法医物证学实验指导.docx

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1、法医物证学实验指导法医物证学教研室2009年编写实验须知一、实验目的 法医物证检验是法医学鉴定工作中的一项不可缺少的重要内容，在掌握了收集、采 取和送验物证的基础上，进行物证检验，以达到鉴定的目的。 学习物证检验的基本操作(Basic operation)技术和研究方法(Research methods),为 今后从事法医工作打下良好的基础。培养学生科学的思维方法和实事求是的工作作风，防止主观主义，草率从事。二、实验要求实验前必须先预习，做到胸中有数，才能有条不紊的做好实验，获得较好的结果。 预习的重点在于：实验目的、实验原理。实验的主要步骤及实验过程中应特别注意的问题。 并计划好实验仪器及大

2、致的时间分配，做到有计划。有步骤地做实验。 实验中要求操作正规，取试剂要准确。仔细观察实验现象，如实记录实验结果。养 成认真细致，实事求是的科学态度，并联系有关理论进行分析，提出正确结论，写好实验报 告。三、实验程序准备工作实验前要预习，做到胸中有数。(2)清点实验仪器(Instruments)和药品(Drug),如有短缺应报告教师补给。清理实验桌面，有秩序地放好仪器和药品，实验中不用的书籍杂物不要放在实验台 上。实验操作按指定的编组进行实验。实验时按讲义规定的顺序，用正规的操作方法进行操作。如实验中需使用多种不同试剂时，注意分清各自的滴管。刻度吸管及试管等，各试 剂的瓶塞滴管均不能混错，以免

3、污染试剂。在试验过程中，不能直接用手接触检材，以免污染。(4)每次实验均要写实验报告，并于当天交给指导教师评阅记分，作为平时成绩。实验后的清理实验结束后，应将试剂瓶，公用吸管等排列整齐，未用完的抗血清应用胶布或胶塞封好 瓶后，立即放回冰箱，将所用的仪器。玻璃器皿等洗净收好，整理桌面。值日生应负责打扫 实验室，离开实验室之前要检查水、电、门、窗、是否关好。四、实验室规则遵守课堂纪律，实验室内禁止抽烟吃零食，不许打闹，保持安静。不迟到，不无故 缺课。爱护仪器。尽量避免损坏，精密仪器必须在教师指导下严格按操作规程使用。节约 使用抗血清等试剂及水电。 废液可倒入水槽(Gutter)并放水冲走，固体废物

4、(包括血凝块(Include blood clot) 切勿倒入水槽，以免阻塞下水道。 仪器(Instrument)如有破损，应如实报告教师，填写破损登记表后补领。实验室内一 切物品，未经教师同意不携出室外。 保护好实验台，防止强酸(Strong acid),强碱(Strong base)和高温物品损坏台面，在 整个实验过程中，必须时刻注意安全，以免发生意外。学生实验中损坏的实验器皿(Experimental containers)应折价赔偿。五、实验报告的书写格式 实验名称(Name of the experiment) 实验 H 的(Purpose of the experiment)实验原

5、理(Experimental principle)实验仪器(Experimental apparatus)实验试剂(Reagents)伉)操作步骤(Steps)(-t)实验结果(Experiment results)(A)分析讨论(Analysis discussion)W 实验者及实验日期第一篇玻璃仪器(Glassware instrument)的洗涤和使用实验目的1 .练习和掌握玻璃仪器(Glassware instrument)的洗涤方法。2 .复习吸管(Sucker)的使用。讲解、示教玻璃仪器(Glassware instrument)的洗涤1.洗涤剂(Detergent)肥皂水，去污

6、剂(洗衣粉)为乳化剂，可降低油水之间的表面张力，使脂肪、蛋白质及其他污物溶解或脱落。常用 于敞口的器皿及酶学检查所用器皿的洗涤。堇铭酸钾(KChO,-H2sO,清洁液)配制：配制的方法：KzCmO7先溶于50ml水中，将500ml的H2sO,慢慢倒入KzCnCh溶液中洗涤 时，主要是KzCrO?和H2s起作用，反应式如下：K2Cr2O7+4H2SO4-K2SO4+Cr2(SO4)2 +4H?O+3所产生的3分子0,其氧化力很高，另外H2sO也能使很多物质溶解下来。 Na3Po4一般配成5%的Na3PCM碱性)，可清洗油污。乙二胺四乙酸二纳(EDTA-Na?)为一络合剂，可使玻璃器皿(Glass

