因表达调控机制有了清楚的了解；(2)易于大规模培养，成本低廉；(3)经过了遗传改造，已发展为一种安全的基因工程实验系统，拥有各种不同的菌株
33、和载体系列。缺点（表达真核基因的障碍）:（1)真核基因具有内含子，所以只能用其cDNA；（2）许多真核生物基因仅在大肠杆菌中合成无特异性空间结构的多肽链；（3）许多真核基因的蛋白质产物，都要经受翻译后的加工修饰，而大肠杆菌缺乏蛋白质加工系统；（4）大肠杆菌内源性蛋白酶易降解外来的真核生物基因所表达的蛋白质分子；（5）大肠杆菌细胞膜间隙中含有大量的内毒素，痕量的内毒素即可导致人体热原反应。植物优点：1） 生物发酵系统不能对真核蛋白质疫苗进行正确的翻译后加工，而植物及动物细胞表达系统，可对表达产物进行转译后加工2） 细菌在发酵过程中常产生一些不溶性聚合物，其要重新溶解并折叠成天然蛋白质则需要很高的
34、成本，且发酵需要庞大设备投资，动物细胞作为生物反应器，常用动物病毒作为载体导入外源基因，在生产过程中也可能污染动物病毒。植物作为反应器则不会污染动物病毒，而且可以在大田大规模种植，成本低廉。3） 易于大面积种植，成本低，收割、运输、储藏和加工过程和传统的农业生产无异；具有天然的蛋白存储器官，无需冷连系统设备进行储藏运输，故易于长距离运输和普及推广。4） 转基因植物中的外源基因可通过植物杂交的方法进行基因重组而达到在植物体内积累多基因的目的5） 在生产疫苗方面：A.生产的疫苗或其他功能蛋白，可供人直接服用或饲喂动物，不需要分离提纯。这样可节约许多仪器设备，降低生产成本，使用方便。B.提供营养。通
35、过转基因植物生产的口服疫苗，不仅提供了疫苗，而且提供了营养。C.粘膜免疫是病毒性腹泻的免疫保护机制，但在启动粘膜免疫方面尚属难题。转基因植物细胞是可以启动粘膜免疫的有效途径。6） 可以通过转基因增加植物代谢途径产生的有用的次生代谢产物缺点：1） 生物安全性：例如转基因植物中的除草剂基因转移到野生种中可能产生超级杂草，抗病毒基因逃逸到其他微生物中可能产生超级病毒，目标生物体对药物产生抗性，转基因及其产物在环境中的残留。再如，人们食用的某些带有抗菌性的转基因作物食品，会引起过敏反应或对抗生素治疗产生抗体，进而影响人类健康2） 有一些动物蛋白在植物内由于加工修饰方式不同，功能、性质可能发生变化。动物
36、优缺点：优点：将编码活性蛋白的基因导入动物的受精卵或早期胚胎内以制备转基因动物，并使外源基因在动物体内 (乳汁、血液等 )高效表达，然后再分离提取目的基因编码产物。动物就像一个活的发酵罐。其温度、气体、水分和pH值均由动物自身调节。所以有人把它喻为药物工厂、生物反应器、基因农场或分子农场（molecular farming）。（1） 表达产物能充分修饰且具有稳定的生物活性（splicing;对产物修饰，有折叠空间结构）；（2） 产品成本低，并可进行大规模的生产；（3） 产品质量高；（4） 可诱导分泌，易提纯；（5） 不污染环境。缺点：（1）转基因动物成功率低 （2）阳性率结果重复性差，甚至无法
37、重复，转基因动物的成功率较低。随后的研究虽然使成功率有所提高，但总的成功率还是较低，限制了其应用的发展。建立更完善的转基因方法。使用大的外源DNA片段。 （3）造成宿主基因突变问题外源基因在动物基因组中的随机整合，可能会引起宿主细胞基因的插入突变、缺失突变及宿主基因的扩增重排和移位，也可能激活正常状态下处于关闭状态的基因，从而导致动物表型的改变甚至造成动物不育或死亡。基因打靶技术（gene targeting）能够使目的基因定点整合，因此避免了对宿主基因的损伤，提高了阳性率。 （4）外源基因表达水平不高 转入的外源目的基因在转基因动物中是否高效表达是转基因动物研究成败的关键。对外源基因的整合机
38、理进行深入研究。选择表达效率高的启动子。 （5）安全性问题 插入的外源基因是否会影响宿主动物自身的基因表达及表达水平；转基因动物是否可能会把外源基因传递给生活在其周围的其它种群及环境，造成基因污染；在病毒等致病基因的转基因研究中，不可避免地会产生一些有害的转基因动物，是否可能因为使用转基因动物制品而将一些动物性疾病传递给人类。 12.用e.coli表达目的基因的原因（为何用e.coli作为受体）优点: (1)结构简单，生理生化和遗传背景知识，尤其是其基因表达调控机制有了清楚的了解；(2)易于大规模培养，成本低廉；（3）经过了遗传改造，已发展为一种安全的基因工程实验系统，拥有各种不同的菌株和载体系列。缺点（表达真核基因的障碍）:（1)真核基因具有内含子，所以只能用其cDNA；（2）许多真核生物基因仅在大肠杆菌中合成无特异性空间结构的多肽链；（3）许多真核基因的蛋白质产物，都要经受翻译后的加工修饰，而大肠杆菌缺乏蛋白质加工系统；（4）大肠杆菌内源性蛋白酶易降解外来的真核生物基因所表达的蛋白质分子；（5）大肠杆菌细胞膜间隙中含有大量的内毒素，痕量的内毒素即可导致人体热原反应。狂祝：考试顺利！第 7 页