7、ware)上的金属离子以络合物的形式脱离下来。一般配 成510%的浓度。盐酸酒精(Hydrochloric acidAlcohol)用于去除器皿上的染料，一般配成3%的浓度。其他硝酸：用于去除水银。王水：用于洗去所有金属盐。尿素：用于清洗蛋白质。实验中最常用的是、两种。2.玻璃仪器(Glassware instrument)的洗涤般玻璃仪器(Glassware instrument)如试管(Testtube)、烧杯(Beaker)、锥形瓶(Erlenmeyerflask)等容量要求不严格的器皿。 先用自来水洗刷至无污物，再选用大小合适的毛刷沾取洗衣粉或肥皂水，将器皿内外壁细心 刷洗，再用自来水

8、冲洗干净，洗至容器内壁光洁不挂水珠即可，最后用蒸播水冲洗23次， 放于清洗处待水滴干后，放入烤箱内(100125)烤干，停烤后不要立即打开烤箱门，防止温 差造成玻璃器皿(Glassware)的爆炸。 容量分析仪器(Capacity of the instruments)如吸量管(Pipette)、滴定管(Burette)。量瓶等。使用后立即浸泡于凉水，勿使物质干涸， 并及时用流水冲洗干净，然后再用重铝酸钾(Potassium Dichromate)清洗液浸泡数小时， 用自来水反复冲洗干净，最后用蒸储水冲洗23次，凉干或放入37C孵箱中干燥(移液 管(One-mark pipette)、容量瓶(

9、Measuring flask)及结构复杂的器皿严禁烤干)。沉降管沉降管使用后应用吸管逐管冲洗，然后每管内加入清洁液(不要有气泡)，24小时后逐管吸出清 洁液，放回清洁槽(或瓶)内，再用自来水、蒸储水冲洗沉降管，甩干水份，放入烤箱内烤干。吸管的种类和使用：1 .种类(1)移液管(大肚吸管)(One-mark pipette)属单标吸管，放液时管尖的残余液体不得吹出。(2)奥氏吸量管属单标吸管，放液时管尖的残余液体必须吹出至容器内。(3)多刻度吸量管普通吸量管：直筒状，有多种不同规格，刻度方法有自上而下和自下而上两种，每 种刻度法又有刻度到尖端和刻度不到尖端两种。刻度到尖端者，使用时必须把管尖残

10、留液体 吹入容器内(一般注有“吹”字)，刻度不到尖端者，管尖残留液体不要吹出。当液体不再流出时, 应将管尖在容器内壁上停1530分秒，同时转动吸量管。莫氏吸量管：总量刻度在尖端以上，放液体时按刻度进行。2 .吸量管的使用(复习)离心机(Centrifuge)的使用(复习)1 .离心机(Centrifuge)的种类。2 .离心机(Centrifbge)的使用方法。3 .离心机(Centrifuge)使用的注意事项。第二篇血型检验(Blood test)一、新鲜血液红细胞血型测定(Determination of blood type fresh blood )(-)ABO血型测定(The tes

11、t of ABO blood group)实验目的 掌握ABO血型(ABO blood group)测定方法。掌握红细胞混悬液(Erythrocyte suspensions)的制备方法。熟悉红细胞凝集现象(Erythrocyte agglutination),能根据实验结果准确判定血型 (Blood group) o实验原理正常人类红细胞表面含彳/ABO型抗原(ABO antigens),而血清(Serum)中含有其相应的抗 体(Antibody)。采用标准抗A、抗B血清和标准A型、B型红细胞来与待测的血液红细胞或 血清(Serum)作用，观察是否有凝集反应(Agglutination)出现

12、，而判断血型(Blood group)。用标准抗血清检验红细胞的抗原(Antigen)为正定型。用标准A型和B型红细胞检测血清中的抗体为反定型。在实际工作中将两者结果相互对 照以便获得准确的结果。实验仪器白瓷板、试管(Test tube)、试管架(Test tube holder)、离心机(Centrifuge)、显微镜、刺 血针、消毒用品、滴管、玻璃铅笔、天平(Balance)。实验试剂1 .标准抗A及抗B血清。2 .生理盐水。操作方法3 .红细胞混悬液(Erythrocyte suspensions)的制备取生理盐水约2ml放入小试管内。(2)用酒精(Alcohol)棉球消毒手指，待酒精(

13、Alcohol)蒸发干后，用消毒针头刺入适当深 度，即有血液流出，然后用滴管取3滴血放入装有生理盐水的试管内，混匀。 在天平上配平，即另取一小试管盛水，作平衡管。在天平上平衡。然后把试管放入离心 机中相对应的位置上，以2000rpm的速度离心一分钟弃去上清液，这样反复洗涤三次后。弃去 上清液。(4)取1滴压积红细胞(Hematocrit red blood cells),加49滴生理盐水，配成2%的红细胞 混悬液(Erythrocyte suspensions),或取 1 滴压积红细胞(Hematocrit red blood cells),加99 滴生理盐水，配成1 %的红细胞混悬液(Ery

14、throcyte suspensions)4 .ABO 型血型(ABO blood group)正定型凝集原测定(Agglutination of theoriginal determination)A.试管法(Tube method)(1)取二支试管分别标明“A”、“B”。 按标记分别加入抗A、抗B血清各1滴。(3)分别加入2%的被测红细胞悬液(Erythrocyte suspensions)1滴。(4)混匀，以lOOOrpm的速度离心1分钟。 轻摇试管，使管底沉降的红细胞悬浮，观察并记录结果。如阴性结果室温中静置30 分钟，再离心观察结果。B.玻片法(Slide method)(1)在玻片

15、两端分别标明“A”、B”字样。 按标记分别加标准抗A、抗B血清各一滴。(3)各加滴被检2%红细胞悬液(Erythrocyte suspensions)- -滴。(4)室温下应左右旋转玻片，使之混匀：静置15分钟后，转动玻片观察结果，必要时可 用显微镜核对。C.结果判定出现凝集块者为阳性；反之不出现凝集块则为阴性。凝集强弱的标准：+呈一个大凝集块，无游离的红细胞，背景清亮。+凝集块稍小，有小量游离红细胞，背景仍较清亮。+凝集块更小，有1/2的游离红细胞，背景较红。+凝集块呈细小沙粒状，游离红细胞更多，背景红。ABO血型结果判定正定型抗 A抗 B血型判定0+A+B+AB5 .AB0血型反定型一一凝

16、集素的测定试管法(Tube method)1 .取二支试管，分别标明“A”、“B”。2 .分别加入2滴被测的人血清。3 .加1滴2% A型标准红细胞于A管中，力U1滴2% B型标准红细胞于B管中。4 .混匀，以1000转/分的速度离心1分钟。5 .轻摇，观察结果。结果判定ABO血型判定一一反定型A 型 RBCB 型 RBC血型判定+0+A+BAB注意事项阴性结果可在室温中静置30分钟，离心观察结果。 一般不用玻片法作ABO反定型，因为血清中的抗A、抗B抗体与标记红细胞作用, 若不经离心，难以形成肉眼可见的凝集反应。MN血型测定实验原理正常人类红细胞表面含有MN血型系统的抗原，用免疫制得的抗M,

17、抗N血清与待测血 液的红细胞作用，观察是否有凝集反应由现而判断血型。实验仪器同ABO型测定。实验试剂1 .标准抗M,抗N血清。2 .生理盐水。操作方法1 .试管法(Tube method)(1)取二支试管，分别标明“M”、“N”。按标记，分别将抗M和抗N血清各一滴加入“M”和“N”管中。(3)在两管中各加2%被测红细胞混悬液(Erythrocyte suspensions滴。混匀后以1000 转/分离心1分钟。(4)离心后，轻轻摇动，观察结果。2 .玻片法取一凹玻板，分别在两端标明“M”和“N”孔。 在两端各加抗M、抗N血清2滴。于“M、N”孔中分别加入1 %被检红细胞混悬液(Erythroc

18、yte suspensions/滴。左右旋转混匀，置室温(Room temperature)下10分钟内观察结果。3 .结果判定抗 M抗 N血型判定+M+N+MN Rh血型测定(Determination of Rh blood group) 实验原理Rh血型抗体(Rh blood group antibodies)多是不完全抗体(Incomplete antibody).用不 完全抗体(Incomplete antibody)来检测Rh 血型抗原(Rh blood group antigens)由于IgG分子 量小，在生理盐水介质中不能使相应的RBC直接发生可见的凝集反应(Agglutina

19、tion),只能 使具有相应抗原的RBC致敏。因此，需要用清蛋白试验，酶法(Enzymatic)或抗人球蛋白试验 (coombs test)进行测定，实验原理分述如下：清蛋白试验(Albumintest)的原理：清蛋白能提高介质的介电常数，使动电位减少，即降 低电动势。从而使红细胞易于靠拢而促使RBC在抗体的作用下发生可见的凝集反应。酶法(Enzymatic)的原理：由于红细胞膜表面涎酸的竣基(-C00H)族电离后，使红细胞表 面带上负电荷，从而使RBC不易与不完全抗体(Incomplete antibody)发生凝集反应 (Agglutination)若用蛋白水解随Protease(如无花果

20、酶，番木瓜酶。菠萝蛋白酶。胰蛋白酶 或神经氨酸酶等)处理RBC,使红细胞膜上的涎酸残其释放，则RBC表面的负电荷减少，动 电位也减少。从而缩短了红细胞的间距，使红细胞能与不完全抗体发生可见的凝集反应。抗人球蛋白试验(coombstest)的原理：由于血型抗体本身是球蛋白，具有抗原性，它可 以作为抗原来免疫动物而使之产生抗人球蛋白抗体(Anti-human globulin antibodies),在 已被抗体完全致敏的红细胞中再加入抗人球蛋白抗体(Anti-human globulin antibodies)后， 抗人球蛋白抗体(Anti-human globulin antibodies)即

21、与吸附于RBC上的不完全抗体 (Incomplete antibody)发生抗原抗体反应，尤如起一种搭桥的作用，使致敏的红细胞出现可 见的凝集反应。实验仪器离心机、显微镜、试管、试管架、记号笔、天平、37恒温水箱。实验试剂1 .标准抗D、抗E、抗C、抗e、抗c血清。2 .抗人球蛋白(Coombs)血清。3.1 % 菠萝蛋白酶液(The pineapple proteinase liquid)4.30%清蛋白液。5.生理盐水。操作方法1 .清蛋白试验(Albumin test) 取五只试管，分别标记上D、C、c、E、e字样，按标记分别加相应的抗D,抗 C ,抗c,抗E,抗e,血清各2滴。每管各加

22、待测血红细胞悬液(Erythrocyte suspensions)1滴。混匀后，以lOOOrpm,离心1,观察是否出现凝集反应。未出现凝集反应者，则每管各加2滴30%清蛋白，混匀，再次以lOOOrpm离心1分钟。 取出试管，轻摇，观察并记录结果，出现凝集现象者为阳性反应。根据试验结果判断出被测血之Rh血型。2 .酶法 取五只试管，分别标记上D、C、c、E、e按标记分别加相应的抗D、抗C、 抗c、抗E、抗e血清各2滴。每管各加待测血红细胞悬液(Erythrocyte suspensions”滴。混匀后，立即离心lOOOrpml分钟，观察并记录结果。未出现凝集反应者，则每管各加配好的1 %菠萝蛋白

23、酶液一滴，混匀后，置37C恒温 水箱内放30分钟. 取出试管，以lOOOrpm离心1分钟，观察并记录结果。出现凝集现象为阳性反应。阳 性结果表明被测红细胞上含有与抗体相应的抗原。3 .抗人球蛋白试管(Coombs test) 取五只试管，分别标记上D、C、c、E、e o按标记分别加相应的抗D、抗C、 抗c、抗E、抗e血清各2滴。各管再加入一滴待测的红细胞悬液(Erythrocyte suspensions). 混匀。以lOOOrmp离心1分钟观察有无凝集反应。未出现凝集反应，则将试管置37c水箱内放30分钟. 再以lOOOrpm离心1分钟，观察有无凝集。无凝集者，则用盐水将试管内的红细胞离心洗

24、涤3次。尽量弃去上清液，目的在于去 除尚未结合在红细胞上的不完全抗体。各管加入抗人球蛋白2滴，混匀以lOOOrpm离心1分钟，轻摇试管，观察并记录结果， 出现凝集者为阳性反应。阳性结果表明被测红细胞上含有与抗体相应的抗原。二、唾液分泌状态测定实验目的学习和掌握和用中和试验(凝集抑制试验)测定唾液分泌状态的实验原理和操作方法。实验原理分泌型(Secrete type)人的唾液中含有与其红细胞ABO血型一致的水溶性血型物质。HAB血型物质能特异地与标准抗血清中相应的抗体结合，一旦抗体被结合后，该血清就不能 再使相应的红细胞发生凝集，将唾液与标准抗血清作用后，再加入相应的指示红细胞，然后 观察红细胞

25、是否出现凝集反应，从而判断被检者的分泌状态及ABO血型。如所加指示红细胞 不出现凝集，则为中和试验阳性，说明被检者为分泌型，如加入指示红细胞后，仍出现凝集, 则为中和试验阴性，被检者为非分泌型。实验仪器试管、试管架、滴管、记号笔、离心机、烧杯。实验试剂1 .标准抗一 A、抗一 B血清和抗一 H试剂。2 .已知2% A型、B型、0型红细胞生理盐水悬液。3 .生理盐水。4 .待测的唾液标本。操作方法1 .抗血清(Serum resistance)的标定(1)取24只康氏试管，分为三排，每排8只，分别标记上A、B、H,每管加2滴生理盐 水，按标记分别将2滴抗一 A、抗一 B血清及抗一 H试剂加入每排

26、第一管中，作2倍数系 列稀释，最后一管弃去2滴，其稀释倍数为1:256。 每管加1滴相应的指示红细胞混悬液(Erythrocyte suspensions)混匀，A、B、H三 排放入离心机，以lOOOrpm离心1分钟，观察结果，记录抗血清效价。以凝集反应强度为+的最后一管的倍数稀释抗血清，此稀释液与相应指示红细胞发 生的凝集反应为说明抗血清的标定和稀释是正确的，这样方可用于作中和试验。2 .唾液的采集和处理(1)唾液的采集：先嘱被检者嗽口后，使其流涎入大口玻璃瓶内，收集2-5ml,如要采 集婴儿或幼儿唾液，可叫其喝水后，以棉球擦其口腔底部，直至被唾液湿透，然后将湿棉花 的唾液挤出，用同一棉球反

27、复几次，便可取得足量。唾液的处理：唾液收集好后，立即在沸水中煮10分钟，使唾液中的血型分解酶灭活 然后离心10分钟，1500rpm,取上清液备用。3 .中和试验(Neutralization test)(1)唾液的稀释取30只试管，分为三排，每排10只，分别标记上A、B和H与1-10的序号，用生理盐水 将待测唾标本作2-4倍数系列稀释，共稀释三排，每排的稀释倍数为1:21:1024。(2)中和A排每管分别加2滴稀释好的抗一 A血清。B排每管分别加2滴稀释好的抗一 B血清。H排每管分别加2滴稀释好的抗一 H试剂。室温下放置30分钟，使唾液中所含的血型物质充分中和血清中的相应抗体。加指示红细胞A排

28、各管加1滴2% A型红细胞悬液，混匀。B排各管加1滴2% B型红细胞悬液，混匀。H排各管加1滴2% O型红细胞悬液，混匀。A、B、H、三排加入指示红细胞后，放到离心机上离心，lOOOrpm离心1分钟，读结果。(4)结果判断不出现凝集反应者为中和试验阳性，被连续抑制3管以上者，可确定唾液中含有相应抗原。唾液稀 释倍数2481632641282565121024结果判定A-+-H-BH+-H-H-+-H-+4-H- +-H-+-H4-I-H-H-4-H-A分泌型A B-H-H-H-H-4-H-+-H-+-H-+-H-十-HH-+-H-H-B分泌型H-+-HH-4-H-A BH-H-H-卜+-H-H

29、-H-H-+-F-H-l-+-HH-+-H-+-H-H-4-H-+-H-+-H-+-H-+-H-H-O分泌型A+-H-B+AB分泌H-+-+-H-型三、人类白细胞抗原(HLA)的分型(HLA、A、B)位点实验原理用微量淋巴细胞毒试验法(Trace lymphocytes poisoning experiment method|)。被检活淋巴细胞膜上的HLA抗原遇相应的HLA抗体可与之相结合(致敏)，在补体存在的 情况下，可以破坏细胞膜。经过染色，使染料进入细胞而着色。在镜下计算着色细胞百分数, 达一定标准以上，认为是阳性反应(存在相应的抗原)。实验器材大试管、小试管、小量筒、特制小玻璃套管、注

30、射器、重复微量加样器、微量淋巴细胞 毒反应板。白细胞计数盘、显微镜、离心机、毛细吸管。实验试剂(1) 肝素钠抗凝液(Heparin sodium anticoagulation liquid)肝素钠用生理盐水溶解，使每毫升液体含肝素钠200单位，经9磅15分钟的高压消毒，冰 箱保存备用。PBS原液氯化钠216克，磷酸二氢钠6克、氯化钾7克、磷酸氢二钠(2分子水)32.6克(若用1分子水的 则用65.5克)。蒸储水加至1000ml,经9磅15分钟高压消毒，冰箱保存备用。使用稀释液取原液40m1,加蒸锵水至1000ml。(3)淋巴细胞分离液(The lymphocyte separation fl

31、uid)有市售比重为L0770.002(18)的淋巴细胞分离液，也可用以下药品配制：泛影酸5.77g、 葡甲胺183g,加蒸馀水至1000ml,调PH至7.07.2。菲可很icoll水溶性聚蔗糖)9g,加蒸储水溶解，调比重至1.020(20)。取1体积泛影酸、葡甲胺液加2.4体积菲可液，调比重至1.077(18),经高压消毒后保存冰 箱备用。(4)淋巴细胞保养液(Lymphocyte maintains fluid)10.5gRPMI1640(小行血清培养基)加双储水至1000ml,分装后保存于-20C。(5)白细胞计数稀释液(Dilutions WBC count)1.5%醋酸溶液(含少许甲

32、紫)。(6) 5%曙红田0$亩)水溶液(7)中性Formalin液，0.5%酸红0.4ml加入福尔马林100ml中(8)补体6支以上兔新鲜血清，应无天然淋巴细胞毒，且补体活性良好。(9) HLA分型标准血清盘(10)抗淋巴细胞血清(Antilymphocyte serum)用人淋巴细胞免疫兔制得。(1D石蜡油(医用)淋巴细胞的准备(Lymphocytes of preparation)(1)抗凝血的制备：取一试管盛大1.5ml肝素抗凝液，抽取被检查者静脉血液3ml,加入 抗凝剂中，轻轻倒置试管，使其混匀。加等量的PBS稀释抗凝血。(3)取二试管，每管装2ml与抗凝血比例为1:1.5的淋巴细胞分

33、离液，将试管微倾斜，把稀 释了的抗凝血小心地加于液面上(注意不要与分离液混合)。放入不平式离心机离心(1800转/ 分)20分钟(20)但注意在启动及关机时动作避免粗暴。(4)离心后，血液成份被分成数层，如下图。用毛细吸管把血浆及血小板层液体吸出弃 去。小心地把淋巴细胞层(呈白色)混浊)吸至另一盛有数毫升PBS或淋巴细胞保养液的试管中 (吸出时注意不要吸取棕多的分离液，因它含有单核细胞，其比例过大时会干扰试验结果。混匀后，作第二次离心(1200转/分)离心10分钟后，弃去上清液，轻摇试管使细胞悬 浮，再加入适量的PBS或保养液，混匀后作第三次离心，(900转/分)，离心8分钟，小心地把 上清液

34、弃去后，加适量的(0.2ml)淋巴细胞保养液(Lymphocyte maintains fluid),并使细胞混 匀。(6)淋巴细胞计数：取白细胞计数稀释液0.78ml于小试管内，加入淋巴细胞液0.02ml, 混匀后，吸出少量滴入血细胞计数盘内。静置1-2分钟后，于低倍镜下计算计数盘上下左右 四大格中淋巴细胞数，按下列公式计算：NX 100=细胞数/I微升N=四大格细胞总数根据细胞数的量，用保养液调至每微升含淋巴细胞2000个。把此细胞悬液保存于4冰箱 中备用。HLA抗血清反应板的准备(HLA resistance of serum reaction plate preparations)微量

35、淋巴细胞毒试验反应板一块(具72个凹孔，在两边上铸记有标记，如图，并附有 盖玻片和板盖各一块)。ABCDE1OOOOOO2OOOOOO3OOOOOO4OOOOOO5OOOOOO6OOOOOO70OOOOO80OOOOO90OOOOO10OO0OOO11OO0OOO12OO0OOO图二在反应板上每个凹孔中加石腊1小滴。根据需要用微量加样器将抗HLA血清加入反应板(1A1B凹除外)的各凹孔中，每凹加 抗血清1微升。1A孔加入1微升与手中已知HLA型标准淋细胞相对应的抗淋巴细胞血清作阳性 反应对照孔，1B孔加入1微升PBS或保养液作阴性对照孔。(反应板中各抗血清的种类附表于 后)。微量淋巴细胞毒试验

36、(Trace lymphocytes poisoning experiment)(1)取血清反应板一块(制备过程见上项)。（2）用微量重复加样器把分离计数好淋巴细胞悬液按顺序（1A-lFf2Ff2Af3A3F f）加入反应板的每凹中。每凹加入1微升（含淋巴细胞2000个），要注意加入凹孔血清中。 在室温（20-25）入置30分钟，让细胞与抗血清充分作用。于反应板的各凹加入补体（兔血清）5微升，放置1小时（2025。（4）于反应板的各凹内分别加入5%曙红3毫升，3分钟后，再加入中性甲醛（新配）5毫升（中 性甲醛使反应终止并起固定的作用）。盖上盖玻片，加上盖板，静止2小时，使细胞集于凹底，便于观察

37、（制成的板，在1一2 周内观察，结果不变）。（6）结果判定：将反应板放在显微镜的载物台上，对好凹孔，每凹孔底部的全部细胞能 在一低倍（10X10）视野内观察到。观察次序与加样顺序相同，记录结果（见附表）。根据凹内死 亡与活的细胞比例，判定阳性或阴性。死活细胞的区别：电光源显微镜观察。死细胞呈浅红色，体积大。不折光，平坦，边界模糊。活细胞呈小球状，有强折光，发亮，体积正常，不染色。观察时转动细调旋钮，死活细胞易于区分。倒置相差显微镜观察：死细胞呈煤球状，灰黑色，体积略大而扁平。活细胞呈环状一圈或呈指环状，红亮。根据细胞死亡的百分数，要用记分法来判定结果：死亡细胞的百分数记分结果判定0-101阴

38、性11-202阴性可疑21-404弱阴性41-806阳 性81-100注意事项8强阳性 抗血清：选择效价高的，交叉反应少，无脂肪及杂质的抗血清，否则会干扰结果。补体：要选择无天然细胞毒性作用，补体活性好的,一般要将多只兔血清混匀后使用。试验的反应时间：可视抗体及补体的情况而增减，加有许多抗血清的反应与反应时 间有很大关系，如反应时间过长，则会出现交叉反映，时间恰好，则显示其特异性有特点或 交叉反应减至最低程度，不会出现干扰。如反应时间过短，弱抗体的作用显示不出来，阳性 变为阴性。（4）反应的温度：整个操作过程均应于2025下进行。高于25,则淋巴细胞易死亡, 低于15C时因抗血清中的冷抗体干扰

39、结果，出现阳性。淋巴细胞的纯度及数量：单核细胞的污染率高时易致假阳性。血小板数过大时，会 大量吸附抗体出现假阴性。红细胞污染时会增加活细胞数量（低倍镜下无法区分）。同时会吸附 补体使其活性下降。细胞数量的统一标准为10002000个/微升。细胞悬液中死细胞不能超过10%。(6)中性甲醛的PH要准确，量也要够，否则会增加死细胞的数量。加样时尽量不要把前一凹的材料带至后凹去，更不应漏加，否则结果不准确。附表：表中提到的抗血清是根据现有的数量而设计安排的，在不同凹孔中的相同的抗血 清是来自不同的人或不同批量的血清。检测结果，被检测人是Al、AU、B8、B17 0管号抗血清种类结果管号抗血清种类结果管

40、号抗血清种类结果1A阳性对照85AA28+AW3319AB5+18+ BW351B阴性对照1BAW331BB5+18+BW351CA18CAW331CBW351DA18DB71DB88EA18EB71EB88FA21FB7+401FB1212FA216FB7+40110FB121EA21EB7+401EB121DA2+A281DB7+401DB151CA2+A281CB13+401CB151BA2+A281BB13+401BB151AAll8AB13+401AB513AAll87AB13+40111ABW161BAll8BB131BBW161CA11+A38CB131CBW161DA11+A3

41、8DBW601DB178EA31EBW601EB178FA31FBW601FB17+B584FA918FB5112FB51EA91EB51EB271DA91DB51DBW221CA101CB7+271CBW221BA101BB7+BW351BBW221AAW30+311AB7+BW351ABW221四、血清型(Serotype)的电泳检测结合珠蛋白(Hp)表现型的测定园盘电泳法实验目的掌握电泳(Electrophoresis)的概念、基本原理以及分类。掌握HP表现型测定的原理，基本操作步骤，结果测定。(3)学会使用园盘电泳槽(Electrophoresis chamber)=了解配制凝胶(je

42、lly)的方法。电泳的理论基础：概念：生物大分子(蛋白质、核酸、多糖等)在一定的离子强度和电场的强度下，沿着与其 所带电荷相反的方向泳动的过程。其迁移率与分子量大小、所带电荷多少、PH值等等有关。 分类：(1)按照电泳槽形式：分水平电泳和垂直电泳(2)按照电泳原理分：移动界面电泳、区带电泳和稳态电泳(3)按照电泳系统均性：连续电泳和不连续电泳(4)按照电泳凝胶中是否加入变性剂：变性电泳和非变性电泳 电泳操作流程： 样品的制备、*电泳染色结果的判断、力口样 制胶一 实验原理利用聚丙烯胺凝胶作电泳支持物，带有电荷和分子大小不一的蛋白通过浓缩效应、电荷 效应、分子筛效应而被精细分离，可将血清分为12

43、25个组分，结合珠旦白具有特殊的分带。 HP Hb复合物各电泳区带可用显色剂联苯胺(或邻联茴香胺)显示，读出其表现型。实验仪器电泳仪、园盘电泳槽、凝胶管、凝胶管架、腰穿针、微量进样器(20ul)、滴管烧杯(25ml、 50ml)、刻度吸管(2ml、10ml)、洗耳球。实验试剂(1)23.3%丙烯酰胺溶液(23.3%单体母液)丙烯酰胺22.8g-加蒸储水至100ml(或Cyanogm 23.3g加蒸储水至100ml)亚甲基双丙烯酰胺0.5g(2)凝胶缓冲液PH=8.8三羟甲基氨基甲烷(Tris)0.057g。乙二胺四乙酸(EDTA)1.17g。10%过硫酸胺(APS)50mg APS加蒸储水至5ml。(4) 5%蔗糖液电极缓冲液：硼酸缓冲母液PH=9硼酸2.45g、硼砂15.25g、加储水至500mL临用时，取母液90ml,加蒸储水至1440ml或取母液18ml,加蒸储水至288ml。(6)配联苯胺用醋酸缓冲液PH=4.5无水醋酸钠16.48加蒸储水至1000ml冰醋